磺胺甲嗯唑单克隆抗体的研制及免疫金标试纸检测方法的建立

用磺胺甲嗯唑人工免疫原（BSA-SMZ）免疫BALB／C小鼠（Mus muscalus）,细胞融合技术筛选抗磺胺甲嗯唑单克隆抗体（SMZ mAb）杂交瘤细胞,体内诱生腹水法制备SMZ mAb,并鉴定其免疫学特性;应用SMZ mAb研制SMZ残留快速检测金标试纸（SMZ-strip）,并测定其性能。结果表明,筛选出3株杂交瘤细胞,其中最好的3G6株间接ELISA效价细胞培养上清为1：8.1×10^2,腹水为1：6.4×10^5,亲和常数（K=a）为3.07×10^9L／mol,对SMZ的半数抑制浓度（IC50）为12.4μg／L,与磺胺嘧啶的交叉反应率（CR％）为2.84％,与其它磺胺类药物无交叉反应;SMZ-strip目测检测限为6μg/L;其敏感性与竞争ELISA试剂盒相当,符合率为100％;SMZ-strip具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合于SMZ残留快速检测的推广应用。     

抗苯巴比妥单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及ciELISA试剂盒的研制

用BSA-pAPB免疫Balb/c小鼠，用细胞融合技术制备并用间接ELISA和阻断ELISA筛选抗苯巴比妥单克隆抗体(PB mAb)杂交瘤细胞株，体内诱生腹水法生产PB mAb，应用PB mAb研制PB残留竞争ELISA(ciELISA)快速检测试剂盒(PB-Kit)，并测定其性能。结果表明，筛选出3株杂交瘤细胞，最好的3F6-C4株的PB mAb间接ELISA效价为1∶6.4×105，亲和常数(Ka)为1.96×1010 L/moL，半数抑制浓度(IC50)为5.7 μg/L，与巴比妥的交叉反应率(CR%)12.4%，与其它化合物无CR；PB-Kit的线性检测范围1.0～81 μg/L，灵敏度0.75 μg/L，检测限1 μg/L；饲料样和猪尿样的平均添加回收率85.8%和91.3%，平均批内和批间变异系数均<15%。PB-Kit具有快速、敏感、特异、简便等特点，适合PB残留快速检测的推广应用。     

磺胺二甲氧嘧啶单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

用重氮化法将SDM(磺胺二甲氧嘧啶)偶联于载体蛋白BSA和OVA,合成免疫原BSA-SDM和包被原OVA-SDM,并用紫外扫描(UV)、SDS-PAGE进行鉴定;用BSA-SDM免疫BALB/C小鼠,间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术建立分泌SDM mAb细胞株,用体内诱生腹水法制备SDM mAb;对SDM mAb的效价、亲和性、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。结果表明,BSA-SDM人工抗原制备成功,分子结合比约为1∶12.1;筛选出1B43、D9、4E1共3株敏感特异的杂交瘤细胞,间接ELISA效价细胞培养上清分别为1∶3.2×102、1∶5.12×102、1∶8.1×102,腹水分别为1∶2.56×105、1∶2.56×1051、∶5.12×105,4E1亲和常数(Ka)为1.25×1010L/mol;4E1株对SDM的IC50为16.64ng/ml,与磺胺-6-甲氧嘧啶交叉反应率为5%,与其他磺胺类药物无交叉反应性。本试验获得了抗SDM高价、敏感、特异的mAb,可用于SDM残留检测的免疫学试验。     

抗恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及竞争ELISA试剂盒的研制

利用合成的完全抗原(BSA-ENR)免疫小鼠,通过细胞融合技术和间接竞争ELISA筛选出了能分泌恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以此为基础研制恩诺沙星残留检测的竞争ELISA试剂盒(competitive ELISA ENR-Kit),并测定其性能。结果表明:筛选出的2株杂交瘤细胞,单抗亚类均为IgG1型,其中4G1-B3株的ENR mAb间接ELISA效价为1:1.024×106,亲和常数(Ka)为9×1010L/mol;竞争ELISA试剂盒的线性检测范围为0.05~101.6μg/L、灵敏度0.05μg/L、半数抑制浓度(IC50)1.1μg/L,与其他化合物的交叉反应率(CR%)均小于0.01%,鸡肉样、鸡肝样、鱼肉样和牛奶样的平均添加回收率分别为81.5%8、7.6%、84.3%和95%,不同基质添加恩诺沙星标准品做竞争ELISA对ENR-Kit检测结果影响小,试剂盒保存期6个月以上。结果说明该竞争ELISA试剂盒具有快速、敏感、特异、简便等特点,适用于ENR残留的快速检测。     

莱克多巴胺单克隆抗体的研制及阻断ELISA检测方法的建立

用混合酸酐法将莱克多巴胺(RAC)偶联于牛血清白蛋白(BSA),合成免疫原BSA-RAC,并用紫外和凝胶电泳鉴定;用BSA-RAC免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立抗RAC单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备RAC mAb。应用RAC mAb研制RAC残留快速检测阻断ELISA试剂盒(RAC-Kit),并测定其性能。结果表明,BSA-RAC偶联成功,分子结合比为1∶24.5;筛选出3株杂交瘤细胞,其中最好的4D8株的亲和常数Ka为1.65×1010L/mol。RAC-Kit的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,线性范围为1~170μg/L,灵敏度为0.52μg/L,检测限为1μg/L,饲料样、猪尿样的平均添加回收率分别为91.1%和89.2%,平均批内和批间变异系数<15%,与多巴酚丁胺的交叉反应率为22.3%,与其他化合物无交叉反应,RAC-Kit在4℃可保存180d。     

抗链霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性鉴定

用EDC一步法和戊二醛法将SM偶联于载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和OVA,合成免疫原BSA-SM和包被原OVA-SM。用紫外线扫描、SDS-PAGE进行鉴定;用BSA-SM免疫BALB/C小鼠,用杂交瘤技术建立分泌SM mAb的细胞株3F9-C4;对SM mAb的效价、亲和性、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。结果表明,BSA-SM人工抗原分子结合比为1∶25;筛选出3F9-C4敏感特异的杂交瘤细胞1株,间接ELISA测定细胞培养上清,效价为1∶3.2×102,同种型为IgG2a/κ;腹水的亲和常数(Ka)为8.4×1011L/mol;IC50为8.99μg/L,与双氢链霉素交叉反应为109.6%,与其他SM结构相似物和功能近似物无交叉反应性。本试验获得了抗SM高价、敏感、特异的mAb,可用于SM的残留检测。     

土壤中磺胺类抗生素的检测方法优化及残留、降解研究

优化了磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺对甲氧嘧啶(SMT)、磺胺甲噁唑(SMZ)4种磺胺类抗生素的高效液相色谱(H PLC)检测方法,分析了广州市养殖场周边土壤中磺胺类抗生素的残留特征,并进行了2种磺胺类抗生素的土壤降解试验。结果表明,4种磺胺类抗生素分别在0.10~10μg ml-1范围内线性良好,相关系数R>0.99。确定了最佳提取液为甲醇:含EDTA的Mcllvain缓冲液=1∶1(V/V),4种磺胺类药物的检测限与回收率分别为2.9~4.7μg kg-1、83.6%～90.1%。广州市18个规模化养殖场周边土壤中磺胺类抗生素污染以SM2为主,含量为1.75μgkg-1,其它3种均未被检出。土壤中磺胺类抗生素的含量总体呈随培养时间而不断下降的趋势,SMZ的降解速率大于SM2。     

抗苯巴比妥单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性鉴定

苯巴比妥(PB)经化学修饰在其苯环上引入活性基团氨基,合成半抗原对氨基苯巴比妥(pAPB),用重氮化法将pAPB偶联于BSA,合成人工抗原BSA-pAPB,并用红外(IR)、紫外(UV)、SDS-PAGE鉴定;用BSA-pAPB免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立抗PB的单克隆抗体mAb(PB mAb)杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备PB mAb,并鉴定其免疫学特性。结果表明,BSA-pAPB偶联成功,偶联率为1∶19;筛选出1B9、3C4、3F6、4E6共4株杂交瘤细胞,其中最好的4E6株间接ELISA效价细胞培养上清为1∶8.1×102,腹水为1∶6.4×105,同种型为IgG1/κ,亲和常数(Ka)为2.08×1010L/mol,对PB的半数抑制浓度(IC50)为11.35μg/L,与巴比妥的交叉反应率(CR%)为12.4%,与其他化合物无CR。本试验研制出高效价、敏感、特异的PB mAb,可用于PB残留检测的免疫学实验。     

西马特罗杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体制备和鉴定

用重氮化法将牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）分别与西马特罗（CIM）偶联作为免疫原或包被原,用BSA-CIM免疫BALB/c小鼠,经过3次免疫后,OVA-CIM包被后用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、高敏感性和高特异性的小鼠进行抗原超强免疫;取脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌CIM单克隆抗体（Monoclonal antibody,mAb）的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备CIM mAb,对CIM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。结果显示免疫的6只小鼠血清抗体效价均达到10-3;融合后筛选出3B11-H4、2A11-G11和4F5-F11共3株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1∶800、1∶1600和1∶1600,腹水效价分别为1∶2.56×106、1∶1.02×107和1∶2.56×107,3B11-H4株对CIM的IC50为040ng/ml,与瘦肉精、莱克多巴胺等其他β2激动剂交叉反应性小于02%。本试验获得了高效价、敏感、特异的抗CIM mAb,为CIM残留ELISA检测试剂盒和试纸条的建立奠定了坚实的基础。     

喹乙醇单克隆抗体的制备及其免疫学特性的鉴定

通过质谱法鉴定合成喹乙醇-半琥珀酸酯(OLA-HS),紫外法及凝胶电泳法鉴定全抗原OLA-BSA和OLA-OVA后,使用杂交瘤技术制备喹乙醇单克隆抗体(OLA mAb),对其效价、亲和力、敏感性、特异性及亚型进行鉴定,并通过体内诱生腹水法进行大量制备。试验结果表明,本研究成功制备了OLA-HS,且半抗原与载体蛋白偶联成功;筛选出的5株杂交瘤细胞单抗同种型均为IgG1,细胞培养上清间接ELISA效价在1∶3.0×102～1∶1.28×103之间,用4E12细胞株制作的腹水效价为1∶5.12×105。OLAmAb亲和常数Ka为3.75×1010L/mol,对OLA的IC50为1.51ng/ml,且具有较好的特异性。试验获得了高效价、敏感、特异的OLA mAb,可用于动物性食品中OLA残留检测的免疫学试验。     

二氟沙星残留检测直接竞争ELISA试剂盒的研制及其性能测定

应用抗二氟沙星单克隆抗体（DIFmAb）杂交瘤细胞株建立直接竞争ELISA分析方法,研制出DIF残留快速检测试剂盒（DIF-Kit）并对其性能进行了测定。特异性试验结果表明与达氟沙星的交叉反应率为0.32％,与其它氟喹诺酮类药物和磺胺类药物无交叉反应,该方法对DIF的检测限可达到0.1µg/L,半数抑制浓度IC50为2.2µg/L,线性范围0.1～128µg/L, 平均批内和批间变异系数小于<15%。对牛奶、鸡肉分别添加0.4、2.0、10.0、50.0µg/LDIF标准品,平均回收率分别为89.3%和83.9%。DIF-Kit性能稳定,在4℃可保存6个月。DIF-Kit准确度高、重复性好、特异性强,适用于DIF残留快速检测的推广应用。     

特布他林杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体制备与鉴定

分别通过1,4丁二醚法和EDC法将特布他林偶联于载体蛋白BSA和OVA上,用BSA-TBL免疫BALB/c小鼠,经过3次免疫后,OVA-TBL包被后用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、高敏感性和高特异性的小鼠进行抗原进行冲击免疫;无菌手术取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合建立分泌TBL单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用体内诱生腹水法制备TBL mAb,并对TBL mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。结果显示,免疫的6只小鼠血清抗体效价均达到10-4;融合后筛选出4C08-G5和3H3-A02共2株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1∶800和1∶1600,腹水效价分别为1∶2.56×105和1∶1.02×106;4C08-G5株分泌的抗体对TBL的IC50为5.25ng/ml,与瘦肉精、莱克多巴胺等其他β2激动剂交叉反应性小于3%。本试验获得了抗TBL mAb,为TBL残留免疫检测方法的建立奠定了坚实的基础。