钙-钙调素信号通路调节热应激蛋白70表达的机制

随着温室效应的加剧,全球气候变暖已经成为现代畜牧业生产体系所面临的严峻挑战。高温炎热气候已成为影响畜禽生长繁殖的一种主要的非生物胁迫。热应激刺激时,动物体产生一系列生理变化来提高机体的耐受性,而本文旨在阐述钙(calcium,Ca2+)-钙调蛋白(calcium-activated calmodulin,Ca M)参与的耐热信号的转导机制,即热应激蛋白(heat shock proteins,Hsps)的表达机制。热应激时,细胞内Ca2+浓度上升,激活Ca M及其表达量的增加,随即Ca M作用于其下游的2种靶蛋白,即2条信号转导支路来提高热激转录因子1(heat shock factor 1,HSF1)的转录活性,进而调节热应激蛋白70(Hsp70)的表达。热应激时,Hsps表达的2条具体通路:1 Ca2+-Ca M激活下游的靶蛋白—钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,Ca MKⅡ),Ca MKⅡ通过促进HSF1(230)的磷酸化来提高HSF1的转录活性,进而诱导Hsp70的表达;2 Ca2+-Ca M激活下游另一个靶蛋白Hsp70,Hsp70通过与增多的Ca M形成复合物,释放HSF1单体,增多的HSF1形成有活性的HSF1三聚体,并入核与热激元件(heat shock element,HSE)结合,使HSF1具有转录活性,进而诱导Hsp70的表达。本文系统完整地综述了Ca2+-Ca MHSF1-Hsp70热应激信号系统,在感受、传导和响应热应激刺激时的机制。     

肉鸡热休克蛋白70 mRNA荧光定量PCR方法的建立和优化

对适应性饲养到30日龄时的60只肉鸡进行热应激处理,通过热休克蛋白70(heatshockprotein70,HSP70)mRNA荧光定量PCR(fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR)方法检测热应激处理肉鸡组织中HSP70mRNA含量。虽然受试鸡肝脏和心脏的HSP70mRNA水平在热应激6h时略低于对照组(P>0.05),但随持续性高温应激时间的延长,HSP70mRNA水平逐渐升高,热应激18h时应激肉鸡肝脏和心脏HSP70mRNA水平达最高水平,明显高于对照组(P<0.01)。实验选用3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)作为内参照,体外转录的RNA和阳性质粒作为两种标准品。结果显示,实验所建立和优化的FQ-PCR反应体系是理想的。     

荷斯坦奶牛杀菌/通透性增加蛋白N端cDNA在大肠杆菌中的融合表达

参照GenBank中安哥斯牛杀菌/通透性增加蛋白(BPI)序列,设计合成1对引物.应用RT-PCR技术,从荷斯坦奶牛嗜中性粒细胞mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白N端,将该序列与原核表达载体pGEx-4T-1连接,构建重组质粒pGEX-4T-1-BPI.重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),用IPTG诱导表达.结果表明,获得了BPIN端长度为714bp的cDNA序列,序列分析证实在第503位出现了点突变.重组质粒诱导表达后,经SDS-PAGE电泳检测重组蛋白约在52 kD处出现特异性蛋白条带.     

西安地区荷斯坦牛群4个基因位点遗传变异与牛乳中体细胞数和体细胞评分的相关分析

奶牛乳中的体细胞数是一个遗传力很低的数量性状。奶牛的体细胞评分(somatic cell score,SCS),是由体细胞数(so-matic cell count,SCC)得来(SCS=log2 SCC),与乳房炎有较高的遗传相关(0.60～0.80)(Banos et al.,1990),是目前对奶     

西安地区荷斯坦奶牛群5个基因位点遗传多态性与泌乳性状的相关分析

首次以IGFBP-3基因作为中国荷斯坦牛泌乳性状的候选基因，对中国荷斯坦奶牛群5个基因位点中4个多态基因位点与泌乳性状进行了相关分析。κ-cn、β-lg、β-lg 5′侧翼区和IGFBP-3多态基因位点基因型与泌乳性状的最小二乘分析和多重比较表明，κ-cn基因位点基因型对所有的性状影响不显著；IGFBP-3 BB型的305 d泌乳量显著高出AA、AB型1054.17 kg和838.15 kg (P <0.05)， AB型的乳蛋白率显著高于BB型(P< 0.05)；β-lg AA型对乳脂率与乳蛋白率的比值有正效应，AB型对乳蛋白率具有负效应；β-lg 5′侧翼区AA型的305 d泌乳量显著高于AB型(P <0.05)，AA型的乳脂率显著高于BB型(P < 0.05)， BB型的乳蛋白率显著高于AB型(P <0.05)。     

荷斯坦母牛DNA依赖性蛋白激酶基因(PRKDC)多态性及其与体细胞评分的关系

设计5对引物P1～P5,采用PCR-SSCP技术检测210头荷斯坦母牛DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,PRKDC)基因部分序列的多态性.结果发现P2扩增的外显子区域存在G34126A 1个突变位点,导致丝氨酸变为天冬酰胺;P3的扩增产物存在C77353T、T77384G、C77406T和77 408bp处C缺失4个突变位点.P2扩增产物经SSCP分析有AA、AB和BB 3种基因型,其频率分别为0.186、0.433和0.381;P3扩增片段经SSCP分析有CC、CD、DD、CE和DE 5种基因型,其频率分别为0.786、0.129、0.009、0.067和O.009.用最小二乘法分析PRKDC基因多态性与荷斯坦母牛体细胞评分(somatic cell score,SCS)的关系,结果表明:对于P2扩增产物多态位点,AA基因型SCS最小二乘均值显著低于AB和BB基因型所对应的值(均为P＜0.05),AB和BB基因型SCS最小二乘均值差异不显著(P＞0.05);对乳房炎抗性,AA是最有利基因型,BB是最不利基因型;对于P3扩增产物多态位点,CC、CD、DD、CE和DE基因型SCS最小二乘均值差异均不显著(P＞0.05).研究结果初步表明PRKDC基因G34126A多态位点的A等位基因是提高奶牛乳房炎抗性的一个潜在的DNA标记.     

荷斯坦牛酪蛋白基因两SNPs位点基因型组合对产奶性状的影响

采用PCR-RFLP、CRS-PCR和DNA测序技术,对435头荷斯坦牛的酪蛋白基因的外显子4和5上2个单核苷酸多态性(SNP)位点进行了研究.结果发现,在435头牛群中,共有8种基因型组合.单个SNP位点关联分析表明:T10996A突变位点3种基因型间TA基因型个体乳脂率极显著高于AA基因型个体(P<0.01),TA基因型个体乳蛋白率显著高于AA基因型个体(P<0.05).T12980C突变位点的3种基因型间TC基因型个体乳脂率极显著高于TT基因型个体(P<0.01),TC和CC基因型个体乳蛋白率显著高于TT基因型个体(P<0.05).T10996A/T12980C两种基因型组合分析中,在乳脂率上,TTCC基因型组合个体最高,TATC基因型组合个体位居第三位;在乳蛋白率上,TATC基因型组合个体显著高于AATT基因型组合个体(P<0.05).酪蛋白基因不同基因型和基因型组合与荷斯坦牛乳脂率和乳蛋白率存在相关性,但与产奶量和脂蛋白比不相关.     

中国荷斯坦牛TLR1基因SNPs快速筛查及蛋白功能预测

为探究中国荷斯坦牛Toll样受体1(TLR₁)基因与中国荷斯坦牛乳房炎抗性的关联性,以中国荷斯坦牛为试验对象,构建DNA混合池,采用PCR扩增和直接测序法对中国荷斯坦牛TLR₁基因进行单核苷酸多态性(SNP)检测,从而筛选出对中国荷斯坦牛免疫方面有显著影响的SNPs位点,同时应用在线软件对中国荷斯坦牛TLR₁基因编码的蛋白质进行功能预测。结果表明,中国荷斯坦牛TLR₁基因编码727个氨基酸,组成了一种不稳定的水溶性蛋白,蛋白质二、三级结构均以α-螺旋为主;PCR扩增后,在扩增片段处共发现8个SNPs位点,分别为A⁶¹T-TLR₁、C⁶³²A-TLR₁、C¹⁴⁰⁸T-TLR₁、C¹⁴⁵¹T-TLR₁、A¹⁴⁶¹G-TLR₁、A¹⁴⁷⁵C-TLR₁、G¹⁵⁵⁰A-TLR₁、G¹⁵⁹⁶A-TLR₁,其中A⁶¹T-TLR₁、C⁶³²A-TLR₁、C¹⁴⁰⁸T-TLR₁、A¹⁴⁶¹G-TLR₁、G¹⁵⁹⁶A-TLR₁属错义突变,分别由原来的赖氨酸(Lys)、苯丙氨酸(Phe)、丙氨酸(Ala)、异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)突变为甲硫氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile),SNPs位点的等位基因频率在突变前后均存在差异。DNA池结合直接测序技术检测到TLR₁基因8个SNPs位点,可作为中国荷斯坦牛乳房炎的遗传标记进行深入研究;蛋白质功能预测结果表明,有多种与免疫相关的因子几率较高。本研究结果为中国荷斯坦牛在分子领域的抗病育种提供了理论依据。     

钙调蛋白(CaM)对附植前小鼠胚胎热休克蛋白70(HSP70)表达的影响

体外培养的奶牛,绵羊和小鼠的附植前胚胎在热应激条件下能够合成热休克蛋白70以增强胚胎的耐热性保护其不受热损伤.而钙调蛋白(CaM)是细胞内最重要的Ca2+受体蛋白并参与细胞活动中重要基因的转录活动.本实验旨在研究CaM参与小鼠(Mus musculus)胚胎热应激诱导型热休克蛋白70(HSP70)的表达,且明确CaM参与HSP70表达的具体途径.将发育至早期囊胚的胚胎分成空白对照(37℃)组、W7处理非热应激(37℃+W7)组、热应激(39℃)组和W7处理热应激(39℃+W7)组.提取总RNA并分别检测HSP70、CaM和热休克转录因子1(HSFl) mRNA表达;提取胞浆蛋白用Western blot技术检测HSP70、CaM和HSF1表达;用免疫共沉淀法检测HSP70-CaM和HSP70-HSF1复合物.结果发现,W7能显著抑制39℃热应激1h小鼠胚胎HSP70 mRNA和蛋白的表达(P＜0.05); W7对其他各组胚胎HSF1mRNA表达的影响不显著(P＞0.05),但能显著降低39℃热应激1h小鼠胚胎HSF1蛋白表达(P＜0.05); 39℃热应激时,胚胎HSP70-CaM复合物增多,HSP70-HSF1复合物减少.本研究表明,小鼠胚胎受热应激时,CaM通过与HSP70竞争性结合,解离出HSF1,从而使HSP70大量表达.本研究揭示了CaM参与小鼠胚胎热激反应中HSP70表达的一种途径.可为研究胚胎耐热性以及热激信号转导提供基础资料.     

荷斯坦牛白细胞抗原基因-DRB3(BoLA-DRB3)外显子2多态性及其与体细胞评分的关系

采用PCR-RFLP技术,用限制性内切酶BstY I对河北省489头荷斯坦母牛和40头荷斯坦公牛白细胞抗原-DRB3基因(BoLA-DRB3)外显子2的284 bp扩增产物进行多态性分析.荷斯坦母牛经BsfY Ⅰ酶切产生3种基因型AA、AB和BB,其频率分别为0.078、0.380和0.542;荷斯坦公牛经BsfY Ⅰ酶切产生2种基因型AB和BB,其频率分别为0.250和0.750;荷斯坦母牛和公牛在该酶切位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(母牛:,P=0.799>0.05;公牛:,P=0.665>0.05);用最小二乘法分析BoLA-DRB3基因外显子2的多态性与荷斯坦母牛体细胞评分(somatic cell score,SCS)的关系,结果表明AA基因型SCS最小二乘均值极显著低于AB基因型所对应的值(P=0.0098<0.01),极显著低于BB基因型所对应的值(P=0.00009<0.0001);AB基因型SCS最小二乘均值极显著低于BB基因型所对应的值(P=0.0096<0.01);对乳房炎抗性,AA是最有利基因型,BB是最不利基因型.研究结果表明BoLA-DRB3基因外显子2的多态性是提高奶牛乳房炎抗性的一个潜在的DNA标记.     

奶牛GHR基因CRS-PCR多态性及其与产奶性状的关联分析

奶牛GHR基因CRS-PCR多态性及其与产奶性状的关联分析     

热胁迫对大豆花荚离层细胞HSP70基因表达、能量供应及花荚脱落率的影响

实验运用Northern blot检测和生理生化分析等技术研究热胁迫对大豆(Glycine max)品种花荚离层细胞的HSP70基因表达、能量供应及花荚脱落的影响。结果显示，热胁迫能够提高所有6个供试大豆品种花荚离层细胞的HSP70基因表达水平、线粒体及其蛋白含量以及细胞色素氧化酶表达量，而不同程度地降低了所有供试品种的花荚脱落率。结果说明，大豆花荚离层细胞HSP70基因的高效表达可能是通过有效地改善花荚离层细胞的能量供应，从而达到抑制花荚脱落的目的。关键词: 大豆；热胁迫；HSP70基因；线粒体；细胞色素氧化酶；花荚脱落率     

ipt基因促进矮牵牛遗传转化效率及热激启动子驱动基因删除

本研究主要探讨ipt基因对矮牵牛遗传转化不定芽诱导影响及拟南芥热激启动子hsp18.2驱动重组酶基因flp的热诱导外源基因删除表达载体在矮牵牛中的基因删除效果。本研究中将植物表达载体pBin-hsp18.2：flp-35S：ipt及对照载体pBin-hsp18.2：flp遗传转化矮牵牛,以获得转基因植株,分析比较不定芽的诱导和转基因植株进行的热激基因删除。研究结果表明,ipt基因可促进矮牵牛遗传转化过程中不定芽的诱导,其不定芽诱导率为21.5%,显著高于对照的8.7%。在44℃,6h,热激6次的条件下,转基因矮牵牛植株表型恢复正常,经GUS蛋白表达分析及PCR、RT-PCR检测,证明外源基因已经被删除。转基因矮牵牛基因删除效率最高可达43.8%。本研究为ipt基因在一些遗传转化困难植物转基因中的应用奠定了基础。     

天祝白牦牛HSP60基因的克隆及其在下丘脑-垂体-睾丸中的表达定位研究

热休克蛋白60(HSP60)不仅在细胞保护方面发挥作用,也参与雄性动物生殖生理的调控。为研究HSP60基因序列特性及其在天祝白牦牛下丘脑-垂体-睾丸轴(HPT-axis)上的表达情况,探寻其在白牦牛睾丸发育、精子发生过程中的作用机制,本研究采用RT-PCR和RACE技术获得白牦牛HSP60基因全长cDNA序列,采用生物信息学方法分析HSP60蛋白的理化性质、结构及不同物种之间的同源性等,并利用qPCR、Western blotting、免疫组化法分析HSP60在白牦牛下丘脑-垂体-睾丸轴中的表达及定位。结果表明,白牦牛HSP60基因cDNA全长为2 300 bp,开放阅读框为1 722 bp,编码572个氨基酸;其理论分子量为60.977k Da、等电点为5.69,编码的蛋白为非跨膜可溶性蛋白。氨基酸序列比对结果显示,白牦牛HSP60氨基酸序列与牛、瘤牛、绵羊、藏羚羊、骆驼、白犀牛、兔和黑猩猩的氨基酸序列同源性高、进化水平相近。HSP60基因及蛋白在白牦牛的下丘脑、垂体及睾丸组织中均有表达,其中下丘脑及垂体组织表达量显著高于睾丸,下丘脑和垂体之间差异不显著。免疫组化结果显示,HSP60蛋白定位表达于白牦牛下丘脑组织的室旁核大细胞、室旁核小细胞和神经角演网、垂体组织的腺细胞、睾丸组织的精原细胞、精母细胞、支持细胞和间质细胞,而精子细胞中表达较弱。通过对健康成年白牦牛HSP60在下丘脑-垂体-睾丸轴的表达与定位检测,推断HSP60参与雄性白牦牛生殖轴调控,并参与睾丸发育与精子发生。本研究结果为进一步研究HSP60对雄性生殖调控奠定了基础。     

玉米HSP70基因家族的全基因组鉴定与分析

热激蛋白70(HSP70)是生物体应答各种胁迫反应产生的一类蛋白,广泛存在于生物体中,在几乎所有的活细胞中都起着重要的作用。为全面解析玉米基因组HSP70基因信息,利用从Pfam数据库中下载的隐马氏模型文件PF00012在Gramene数据库进行基因搜索,并利用多种生物软件或在线工具对所鉴定的基因进行生物信息学分析。结果表明,试验共鉴定得到35个玉米HSP70基因,分别命名为Zm HSP70-1~Zm HSP70-35。这些基因不均衡地分布在玉米的10条染色体上,其中5号染色体上分布最多(6个),9号染色体上分布最少(1个)。进化树分析显示35个基因聚为6组,且同组基因具有相似的基因结构,其基序数量、类型和顺序也是相似的。物种间进化树分析不同物种的86个基因,存在8对直系同源基因和17对旁系同源基因,直系同源基因中7对存在于玉米和水稻之间,仅1对存在于水稻和拟南芥之间,说明起源于共同祖先基因的直系同源基因对虽在单/双子叶植物差异分离前就存在,但玉米与水稻间的进化关系要比与拟南芥间更为亲近。表达谱分析表明,大多数Zm HSP70基因属组成型表达,但表达模式和表达量不同。本研究结果为进一步研究玉米HSP70家族基因的功能奠定了理论基础。     

荷斯坦牛DRA基因多态性及序列特征分析

为探讨荷斯坦牛DRA基因的多态性及序列特征,本研究采用基因组DNA混合池扩增并直接测序的方法对荷斯坦牛DRA基因编码区进行多态性分析,同时利用生物信息学方法预测DRA基因的理化特性及其编码蛋白的高级结构。结果表明,荷斯坦牛DRA基因编码区上有4个碱基突变,包含1个错义突变和3个同义突变。DRA基因共编码253个氨基酸,编码产物是一种稳定的不可溶蛋白,具有15个潜在的磷酸化位点,二级结构为混合型,三级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成。本研究结果为荷斯坦牛的疾病相关基因筛选和抗病分子育种提供了一定的理论依据。