龙眼GDSL酯酶/脂肪酶基因的全基因组鉴定及表达分析

基于第三代龙眼基因组数据库及其转录组数据库,通过生物信息学分析对龙眼GDSL酯酶/脂肪酶家族进行全基因组鉴定。结果显示龙眼GDSL(Dl GDSL)家族共有118个成员,分为15个亚家族,亚细胞定位显示主要分布于细胞外基质中。染色体位置及共线性基因分析表明,118个Dl GDSL基因中有111个定位在15条龙眼染色体上,包括13对共线性基因。基因结构和蛋白质保守基序分析表明该家族的外显子在2～12之间,且motif2和motif3是Dl GDSL家族中尤为重要的保守基序。启动子顺式作用元件分析表明,启动子序列中包含众多光响应、激素应答、无氧诱导、胁迫响应和昼夜节律等响应元件,且大部分成员都含有茉莉酸甲酯(Me JA)、脱落酸(ABA)、生长素(IAA)和赤霉素(GA)等激素应答作用元件。FPKM值分析发现从胚性愈伤组织到球形胚阶段有26个差异表达的基因,提示Dl GDSL家族部分成员可能在龙眼体胚形态建成中发挥重要作用。q RT-PCR分析表明,在外源ABA和Me JA处理下龙眼胚性愈伤组织中,Dl GDSL家族部分成员可能与ABA、Me JA等激素信号转导相关。     

龙眼胚性愈伤组织AGO10基因克隆及其表达分析

【目的】探究龙眼胚性愈伤组织Argonaute10(AGO10)基因的特性与龙眼生长发育、激素响应及非生物胁迫响应之间的关系。【方法】根据龙眼胚性愈伤组织转录组数据库Unigene序列,采用RT-PCR结合RACE技术,以‘红核子’龙眼胚性愈伤组织cDNA为模板,进行龙眼胚性愈伤组织DlAGO10基因的克隆和生物信息学分析,同时利用qRTPCR技术分析DlAGO10基因在龙眼体胚发生过程中、不同组织部位中、对不同激素的响应以及非生物胁迫响应的表达情况。【结果】获得龙眼DlAGO10基因的c DNA全长序列(GeneBank登录号为MH708535),全长共3 859 bp,其中包含完整开放阅读框(ORF)3 003 bp,编码999个氨基酸。生物信息学分析表明,DlAGO10的保守结构域具有AGO的经典结构域PiWi结构,与甜橙和克莱门柚AGO10蛋白同源性较高。qPCR分析结果表明,在龙眼体胚发生过程中,DlAGO10在龙眼非胚性愈伤组织时期和子叶胚时期的表达量较高,在‘红核子’龙眼合子胚S5阶段的相对表达量最高;不同组织部位的表达情况为,DlAGO10在‘红核子’龙眼雌花中表达量最高,雄花次之,其他组织部位表达量均较低。植物激素和非生物胁迫处理下的表达分析表明,一定浓度的2,4-D、KT和水杨酸(SA)均可诱导DlAGO10上调表达,而茉莉酸甲酯(MeJA)即可上调也可下调;盐、渗透、干旱和脱落酸(ABA)胁迫均可上调DlAGO10的表达。【结论】DlAGO10可能参与龙眼体胚发生早期和晚期的转录调控过程,且可能参与生长素、细胞分裂素、SA和ABA的逆境胁迫信号转导途径,调控龙眼多种非生物胁迫应答过程。     

龙眼胚性愈伤组织DlCK2-α基因克隆、亚细胞定位及其表达特性分析

【目的】克隆龙眼DlCK2-α基因,并对其表达特性进行分析。【方法】该试验通过RACE技术对DlCK2-α进行克隆,并在此基础上进行生物信息学分析和亚细胞定位以及蛋白质结构和功能的预测。对调控DlCK2-α的miRNA及顺式作用元件进行预测,并进行亚细胞定位观察。采用QRT-PCR技术对其在龙眼体胚不同阶段胚性培养物和不同光质的表达特性进行研究。【结果】DlCK2-α基因含有开放阅读框1 002 bp,共编码333个氨基酸(GenBank登录号:MG181952);DlCK2-α属亲水性蛋白,不含有信号肽和跨膜结构域,但是含有一个典型的STKc_CK2_alpha保守结构域,预测含有32个磷酸化位点;miRNA预测结果显示,共有miR2615a等10条miRNA可能调控DlCK2-α;顺式作用元件预测显示多个光响应与应激响应元件可能调控DlCK2-α;GFP荧光定位观察显示其定位于细胞质。QRT-PCR结果显示,DlCK2-α在黑暗条件下的表达量高于光处理下的表达量。在体胚不同发育阶段,DlCK2-α在不完全胚性紧实结构中的表达量最低,球形胚中表达量最高,整体呈先降后升趋势。【结论】DlCK2-α基因在龙眼光信号转导和体胚发育调控中发挥重要作用。     

龙眼TMK基因家族成员的全基因组鉴定及表达分析

【目的】更全面地解析龙眼TMK(DlTMK)基因家族的生物学特性及其在龙眼体胚发生早期及不同激素处理下的表达模式。【方法】利用多种生物信息学分析软件预测DlTMK基因家族成员编码的蛋白基本理化性质、染色体定位、系统进化树、基因结构、启动子顺式作用元件等,并采用实时荧光定量PCR((quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术检测DlTMK在龙眼体胚发生早期3个阶段及在不同激素处理下的表达模式。【结果】共筛选出6个DlTMK基因家族成员,其编码的蛋白质均为具有跨膜结构不具有信号肽的亲水性蛋白,主要定位在质膜、细胞质和细胞核上。染色体定位结果显示,DlTMK基因家族存在串联重复序列。DlTMK基因家族在进化方式上与拟南芥、杨树相近。启动子顺式作用元件分析表明,DlTMK基因家族成员启动子中含有多种激素响应、逆境响应及光响应元件。qRT-PCR结果显示,DlTMK基因家族大多数成员在龙眼体胚发生早期各阶段的表达量变化趋势与转录组分析结果基本一致,但不同成员的表达模式存在差异,并且DlTMK基因家族各成员均响应生长素(auxin,IAA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)及赤霉素(gibberellic acid,GA3)。【结论】DlTMK基因家族在进化上具有高度保守性,参与多种激素应答,通过推测发现可能以磷酸化的方式参与激素信号传递,调控龙眼体胚发育。     

龙眼HDAC家族成员的全基因组鉴定及表达分析

【目的】研究龙眼HDAC家族的进化特性及其在体胚发生过程及不同激素处理下的表达模式。【方法】对龙眼HDAC(DlHDAC)家族成员进行全基因组鉴定及生物信息学分析,结合转录组数据分析DlHDAC家族在龙眼非胚性及胚性培养物及不同组织器官中的表达情况,采用qRT-PCR检测龙眼体胚发生过程及不同激素处理下DlHDAC家族的表达模式。【结果】DlHDAC家族可分为RPD3/HDA1、HD2和SIR2亚家族,均为亲水性蛋白质,亚细胞定位显示主要分布于细胞核中。RPD3/HDA1亚家族含有HDAC结构域,HD2亚家族含有C2H2型锌指和Nucleoplasmin结构域,SIR2亚家族含有SIR2结构域。RPD3/HDA1和SIR2亚家族蛋白结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,HD2亚家族以无规则卷曲为主。DlHDAC启动子序列中包含众多光响应、激素应答、胁迫响应及与植物生长相关作用元件;转录组数据显示DlHDAC家族大部分成员在ICpEC和GE阶段高表达;且在龙眼果实,种子及根中高表达。qPCR分析显示,DlHDA6、DlSRT1-1、DlHDT1和DlHDT3在GE阶段上调表达;在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、赤霉素(GA3)和水杨酸(SA)处理下DlHDA8、DlHDA9、lSRT1-1、DlSRT2、DlHDT1和DlHDT3均被不同程度地诱导表达。【结论】DlHDAC在进化过程中保守性与特异性并存,可能参与龙眼果实、种子及根的生长发育过程,并通过响应ABA、SA和GA3的表达来调控龙眼体胚发生。     

龙眼miR397家族成员分子特性及其在体胚发生早期的表达分析

【目的】探讨龙眼miR397家族成员的分子特性及其在龙眼体胚发生早期的表达模式。【方法】以‘红核子’龙眼胚性愈伤组织为材料,通过对龙眼miR397前体序列二级结构分析、进化树构建、靶基因预测与裂解位点验证、以及龙眼miR397a在龙眼体胚发育早期和不同激素浓度处理下的表达规律进行分析。【结果】龙眼miR397前体序列5端臂上可生成两个序列高度重合的成熟体序列dlo-miR397a和dlo-miR397,二者仅有5端两个碱基TC之间的差异,前体能形成稳定的茎环结构;进化树分析发现龙眼miR397前体与桃、可可、脐橙等亲缘关系较近,处于同一分支,龙眼miR397与拟南芥、甜橙、葡萄等亲缘关系较近,处于较为保守的同一分支,miR397家族成员较前体序列在进化上更为保守。靶基因预测表明龙眼miR397家族主要靶向调控漆酶基因家族和一条姐妹染色单体粘连蛋白(dlo_039206.1)。裂解位点验证发现靶基因姐妹染色单体粘连蛋白的裂解位点,但位于预测区间外。miR397a在体胚发生过程中对于靶基因姐妹染色单体粘连蛋白的调控模式在0～3 d较为一致,均为下调表达,6～12 d为显著上调表达,且二者呈典型的负调控关系。龙眼miR397a在不同浓度2,4-D与GA3激素处理下均出现下调表达趋势,而靶基因姐妹染色单体粘连蛋白则在激素处理下的表达趋势并不明显,可能由于靶向裂解位点在预测区外所致。【结论】龙眼miR397a可能在龙眼体胚发生早期的6～12 d,通过靶向调控姐妹染色单体粘连蛋白影响龙眼体胚发生早期形态建成。龙眼miR397家族在进化上较为保守,其靶基因主要靶向调控龙眼漆酶家族和姐妹染色单体粘连蛋白。龙眼miR397a在不同浓度2,4-D与GA3激素处理下均出现下调表达趋势,表明其在龙眼体胚发生早期可能通过激素信号传导参与龙眼体胚发生早期形态建成。     

龙眼DRB家族全基因组鉴定及其表达分析

为了解龙眼中双链RNA结合蛋白家族(DRB)的潜在功能,采用生物信息学方法鉴定龙眼DRB基因家族成员,并分析其在龙眼体胚发生早期、不同组织部位和外源脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯处理下的表达模式。结果显示:龙眼DRB家族的8个成员分布在5个亚组中,并且都具有2～3个双链RNA结合结构域,内含子数1～7;龙眼DRB家族含有6种motif;启动子中含有大量光响应元件、激素响应元件和逆境胁迫响应元件;龙眼DRB家族成员在体胚发生的各个阶段、各器官中均有表达,但表达量差异较大;外源脱落酸、水杨酸及茉莉酸甲酯处理显著抑制龙眼DRB家族成员的表达。本研究结果表明,龙眼DRB家族成员高度保守,该家族成员可能参与龙眼体胚及各器官各阶段的生长发育过程,且参与脱落酸、水杨酸及茉莉酸甲酯响应过程。     

龙眼DlLac7的克隆及其表达调控分析

【目的】探索漆酶(laccase)与龙眼生长发育及逆境胁迫响应之间的关系。【方法】根据龙眼胚性愈伤组织转录组数据库unigene序列,利用RT-PCR和RACE技术,以‘红核子’龙眼胚性愈伤组织的c DNA为模板,克隆laccase基因,并利用实时荧光定量PCR技术对其在龙眼体胚发生过程中、不同组织部位和逆境胁迫响应中的表达进行分析。【结果】获得龙眼漆酶laccase基因2个转录本Dl Lac7-a和Dl Lac7-b的c DNA全长序列(KM103385和KM103386)。Dl Lac7-a和Dl Lac7-b全长分别为2 121 bp和2 064 bp,包含相同的完整开放阅读框(ORF)1 713 bp,均编码570个氨基酸,2者仅3’非编码区(3’UTR)长度不同;该氨基酸序列与甜橙、毛果杨和葡萄等物种的laccase有较高的同源性。生物信息学分析表明,Dl Lac7的保守结构域具有漆酶的典型结构域特征。q PCR分析结果表明,在龙眼体胚发生过程中,Dl Lac7在鱼雷形胚时期的表达量最高,子叶胚阶段下调表达,其他阶段表达量平稳;Dl Lac7在龙眼成花中表达量最高,其次是花芽,在根中也有一定程度的表达,而在其他组织部位表达量较低。激素和非生物胁迫处理下的表达分析表明,水杨酸(SA)、低浓度茉莉酸甲酯(Me JA)、盐、渗透、干旱和脱落酸(ABA)胁迫等因素均可诱导Dl Lac7上调表达。【结论】Dl Lac7可能参与龙眼体胚发生中期的转录调控过程,且可能参与茉莉酸、SA和ABA的逆境胁迫信号转导途径,调控龙眼多种非生物胁迫应答过程。     

龙眼体胚发生早期miR166初级体的克隆与表达分析

为了解龙眼miR166初级体基因Pri-miR166 S53结构特点及其前体和成熟体在龙眼体胚发生早期的表达模式,采用SMART~(TM) RACE试剂盒和PCR扩增技术克隆龙眼体胚早期miR166基因的初级体(Pri-miR166 S53),确认其转录起始位点,并预测其含有的潜在ORF;利用龙眼基因组数据库提取其启动子序列,预测其含有的顺式作用元件;用实时荧光定量PCR对龙眼体胚发生早期及不同激素处理下的胚性愈伤组织中miR166基因的前体(Pre-miR166 S53)和成熟体(miR166a.2)表达模式进行分析。结果表明:获得长317 bp的Pri-miR166 S53基因初级体序列,对其进行翻译,得到一条长13个氨基酸序列的miPEP(MLCFVDALFLIST)。利用生物信息学软件分析Pri-miR166 S53基因的启动子序列发现,除了具有TATA/CAAT-box外,还含有生长素、脱落酸、乙烯、水杨酸、茉莉酸甲酯及spl、HSE等特异作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,在2,4-D调控的龙眼体胚发生早期过程中,从胚性松散型愈伤组织发育到球形胚的过程中,Pri-miR166 S53基因的前体pre-miR166 S53和成熟体miR166a.2都表现为下调趋势;而在无2,4-D调控的龙眼体胚发生早期中,pre-miR166 S53和miR166a.2表达模式不同。此外,pre-miR166S53随ABA和乙烯处理浓度升高呈下调表达,而对不同浓度2,4-D处理无应答;miR166a.2随2,4-D、ABA处理浓度升高呈下调表达,而在乙烯处理下呈上调表达。上述研究结果提示miR166前体和成熟体在对外源激素应答的模式上并不呈简单线性相关,可能存在多层次、多方位的调控。     

柑橘体细胞胚发生基因CsHB1特异肽段多克隆抗体的制备及其蛋白动态检测

【目的】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达系统,制备多克隆抗体,并检测抗体在‘伏令夏橙’胚性愈伤体胚诱导阶段中的特异性,为研究CsHB1基因在柑橘体细胞胚发生过程中的功能奠定基础。【方法】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N,转化大肠杆菌诱导目的融合蛋白的表达,并制备获得多克隆抗体anti-CsHB1-N。通过Western blot检测抗体在原核表达系统和柑橘体细胞胚诱导阶段的特异性,并分析体细胞胚诱导阶段CsHB1蛋白水平表达的动态变化。【结果】重组原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N在Escherichia coli中高效表达出了分子质量约为49 ku的GST-CsHB1-N融合蛋白,并纯化获得多克隆抗体anti-CsHB1-N;经过Western blot分析表明,多克隆抗体可与‘伏令夏橙’愈伤体胚诱导阶段表达的目的蛋白特异结合;蛋白表达结果分析表明,在胚性愈伤组织中CsHB1蛋白呈现高的表达量,随着诱导培养的进行,呈现了先下降后上升的波动变化。【结论】多克隆抗体特异性好,可与‘伏令夏橙’胚性愈伤组织中目的蛋白特异性结合,可用于CsHB1基因功能分析。     

miR171家族成员分子特性及miR171b调控靶标在龙眼体胚发生早期的表达分析

【目的】研究龙眼miR171家族的分子特性及miR171b调控靶标对GA3、2,4-D的响应和在龙眼体胚发生早期的表达模式。【方法】通过龙眼基因组和转录组数据库筛选得到龙眼miR171成熟体与前体序列,基于邻近法(neighborjoining,NJ)利用MEGA 7.0以及iTOL进行系统发育树的构建以及序列多重比较分析;psRNAtarget预测龙眼miR171家族靶基因,利用改良的RLM-RACE验证靶基因裂解位点;利用qPCR分析不同浓度2,4-D、GA3处理的龙眼胚性愈伤组织(EC)及龙眼体胚发生早期miR171b与其靶基因SCL6(Scarecrow-like)的表达模式。【结果】分子特性分析提示,龙眼miR171各成员之间的进化关系较远,进化来源复杂,进化速率具有差异性;靶基因预测显示miR171家族靶基因主要包括SCL6、SCL15、SCL27、转录剪切体X2和RNA依赖的RNA聚合酶1等;裂解位点验证表明miR171b可以靶向切割SCL6,同时SCL27具有结合位点之外的切割位点。在不同浓度2,4-D和GA3处理下,miR171b与SCL6的表达趋势基本呈现为负调控模式;随着2,4-D浓度的升高,miR171b的转录水平总体呈下调趋势,SCL6的表达量总体呈上调趋势;GA3的存在显著下调miR171b的转录水平,而SCL6的表达量分别在2.5和12.5 mg·L~(-1)GA3时达到最高值和最低值。龙眼早期体胚发生前期(0～6 d),miR171b与SCL6表达模式相似,龙眼早期体胚发生后期(6～12 d),miR171b显著下调,SCL6显著上调,提示大量积累的SCL6对龙眼球形胚(GE)形态建成具有重要作用,而miR171b通过减少转录产物的积累促进SCL6表达。【结论】miR171具有物种间的保守性以及成员间的差异性,同时miR171b及其靶标SCL6通过响应激素调节龙眼早期体胚发生的形态建成。     

甜樱桃PavMYC2基因克隆与表达分析北大核心CSCD

【目的】克隆甜樱桃PavMYC2基因并研究其表达模式,为深入研究其在花芽响应温度逆境中的功能奠定基础。【方法】从甜樱桃基因组数据库中获得PavMYC2基因的序列,对该基因进行生物信息学分析和亚细胞定位;通过qRT-PCR技术探究PavMYC2基因在甜樱桃不同组织及花芽各个时期的表达模式;运用双分子荧光互补实验(BiFC)检测其与PavJAZ蛋白的互作关系;结合前人转录组结果分析PavJAZ的季节表达模式。【结果】PavMYC2编码689个氨基酸,具有bHLH-Zip保守结构域,属于bHLH家族。亚细胞定位结果表明,该基因在细胞核中发挥功能。进化树结果表明,甜樱桃PavMYC2与中国樱桃(Prunus pseudocerasus)和樱花(Prunus yedoensis)亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果分析发现,PavMYC2的表达具有组织特异性,在花芽中表达量最高,依次是叶、茎、花、根中表达量的4.8、4.9、8.8、37.4倍。在花芽中,PavMYC2的表达量在夏秋季高,然后逐渐降低,在冬季维持一定的表达水平,春季时最低。顺式作用元件分析发现,该基因启动子上含有大量光响应元件、多种激素响应元件和低温胁迫等相关元件。互作蛋白结果显示,PavMYC2可以与PavJAZ1/2/3蛋白发生互作,进一步对JAZs基因的表达模式进行分析,发现PavJAZ1/2/3/5与PavMYC2的表达量变化相似。【结论】克隆得到1个PavMYC2基因,夏秋季高温时期在花芽中高表达,随后逐渐降低,在冬季维持一定的表达水平,春季开花时最低。其与PavJAZ1/2/3互作,协同响应温度胁迫。该研究为进一步探究甜樱桃花芽中MYC2在响应温度胁迫和调控开花进程中的作用奠定了基础。     

圆叶葡萄‘Noble’的芪合成酶STS启动子的功能分析

【目的】分析圆叶葡萄‘Noble’的芪合成酶(stilbene synthetase,STS)基因上游调控序列的顺式作用元件及其功能,为研究白藜芦醇在葡萄抗病机制中的作用提供理论基础。【方法】在前期通过染色体步移法分离得到圆叶葡萄‘Noble’芪合成酶Mr STS基因上游调控序列的基础上,利用Plant CARE在线启动子预测工具对其顺式作用元件进行初步预测,构建该启动子5’端侧翼序列缺失表达载体,启动报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达,并通过农杆菌介导法真空瞬时转化离体葡萄叶片,研究激素和霜霉菌诱导条件下GFP蛋白的活性差异。【结果】PlantCARE在线预测结果表明,Mr STS基因上游调控序列含有启动子的特定结构,如TATA-box、CAAT-box,另外也含有一些与逆境相关的顺式作用元件,如ABA响应元件ABRE、Me JA响应元件CGTCA-motif、赤霉素响应元件P-box、激发子响应元件Box-W1和胁迫响应元件TC-rich repeats等;不同诱导条件下,5’端侧翼序列缺失表达载体启动GFP蛋白的活性存在显著差异。【结论】Mr STS基因上游调控序列含有启动子核心区域和与逆境相关的顺式作用元件,并受ABA、Me JA和霜霉菌的诱导。     

苹果6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶Md6PGDH6基因的功能鉴定

【目的】探究苹果6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶Md6PGDH6基因的性质及其生物学功能。【方法】利用PCR技术得到MDP0000235230(Md6PGDH6)基因的全长,进行相关生物信息学分析,利用qRT-PCR技术研究其时空表达模式,利用农杆菌介导的转化方法获得Md6PGDH6转基因‘王林’愈伤组织,以及异源表达Md6PGDH6基因的拟南芥和烟草。【结果】MDP0000235230基因与拟南芥AT4G29120.1(At6PGDH6)归为一类,将MDP0000235230命名为Md6PGDH6基因。Md6PGDH6基因包含一个942 bp开放阅读框。在线网站预测发现,Md6PGDH6蛋白整体表现为亲水性。启动子分析发现,其含有分生组织、激素响应、环境因子和非生物胁迫响应顺式作用元件。Md6PGDH6基因在茎、果皮、果肉和种子中表达量较高,在根、叶和花中表达量较低。Md6PGDH6基因促进‘王林’愈伤组织、拟南芥和烟草的生长。【结论】Md6PGDH6在果肉中表达量较高,Md6PGDH6基因有助于‘王林’愈伤组织的生长。     

刺梨CDPK基因家族的鉴定及其对供钙水平的表达响应

【目的】CDPKs是植物中广泛存在的Ca²⁺感受器,鉴定刺梨(Rosa roxburghii Tratt.)CDPK基因家族成员,并探索其对不同供钙水平的表达响应。【方法】采用生物信息学方法鉴定并分析Rr CDPK基因家族,通过转录组测序及实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q RT-PCR)分析其组织表达特异性及在不同供钙水平下的表达响应。【结果】从刺梨基因组中共鉴定出16个具丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和EF-hand结构域的CDPK基因(命名为Rr CDPK1～16),结构分析显示蛋白长度在393～561 aa之间,分子质量在44.02～62.98 ku之间,平均等电点6.05;家族基因结构差别较大,外显子数量为2～10个,包括6个保守基序;亚细胞定位预测Rr CDPKs在细胞核和多种细胞器均有定位,主要定位于细胞质;进化分析可分为4个亚族,且与草莓的亲缘关系最近,其次是苹果,较远为拟南芥和水稻。启动子顺式作用元件分析表明,Rr CDPKs大多含光响应元件、多种激素响应元件及胁迫响应元件等。不同器官及果实发育时期的转录组数据显...     

杧果幼胚发育阶段对离体培养物诱导效果的影响

【目的】明确幼胚愈伤诱导和胚抢救最佳时期,为杧果高效体胚发生体系构建及胚抢救技术有效利用提供依据。【方法】以'热农1号'杧果为材料,探讨幼胚不同发育时期和植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响,同时比较了幼胚不同发育时期对幼胚萌发的影响。【结果】授粉后25 d幼胚处于球形胚期,30 d处于心形胚期,35 d处于鱼雷胚期,40 d之后处于子叶胚期。授粉后40 d早期子叶胚愈伤组织诱导率显著高于其他时期;早期子叶胚在含有3.0 mg·L~(~(-1))2,4-D、1.0 mg·L~(~(-1))KT(或0.5 mg·L~(~(-1))KT及0.5 mg·L~(~(-1))ZT)培养基(PM3和PM4)中愈伤组织诱导率最高,为54.4%～62.2%,显著高于其他培养基。授粉后35 d鱼雷胚的萌发率最高,为47.2%,显著高于其他时期。愈伤组织能经体胚发生途径正常成苗,幼胚萌发后也能正常发育成苗。【结论】'热农1号'杧果幼胚愈伤诱导最适宜的时期是早期子叶胚,胚抢救最适宜的时期是鱼雷胚阶段。     

龙眼SKP1-like家族成员鉴定及体胚发生早期表达分析

为研究S-phase kinase-associated protein 1-like(SKP1-like)在龙眼中的分子特性以及其在体胚发生早期的表达模式,基于模式植物拟南芥SKP1-like的氨基酸序列,在龙眼基因组数据库中进行SKP1-like成员的鉴定。同时,通过生物信息学方法对其蛋白理化性质、系统进化特征、染色体定位、共线性与选择压力、基因结构、保守基序、蛋白结构、蛋白互作网络、启动子顺式元件进行分析,并结合龙眼转录组数据分析其在体胚发生早期的表达模式。研究结果表明:龙眼SKP1-like家族基因共有14个成员,分别将其命名为DlSKP1-1～DlSKP1-14。龙眼SKP1-like(DlSKP1)家族基因编码蛋白质的氨基酸数、分子量以及等电点分别为75～399 aa、8.29～45.34 kD、4.44～5.76,均不含信号肽,可能主要定位于叶绿体中。DlSKP1家族存在1对串联重复基因以及4对片段重复基因。蛋白互作结果提示,Dl SKP1家族成员可能与多种蛋白(尤其F-Box家族蛋白)存在互作关系。启动子顺式作用元件的结果表明,DlSKP1家族成员启动子含有较多脱落酸(Abscisicacid,ABA)与茉莉酸甲酯(Methyljasmonate,MeJA)响应元件。此外,DlSKP1成员在龙眼体胚发生早期存在5种不同的表达模式,其中3个成员(DlSKP1-6、DlSKP1-8、DlSKP1-13)在各阶段的表达量较其他成员较高。研究结果显示,DlSKP1家族成员可能与F-Box蛋白存在互作作用,并且可能参与ABA、MeJA的调控过程,还可能在龙眼体胚的形态建成中发挥重要作用。     

转录因子FaNAC56在草莓果实成熟中的功能分析

[目的]研究NAC转录因子FaNAC56在草莓果实成熟中的作用.[方法]根据前期果实成熟过程中的蛋白组数据,以八倍体红颜草莓为试材,克隆FaNAC56基因及其启动子.在蛋白水平,利用MEGA构建FaNAC56系统进化树,并通过生物信息学预测其编码蛋白的二级结构,以及利用烟草进行亚细胞定位;在转录调控水平,利用预测网站分析FaNAC56启动子区顺式作用元件以及下游靶基因,并通过RT-qPCR分析FaNAC56的时空表达模式.最后,利用果实圆片温育方法分析FaNAC56基因受外源激素诱导情况.[结果]FaNAC56基因全长1035 bp,编码344个氨基酸,具有NAC转录因子NAM保守结构域.系统发育分析表明FaNAC56与月季NAC56同源性最高.亚细胞定位显示FaNAC56定位于细胞核内.FaNAC56在果实中高度表达并随果实成熟表达量急剧增加.FFaNAC56启动子区含有ABA、赤霉素、生长素、乙烯等激素和胁迫相关响应元件,其表达水平受这些激素诱导.靶基因分析发现FaNAC56可能响应多种激素、花色苷和蔗糖调控元件.[结论]FaNAC56可能通过多种激素调控草莓果实的发育和成熟.     

miR395分子进化特性及其在龙眼早期体胚发生中的表达分析

【目的】研究miR395的分子进化特性及其在龙眼早期体胚发生中的表达分析。【方法】通过龙眼miRNA文库、转录组数据库和miRBase数据库,得到所有植物miR395家族成员成熟体和前体序列,对其进行序列比对及进化分析、保守性分析、前体二级结构预测、潜在靶基因预测,对龙眼miR395a在龙眼早期体胚发生(SE)阶段的表达模式进行分析。【结果】龙眼miR395家族包含5条前体序列和2条成熟体序列。Mfold预测分析发现,龙眼pre-miR395序列均能形成稳定的发卡结构,其最小折叠自由能ΔG在-44.70～64.80 kal·mol-1,提示与序列长度没有显著相关性。其次,保守性分析显示,植物pre-miR395两端序列较保守,而中间序列不保守;系统进化分析提示,龙眼pre-miR395家族与脐橙、葡萄和苹果的亲缘关系更近。psRNAtarget预测显示,龙眼miR395调控的潜在靶基因主要包含富含亮氨酸重复受体蛋白激酶LRR-RLKs、ATP硫酸化酶APS1、蛋白磷酸酶PP2C、前体RNA蛋白质TSR1同系物TSR1、酮酯酰CoA硫解酶KAT2和EH结构域蛋白EHD1等6个,且都是以裂解靶标的方式进行调控。qRT-PCR分析表明,在龙眼早期体胚发生阶段,miR395a呈上调趋势,且miR395a与APS1呈显著负相关。【结论】龙眼miR395与其他植物miR395功能具有高度保守性和物种特异性,同时龙眼miR395a上调表达可能促进龙眼球形胚的形态建成。     

氨基酸对荔枝愈伤组织增殖及体胚发生体系优化的研究北大核心CSCD

【目的】探究氨基酸对荔枝愈伤组织增殖及体胚诱导的影响。【方法】采用L9(34)正交设计,分别在妃子笑荔枝愈伤组织继代及体胚诱导阶段添加不同氨基酸,比较其对愈伤组织增殖及体胚诱导的影响。【结果】在愈伤组织增殖阶段培养基中添加氨基酸均显著提高愈伤组织增殖率,最优处理为基础继代培养基添加0.1 g·L^(-1)γ-氨基丁酸+0.2 g·L^(-1)谷氨酰胺,愈伤组织增殖率为初始接种量的14.04倍。与对照相比,氨基酸处理组的胚性愈伤组织淡黄,颗粒较小,细胞呈椭圆形,细胞质浓厚,多为正在分裂状态;非胚性愈伤组织浅白,水渍严重,着生于顶部或者边缘,易于剔除。在愈伤组织增殖阶段培养基中添加γ-氨基丁酸、谷氨酰胺和丙氨酸对后续的体胚发生及萌发影响极显著(p<0.01),最优配方为基础继代培养基添加0.3 g·L^(-1)γ-氨基丁酸+0.4 g·L^(-1)谷氨酰胺+0.05 g·L^(-1)丙氨酸,每克愈伤组织可获得461个体胚,77株组培苗。在体胚发生阶段培养基中添加氨基酸,获得的体胚发生及萌发最优配方为基础诱导培养基添加0.3 g·L^(-1)γ-氨基丁酸+0.4 g·L^(-1)谷氨酰胺+0.05 g·L^(-1)丙氨酸,每克愈伤组织可获得270个体胚,72株组培苗。【结论】氨基酸可调节愈伤组织胚性,提高愈伤组织增殖率,促进体胚发生及萌发。