果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体的构建

从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约0.5kb的ACC合成酶基因的片段,将其克隆到质粒载体pMD18-T中,测序表明,该基因为583bp,编码194个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

草莓细胞工程技术与分子生物学研究进展

从成熟的薄皮甜瓜（齐甜1号）果肉组织中提取总DNA，经PCR扩增得到约0.5kb的ACC合成酶基因的片段，将其克隆到质粒载体pMD18-T中，测序表明，该基因为583bp，编码194个氨基酸；从番茄（东农706）叶片组织中提取总DNA，经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段，将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy中，测序表明，该基因为2192bp； 以pCAM2301为起始植物表达载体，pCAM-GT为中间载体，成功构建了果实特异启动子（E8）调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体，采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

番茄红素ε-环化酶果实特异性RNAi载体的构建及对番茄的遗传转化

为了研究番茄LCYE基因对其果实中番茄红素含量的影响机制,培育高品质番茄品种,在Gen Bank中根据已知的LCYE(ID:544 129)扩增出337 bp的保守序列;根据KJ 561 284.1扩增出2 203 bp的果实特异性启动子E8;查找番茄LCYE的内含子,选择第三个长112 bp的Intron片段;利用同尾酶构建出载体p Ri E8-LCYE,与p CAMBIA1301连接构建出果实特异性RNAi表达载体p CRi E8-LCYE,测序表明载体构建正确。农杆菌介导,叶盘法转化番茄,PCR检测表明得到了转基因番茄植株。与同样条件下番茄LCYB基因干扰载体的遗传转化过程相比,表明:对LCYE基因的干扰使番茄子叶开始褐化时间提前,且褐化率更高,说明筛选培养时子叶的褐化与所干扰的基因也有关系。     

番茄果实特异性启动子2A11的基因克隆及功能研究

采用巢式PCR技术从番茄基因组DNA克隆到长度1.3kp的果实特异性2A11启动子基因。序列分析表明,克隆到的基因序列2A11启动子转录起始位点上游的621bp处缺失了已报道的番茄2A11启动子基因（GenBank ID M87659,1993）序列中的“tatattgttaacttcttgttgaattaaagcaat”片段,其同源性为61%,登入GenBank,ID号为DQ453963;构建植物表达载体pCAMBIA2A11,用农杆菌介导侵染番茄果实,GUS基因瞬间表达结果表明,该2A11启动子基因具有驱动GUS基因在番茄果实中特异性表达的功能。研究结果表明成功地获得2A11果实特异性启动子基因,为下一步转基因番茄口服疫苗的研制奠定了一定的基础。     

一种适于PCR检测病毒诱导基因沉默番茄植株的微量DNA提取方法

【研究目的】为了寻找一种适用于病毒诱导的基因沉默番茄叶片PCR检测的快速、简单、成本低的DNA提取方法。【方法】笔者根据PCR反应的要求,用改良的CTAB法,实现了微量番茄叶片基因组DNA的快速提取。【结果】提取基因组DNA所用的组织量虽少,所得的DNA经过电泳检测虽有降解,但足以用于PCR检测,以其作模板扩增中国番茄黄化曲叶病毒诱导的硫黄素酶(Su)基因沉默植株中病毒组分中的DNAmβ和1.7A,片段大小分别为500bp、1300bp。测序结果证明是相应基因的部分片段。【结论】该方法的材料不需要使用液氮,可以单人大批量提取,并在基因沉默的番茄植株中能稳定而准确的规模化PCR检测。     

柞蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子的克隆与分析

以柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)DNA为模板,运用PCR技术钓取ApNPV(IE-1)基因的启动子片段,并将其克隆到pMD18-T载体上进行测序分析.将测序的2.7 kb DNA片段用EcoR I和Bgl II双酶切,回收3＇端1.6 kb的DNA片段.将该片段插入到pGFP-N2表达载体上构建以其作为启动子的IE-1/pGFP-N2重组质粒.重组质粒经脂质体介导转染Hela细胞,结果可见绿色荧光蛋白(GFP)在细胞中的表达,证明钓取的IE-1基因启动子片段具有启动子的转录活性.     

三种DNA提取方法对检测草莓镶脉病毒稳定性的研究

草莓成熟叶片中含有大量的多糖、蛋白质、多酚和色素等物质,影响高质量DNA的提取和下游PCR反应的进行。为确定适用于PCR技术检测草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)的DNA提取方法,从草莓叶片中提取DNA后,对样品中的SVBV进行特异性的PCR检测,比较确定不同DNA提取方法对PCR检测SVBV稳定性的影响。以感染SVBV的草莓叶片为材料,分别采用CTAB试剂盒法、高盐低pH法、改良SDS法提取草莓叶片的总DNA,将不同方法提取的DNA通过紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法进行测定,对DNA产量和质量进行分析。结果表明,3种方法均能获得较为完整的DNA片段,用CTAB试剂盒提取的DNA质量最高,改良SDS法提取的DNA质量较低。将不同方法提取的DNA经过PCR反应特异性检测SVBV后,将与目的片段大小一致的PCR扩增产物经序列测定及分析,证明与SVBV的序列相吻合,证明了方法的可靠性,其质量能够满足PCR特异性检测需要。     

ACS基因和HBsAg基因的克隆及瞬时表达分析

本研究通过SDS法从香蕉幼嫩叶片中提取基因组DNA,通过PCR的方法对ACS启动子2.5Kb的序列进行缺失改造,克隆到了长1 185bp的ACS启动子片段,与GenBank报道序列相比较同源性为93.2%.经PlantCARE软件分析发现序列中含有多种调控元件,经预测ACS启动子可能被光、热、GA、乙烯或伤所诱导.为验证其果实特异表达活性,通过插入到pBI 101.2中间表达载体上的GUS基因5＇端前,构建了含GUS基因的瞬时表达载体pBACS.用基因枪法将pBACS转化到香蕉果实中,结果表明：用pBACS包被的金粉轰击的果实经GUS组织化学染色后,都出现兰色斑点,对照没有出现兰色斑点.因此认为GUS基因在香蕉果实成功实现瞬时表达.同时,通过改进的酚-氯仿提取法从乙肝病毒感染者的血清中提取总DNA,然后根据报道的序列设计特异性引物,同时在上游引物中引入了Kozak序列,经PCR克隆到HBsAg基因序列,长度为681bp.NCBI BLAST分析的结果表明,获得的HBsAg基因序列及推导的氨基酸序列与GenBank中所报道的序列的同源率分别为97.2%和97.4%.将经过改造的HBsAg基因替代pBACS中的GUS基因,成功构建了含有ACS启动子和HBsAg基因的香蕉树果实表达载体,为下一步转化香蕉,获得在果实中表达HBsAg蛋白的转基因植株奠定了基础.     

番茄八氢番茄红素脱饱和酶基因（Pds）启动子的克隆

根据GenBank中番茄八氢番茄红素脱饱和酶基因（Phytoene desaturase.Pds）的启动子序列（U46919）,设计特异引物,通过巢式PCR从番茄基因组中分离了一段长1790bp的Pds启动子序列。将该片段插入到克隆载体pMD18-T中,转化大肠杆菌后,获得的阳性克隆经测序,结果表明所获得的序列和GenBank（U46919）中登录的序列完全一致     

INO启动子克隆及胚珠特异表达载体的构建

为了观察转基因植株胚珠特异性表达,采用CTAB法提取拟南芥基因组DNA,构建了35S::pCAMBIA1304-L117载体并对番茄进行遗传转化。根据已报道的INO启动子序列设计并合成一对特异引物,通过PCR对启动子进行扩增、连接并对其进行测序,结果表明：与GenBank中已注册的INO启动子序列的同源性为100%,并且构建了以INO代替CAMV35S启动子的pCAMBIA1304-L117植物表达载体,采用冷冻法将其转入根癌农杆菌EHA105。成功构建了35S::pCAMBIA1304-L117载体,并为进一步检测奠定了基础。     

巴西橡胶树红根病菌DNA提取有效方法比较

旨在筛选适用于橡胶树红根病菌DNA提取的有效方法并评价其效果。利用CTAB改良法、氯化苄改良法、SDS改良法等3种方法提取橡胶树红根病菌菌丝体DNA,并通过紫外吸收光谱和琼脂糖凝胶电泳对DNA样品进行检测,比较提取DNA的产量、质量;再选用提取效果最好的方法提取5个时间段（4、6、8、10、12天）的菌丝DNA并进行ITS-PCR检测。CTAB改良法提取的样品DNA纯度最好,产率最高,OD260/OD280为1.82~1.84,浓度可达280 μg/mL;培养4~6天的菌丝提取的DNA质量最高,适合PCR检测需要。CTAB改良法是一种适用于橡胶树红根病菌DNA提取的理想方法。     

太行花DNA提取的优化和适用分子标记检测

比较了常规CTAB法、改良CTAB法和SDS法对太行花叶片总DNA的提取效果,并对改良CTAB法提取的DNA在多种分子标记中的适用性进行了测试。结果表明：常规CTAB法提取的DNA难以完全溶解,且有褐化现象;SDS法提取的DNA产率及纯度都很低;改良CTAB法提取的DNA产率高且稳定,无明显降解,杂质少,OD260/OD280比值在1.8左右。以改良CTAB法提取的DNA为模板,应用叶绿体和线粒体通用引物扩增出了特异性的高效产物,ISSR和RAPD引物对总DNA的扩增也获得理想结果。因此,改良CTAB法适用于太行花总DNA提取,其产物能满足核、叶绿体和线粒体基因组分子实验的要求。     

甘蔗基因组DNA提取方法的研究

试验是以甘蔗的嫩叶为材料,通过对前人的CTAB提取方法进行改良,以探索更好的甘蔗基因组DNA提取方法。通过改良最后得到的CTAB提取方法Ⅲ具有成本低、操作简单、省时等特点,并且得到的DNA经核酸蛋白质分析仪、琼脂糖凝胶电泳及RAPD检测分析表明方法Ⅲ提取得到的DNA完整性好,纯度高,可以直接用于各种分子标记。     

禽网状内皮组织增生病病毒囊膜蛋白基因的克隆及其原核表达

以本实验室保存的REV毒株为模板,采用RT_PCR技术扩增了REV env部分基因,长为939 bp,并进行亚克隆到pMD18_T质粒载体上,连接、转化、鉴定后得到阳性重组质粒pET_env,将目的片段进行序列分析,结果表明,该REV的env基因与已发表的SNV株、中国HA9901株以及A株同源性均达94%以上,推导的氨基酸同源性为94%以上。将该基因片段与原核表达载体pET_32a重组,并将重组质粒转化至宿主菌BL21中,用IPTG诱导表达,对表达的蛋白用SDS_PAGE电泳,免疫印迹和薄层凝胶扫描分析,表达产物与理论推理一致;免疫印迹结果证明,表达的env蛋白可被REV阳性血清所识别。     

一种快速提取小麦基因组DNA的改良CTAB方法

旨在寻求一种微量、快速提取小麦DNA的方法。以小麦幼叶为材料,用改良CTAB法、改良SDS法、沸水浴法提取小麦叶片总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳法、紫外吸收法和PCR检测DNA完整性和纯度。改良CTAB法提取小麦基因组DNA质量和纯度高、无降解,每人每天可以轻松提取200个DNA样品,对转基因植株的PCR检测显示扩增目标条带清晰一致,无假阳性,试验结果理想。改良SDS法所提DNA纯度和浓度虽略不如改良CTAB法,但仍然符合实验要求。沸水浴法提取量少且杂质多,PCR无有效扩增,结果不理想。改良CTAB法提供了一种简便、快速微量小麦DNA提取方法,适用于PCR和其他分子生物学研究。