黄瓜抗霜霉病相关基因cDNA片段的克隆与分析

 以抗霜霉病黄瓜‘东农129’为试材, 利用基因差异显示技术(DDRT-PCR) 研究了黄瓜接种霜霉病菌前后基因表达的差异。共分离出4个接菌后在叶片中特异表达的cDNA片段, 分别命名为49-2、 50-5、50-7和52-14。同源性比对发现, 50-7号片段与黄瓜脂氧合酶基因部分同源, 其余为未知新基因序列。表达分析显示, 所筛选的4个差异表达基因片段与黄瓜感染霜霉病菌有密切关系。49-2号片段在所检 测的整个感染过程都有很强的表达; 50-5号片段与病菌侵染也有较密切的关系, 但相对49-2表达延迟; 50-7和52-14仅在接种24 h有一定表达, 显示出与病菌诱导之间的特殊关系。     

利用SSH 技术鉴定黄瓜抗霜霉病相关基因

采用SSH 技术对黄瓜抗霜霉病自交系M801-3-1 侵染霜霉病菌前后的差异表达基因进行了研究。利用 SSH 技术构建抗病黄瓜材料接种霜霉病菌和未接种差异表达的差减cDNA 文库。经反向Northern blot 杂交检测,共得到48 个阳性克隆。利用分子生物学软件对测序后的序列进行质量检测和聚类、拼接,共得到 14 个UniESTs,其中包括8 个singletons 和6 个contigs。通过SSH-EST 代表基因功能的分析,说明抗氧化胁迫能力和叶绿体的重建和保护机制对抗病品种抗病有重要作用。同时,提出SSH-EST 代表的clpb、HSP70、HSP22 和肽脯氨酰顺反异构酶还可能参与了R 基因介导的防御反应,smHSP 有可能就是R 蛋白的“保卫靶”,负责监测细胞内的异常,这一发现为揭示活性氧机制和R 基因介导的防卫机制之间的关系提供了关键证据。     

苯并噻二唑( BTH)诱导黄瓜幼苗对霜霉病抗性的研究

 用0.5 mmol/L BTH (苯并噻二唑) 溶液在接种黄瓜霜霉病菌前4、8、12、24、48、96、168 h (7 d) 和接种后2、4 d处理二叶期的黄瓜幼苗, 结果表明BTH对霜霉病菌无直接的抑制作用, 但能诱导黄瓜幼苗对霜霉病产生局部和系统的抗性, 系统抗性的表达在处理后48 h产生并持续7 d以上。几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性测定结果表明, BTH处理可系统性地增强这两种酶的活性, 且与黄瓜对霜霉病的诱导抗性密切相关。     

霜霉病菌侵染的黄瓜叶片cDNA文库的构建及抗病相关基因筛选

以接种黄瓜霜霉病菌的抗病黄瓜品种‘649’的叶片为材料,使用改良SDS法提取总RNA,构建黄瓜叶片全长cDNA文库,得到的原始文库滴度为5.5 × 106 pfu • mL-1,扩增后的文库滴度达6.5 × 109 pfu • mL-1,重组率约为99%,插入片段在0.5 ~ 2.0 kb之间,大多在1.0 kb左右。随机选取3 360个克隆进行测序,共拼接出2 507个unigenes,其中包括211个重叠群（Contigs）和2 296个单拷贝EST（Singlets）。生物信息学分析显示：这些unigenes中存在427条与植物防御/抗病相关的基因,其中包括两类抗病基因和细胞程序性死亡相关基因,这些基因的发现为下一步研究黄瓜抗病机理,克隆抗霜霉病相关基因提供了重要的参考。     

白粉病菌胁迫下黄瓜R17抗病品系叶片蛋白质组分析

 以黄瓜抗白粉病品系R17为试材，在接种白粉病菌24、48和72 h后提取叶片蛋白质，采用双向电泳技术研究白粉病菌胁迫条件下黄瓜叶片蛋白质组的变化。结果表明：黄瓜幼苗在白粉病菌胁迫下，24、48和72 h的叶片双向电泳图谱与未接种对照组均存在一定差异。通过质谱分析和数据库搜索，共鉴定出7种表达差异蛋白点，它们分别为磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶、假拟蛋白g5bf、PSⅡ聚光复合体叶绿素a/b结合蛋白、铁氧还蛋白NADP氧化还原酶、XS结构域所含蛋白、肌球蛋白XI和苹果酸脱氢酶。这些蛋白都可能是与应答白粉病菌胁迫相关的蛋白质网络中的一部分，它们在黄瓜抗病反应中起不同的作用。     

不同抗性的黄瓜幼苗对接种霜霉病菌的生理响应

以黄瓜抗病品种"津春4号"和感病品种"长春密刺"为试材,在接种黄瓜霜霉病菌后0.5、1、2、4、7d对叶片的丙二醛(MDA)、可溶性糖、可溶性蛋白含量和乙烯释放量进行了检测,并分析了这些生理变化与黄瓜霜霉病抗性之间的关系。结果表明:抗病品种黄瓜叶片中MDA含量、乙烯释放量低于感病品种,而可溶性糖、可溶性蛋白含量则高于感病品种。表明抗病品种比感病品种具有更强的防御能力和抗膜脂过氧化能力。     

黄瓜霜霉病抗性研究进展

霜霉病是世界上危害瓜类作物的主要叶部病害之一。霜霉病菌小种分化问题虽然在国际上还存在争议,但在国内尚未发现小种分化现象。文章归纳了不同的霜霉病抗性鉴定方法;报道了不同黄瓜材料对霜霉病的抗性与其叶片生理生化物质含量变化关系的最新研究进展;介绍了对黄瓜霜霉病抗性遗传规律研究主要的2个结果:多基因抗性和单隐性基因抗性;概述了黄瓜霜霉病分子标记研究现状和挖掘、利用黄瓜近缘野生种抗霜霉病基因的最新进展。     

马铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因候选表达序列的cDNA-AFLP鉴定

 利用具有6个无毒基因不同表现型且处于萌发中的静孢子时期的马铃薯晚疫病菌构建4个混合池, 通过cDNA2AFLP分析, 共获得85个与无毒基因相关的差异表达片段, 其中与无毒基因Avr1、Avr2、Avr3-Avr10-Avr11、Avr4 相关的差异表达片段分别为20, 28, 16和21个。将这些差异表达片段对20个晚疫病病菌个体进行无毒基因差异表达验证, 得到1 个无毒基因连锁群Avr3-Avr10-Avr11 的候选片段, 即A11T13Avr3-10-11S157; 无毒基因Avr4的候选片段2个, 即A24T19Avr4S122和A24T24Avr4S142。Blast分析表明: A11T13Avr3210211S157 与马铃薯晚疫病菌萌发孢子囊( germinating sporangium ) EST ( expressed sequence tag) 库中的序列PG001F10.XT7 同源; A24T19Avr4S122 与晚疫病菌萌发中静孢子( germinating cyst) EST库中的PH051G10.XT7部分序列完全一致, 而A24T24Avr4S142与PH051G10. XT7具有98%的同源性。这些结果将促进通过电子克隆并结合RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 技术获得全长的无毒基因Avr4。     

瓜枝孢弱毒菌株诱导黄瓜抗病相关基因表达的cDNA-AFLP 分析

 利用cDNA-AFLP 技术,分析瓜枝孢弱毒菌株诱导黄瓜苗后72 h 内抗病相关基因的差异表达。结果显示,诱导的基因表达差异始于接种后3 h,接种后6 h 差异表达片段总数达到高峰。8 个取样时间点的诱导性差异表达片段数大于抑制性表达片段数。仅在接种后第12 h 呈现相反趋势。通过回收、克隆、测序和同源性比对,获得的5 个片段分别与拟南芥中病原菌诱导的水杨酸糖基转移酶、梨磷脂酶C编码的基因等具有较高的同源性,初步推断瓜枝孢弱毒菌株诱导黄瓜抗病可能是通过依赖于水杨酸介导的信号传导途径诱导黄瓜的系统抗病性（system acquired resistance, SAR）,作为胁迫抗性信号传递中的关键酶——磷脂酶C 可能参与了上述过程。经Northern 杂交结果证实,克隆分离的DNA 差异片段是瓜枝孢弱毒菌株诱导表达的特异片段。     

嫁接技术在防治黄瓜枯萎病上的应用

随着蔬菜保护地栽培的发展,黄瓜枯萎病也越来越严重,目前解决的最好办法就是采用嫁接的方法。笔者从1986年开始引进抗病性强的云南黑籽南瓜、南砧1号和青岛拉瓜作砧木,以津研4号黄瓜种作接穗进行试验研究,效果显著。 嫁接抗病机制试验 一、抑制病菌伤口浸染试验 用小瓦盆或纸袋营养钵种植南瓜和黄瓜各50株。2～3片真叶时,在南瓜、黄瓜的茎和叶柄上进行伤口接菌,3～7天后检查结果。试验结果表明:南瓜和黄瓜受伤接菌后均有病菌侵入,而南瓜伤口浸染的病菌不向一四周扩展,植株仍正常生长发育;黄瓜伤口浸染的病菌继续向周围扩散蔓延,7天后组织全…     

高温诱导黄瓜抗黑星病研究

 利用高温(40～50 ℃) 预先对黄瓜幼苗处理1～2 h , 可以不同程度地诱导黄瓜苗对黑星病(Cladosporium cucumerinum Ell. and Arth. ) 的抗性, 40 ℃2 h、45 ℃1 h 高温诱导抗病性表达明显。高温热击后4 h 即开始表现出诱导抗病性, 24 h 诱导抗病性表现最明显。通过对18 个黄瓜品种的高温热击试验发现, 不同黄瓜品种经高温热击处理后表现出的诱导抗病效果不同, 有些品种在40 ℃2 h、45 ℃1 h 处理下诱导效果均较明显, 有些品种在40 ℃2 h 处理下诱导效果明显, 而有些品种则在45 ℃1 h 处理下诱导效果较好, 还有些品种高温处理后无效果。     

亲和病原菌诱导黄瓜产生交互保护作用的研究

采用诱导接种和挑战接种,探讨通过黄瓜细菌性角斑病菌诱导后,黄瓜对霜霉病和角斑病的交互保护作用。结果表明,黄瓜植株经角斑病菌诱导接种后可以产生对霜霉病、角斑病的交互保护作用,对霜霉病的交互保护防效最高可达97.14 %,对角斑病的防效可达59.08 %。同时经亲和病原菌诱导后,寄主叶片中有大量木质素沉积,富含羟脯氨酸糖蛋白（HRGP）含量提高,增强了寄主的抗病性。亲和病原菌可以诱导寄主产生广谱抗病性,不仅对该病原菌引起的病害,而且可以对其他病原菌引起的病害产生交互保护作用,并且诱导的交互保护作用与诱导间隔期有关。     

辣椒N 基因介导抗根结线虫作用早期表达基因的抑制性消减杂交SSH分析

 以含N 基因的辣椒(Capsicum annuum L. ) 为试验材料, 接种南方根结线虫(Meloidogyne incognita) 12、24、36 h的根尖材料作为测验方( tester) , 相应的未接种根尖材料作为驱动方( driver) , 构建一个南方根结线虫诱导N 基因表达早期的正向抑制消减杂交cDNA文库, 并结合文库高密度点阵膜杂交差异筛选, 获得了237条表达序列标签( EST) 。在GenBank上进行BLASTn与BLASTx分析, 得到148条功能已知的EST序列, 获得已知的上调抗性相关EST 68个。分离出了具有NBS2LRR结构的抗线虫蛋白和类LRR抗性蛋白的基因, 防御作用相关的类萌芽素(GLP) 、HSR203J 蛋白、蜜腺蛋白、蛇毒素肽等基因,抗性相关的WRKY、ERFBP等转录因子基因, 以及G蛋白、142323蛋白等多种信号蛋白基因。通过GeneOntology分析, N 基因介导的早期表达抗病基因涉及病原物的识别、抗性信号传导、过敏性坏死、系统获得性抗性以及植物细胞保护机制等多个方面, 并有许多功能未知的基因有待于进一步的研究。     

Effects of rs35100176 polymorphism in IPO8 promoter on gene expression

AIM: To investigate the effect of rs35100176 CCT insertion/deletion polymorphism in the promoter region of importin 8 (IPO8) gene on its mRNA expression. METHODS: A 342-bp fragment of IPO8 gene promoter containing the rs35100176 polymorphism was amplified from 49 DNA samples and sequenced. The IPO8 promoter fragments containing CCT 3-nucleotide insertion or deletion were amplified using the corresponding homozygote DNA samples. The PCR products were sequenced and inserted into the luciferase reporter vector pGL3-Basic. Recombinant vectors were transfected into the cells by Fugene 6.0 and the expression of the reporter gene was detected by a dual-luciferase reporter assay system. The mRNA expression level of IPO8 was detected by real-time PCR in 3-nucleotide insertion or deletion homozygote cells. RESULTS：The sequencing results showed that there were 3 kinds of genotypes in the rs35100176 polymorphism, CCT/CCT,CCT/- and -/-, and the gene frequencies were 1837%, 5510% and 2653%, respectively. The recombinant expression vectors pGL3-3N Insertion and pGL3-3N Deletion were successfully constructed. The luciferase assay showed that pGL3-3N Insertion produced significantly lower luciferase activity than that by pGL3-3N Deletion. Real-time PCR showed that HEK293 cells with 3-nucleotide insertion homozygote expressed relative lower IPO8 mRNA than Saos-2 cells with 3-nucleotide deletion homozygote. CONCLUSION：The CCT 3-nucleotide insertion variant decreases the promoter activity of IPO8, thus affecting the gene expression.     

黄瓜抗白粉病品系cDNA文库构建及EST分析

 采用SMART技术构建了高抗白粉病的黄瓜品系JIN5-508的叶片cDNA文库,并对其进行了质量鉴定。结果表明,该文库的重组率为95.3%,库容量为1.02 × 106 pfu · mL-1,平均插入片段为0.5 kb左右,是一个高质量的cDNA文库。利用该文库随机挑选的8 352个克隆从5′ 端进行单向测序,共获得8 035个有效的ESTs（expressed sequence tags）,序列的平均长度为838 bp。进一步的生物信息学分析表明：EST序列拼接出3 467个unigenes,其中包括953个contigs和2 514条singletons,文库冗余度较低,为56.9%;从文库中筛选出了大量的低丰度表达基因,约占unigene总数的72.5%,说明文库的复杂性较高;1 991个unigenes获得分子功能注释,其中与蛋白结合活性和催化活性相关的基因分别达到了41.34%和38.72%;在获得功能注释的unigene中,有部分抗病抗逆相关基因高丰度表达,其中3个unigenes与拟南芥白粉病抗性基因Mlo2、Mlo8和Mlo14高度同源,表明该文库可为进一步研究黄瓜抗白粉病相关的特异基因的克隆及功能验证奠定基础。     

黄瓜南方根结线虫病的根结大小与线虫各虫态数量间的关系

以黄瓜品种千秋1号为试材,采用室内试验方法,按南方根结线虫（Meloidogyne incognita）侵染千秋1号引起根系根结的大小统计线虫虫态及数量,并找出三者之间的关系。结果显示：日光温室栽培120 d的黄瓜根系中,直径2～3 mm的根结内有2～3条雌成虫,几乎100％根结表面附着1个卵块;直径4 mm以上的根结内有1～5条2龄幼虫,根结表面附着2～8个卵块;长径16～20 mm的根结内,成虫平均数量高达每根结42条。培养箱内接种线虫（每穴120条）45 d的黄瓜根系中,直径5 mm以上的卵块平均孵化出2龄幼虫807条,卵块在第3天和第7天孵化出的线虫数量最多。田间可根据根结大小和虫态的关系预测根结线虫的发生量和时期,建议在根结直径小于5 mm时进行防治;试验所需线虫可在接种45 d时取卵块,分别在第3天和第7天收集2龄幼虫。     

用黄化子叶喷雾接种法鉴定黄瓜黑星病抗性

利用黄化子叶喷雾接种鉴定黄瓜黑星病抗病性的具体方法是：将消毒后的黄瓜种子播在垫有湿纱布的培养皿中，２０℃恒温黑暗培养５天后黄化子叶即长出。用喷雾法接种黄化子叶，孢子浓度为２×１０６个／ｍＬ，２０℃黑暗培养４天后调查病情。经１７个抗病性不同的品种验证，该方法与培养幼苗一真叶期喷雾法比较，同样准确、可靠。同时具有鉴定周期短、不受环境条件影响、接种症状表现明显、易于分级等优点。