大豆EST-SSR标记开发及与Genomic-SSR的比较研究*

本研究对458220条大豆EST序列进行SSR搜索,共检测出EST-SSR序列39989条, 经拼接得到无冗余EST-SSR序列8190条,包括357种重复基元。其中二、三核苷酸重复基元类型居多,分别占无冗余EST总数的11.13%和16%,统计得到二核苷酸重复类型12种,三核苷酸重复类型60种。以含有简单重复序列的无冗余EST序列设计200对引物,其中148对引物有清晰且单一条带扩增产物,以30份大豆品种资源进行引物筛选,获得多态性引物31对。以21份大豆不同基因型的基因组DNA为模板选取30对显示多态性的大豆EST-SSR引物和30对大豆基因组SSR引物进行扩增,带型统计结果显示：大豆EST-SSR与基因组SSR在供试基因型间多态性指数均值分别为0.55 和0.44,二者揭示的多态性水平差异不大。从而说明利用生物信息学方法基于大豆EST开发SSR标记是切实可行的,大豆EST-SSR可以用于大豆遗传多样性分析,是大豆DNA分子标记体系的一个重要补充。     

杂交水稻种子纯度分子鉴定技术研究

为了鉴定杂交水稻种子的纯度,用49条ISSR引物时供试的5组三系杂交水稻F1和父母本进行扩增,结果28条引物能扩增出DNA带,随机选取其中3条引物用于指纹分析,3条ISSR引物共扩增出32条DNA带,其中多态性条带为27条,并将这些多态性条带进行聚类分析。     

利用AhMITE转座子分子标记鉴定花生杂交F_1代真假杂种

本研究以抗青枯病北方大花生栽培品种"日花1号"为父本,山东省花生研究所生物技术研究室选育的高油酸花生品种"花育963"以及高产品种"玫瑰红"、"14VS-13"、"花育33"、"花育50"、"14L123"为母本杂交获得的F_1代种子为材料,利用微型反向重复转座元件(miniature inverted-repeat transposable element,MITE)标记技术鉴定F_1代真杂种。从10对AhMITE引物中筛选出6对在杂交亲本中有清晰、稳定并具有明显差异条带的标记引物对F_1代进行杂种鉴定。每一个组合都使用两对AhMITE引物进行鉴定,实验结果相互印证,保证了结果的准确性。     

水稻相关序列扩增多态性反应体系的建立及其多态性位点在F2群体中的分离分析

建立了一套完整、稳定、高效的水稻相关序列扩增多态性(SRAP)反应体系,同时利用110对SRAP引物对水稻品种沈农606和丽江新团黑谷进行比较扩增,其中35对引物可以检测到多态性,约占所用引物的31.82%。用该35对引物进一步对上述两个品种配制的杂交后代的F2进行检测,共扩增出1683条带,平均每对引物48条带,其中多态性条带143条,平均每对引物4.09条多态性条带。有24个多态性位点在F2群体中的分离显著或极显著地偏离了理论比值而表现异常分离,比率为16.78%。这些偏分离位点中偏向沈农606基因型的有11个;偏向丽江新团黑谷基因型的有12个;仅有1个偏杂合体类型。卡方检验说明,标记位点的偏分离是配子体和合子体选择共同作用的结果。     

咖啡驼孢锈菌PCR分子检测体系的建立

由专性寄生菌咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)引起的咖啡叶锈病是影响咖啡产量的最主要真菌病害。为建立对咖啡驼孢锈菌具有高特异性、高灵敏度、易操作的分子检测方法,本研究通过对咖啡驼孢锈菌DNA核糖体转录间隔区ITS1~ITS4序列与其近源序列作多重比较分析,获得其特异性区域,并于特异性区域设计了1对引物Hv-ITS-F/R。利用该特异引物,通过对咖啡驼孢锈菌、咖啡褐斑病菌、咖啡锈菌重寄生菌、咖啡炭疽菌以及不同属其它真菌基因组DNA进行PCR扩增。结果表明:此引物对仅能从咖啡驼孢锈菌基因组DNA中扩增出396 bp的特异条带,对其它相似或相近的病原真菌则无扩增条带。灵敏度试验结果表明,在DNA水平上检测浓度可达10 pg/μL。进一步通过田间健康与疑似发病植株的检测,结果呈现出很好的应用前景。由此表明,该引物对能有效地用于咖啡组织中驼孢锈菌的检测。     

甘蔗褐锈病菌巢式PCR分子检测方法的建立

为建立甘蔗褐锈病菌巢式PCR分子检测方法,本研究利用真菌DNA内源转录间隔区通用引物ITS1/ITS4扩增甘蔗黑顶柄锈菌DNA,并对其扩增产物进行克隆测序,获得序列于NCBI网站进行比对分析,并于该序列多态性丰富区域设计了2对引物PM2F/R、PM3F/R。通过对同寄主不同病原菌、以及不同属的锈菌DNA进行PCR检测以验证引物的特异性。结果表明,在优化的单一PCR反应体系与程序条件下,2对引物均仅能从甘蔗黑顶柄锈菌中扩增出约474 bp和363 bp的特异条带,而从其它真菌DNA中均扩增不出任何条带。进一步将引物PM2F/R作为第一轮扩增引物、PM3F/R作为第二轮扩增引物进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达0.001 ng/μL,较常规PCR提高100倍。由此表明,依据本研究所设计的2对引物而建立的快速、灵敏、准确的甘蔗黑顶柄锈菌的检测技术,对病原菌的早期诊断、快速检测及病害流行学研究具有重要意义。     

稻螟赤眼蜂rDNA特异引物设计及诊断引物在赤眼蜂分子鉴定中的应用

 根据稻螟赤眼蜂(Trichogramma japonicum)的rDNA ITS2序列,利用软件Primer Premier 5.0设计出该寄生蜂的特异引物。通过PCR条件的优化,设计的引物能稳定地扩增出稻螟赤眼蜂的特异性条带,大小为256 bp。应用设计的稻螟赤眼蜂特异引物以及报道的松毛虫赤眼蜂(T. dendrolimi)、玉米螟赤眼蜂(T. ostriniae)和螟黄赤眼蜂(T. chilonis)特异引物对赤眼蜂样品进行PCR扩增分析。结果表明,4对特异引物可从单头蜂稳定地扩增出各自蜂种的目的DNA条带,并且分子鉴定结果与形态学鉴定结果完全一致。     

11个茶树品种遗传多样性的ISSR和TRAP比较分析

用12个ISSR引物和18个TRAP引物组合分别对11个茶树品种的基因组DNA进行扩增。ISSR引物共产生6l条带，多态性带占83．6％，遗传距离变化范围在0．231-0．707。TRAP引物共产生69条带，多态性带占79．7％，遗传距离变化范围为0．200～0．755。基于两种标记的聚类结果存在一定的差异，TRAP聚类结果能较好地体现供试品种的亲缘关系、地域特性和树型特点，与传统的基于形态特征建立的分类结果比较一致。     

橡胶树EST-SSRs发掘研究

随着橡胶树大量ESTs序列的产生,为EST-SSRs发掘提供了丰富的公共序列资源.本研究首先将11 809条橡胶树ESTs组装成3 932条非冗余序列,其中323条ESTs检索到SSRs 358个,SSRs出现的频率为9.1%.SSR重复单元共93种.其中二核苷酸重复(57.5%)、三核苷酸重复(26.0%)和六核苷酸重复(12.8%)占所有重复单元的96.3%.对323条SSR-ESTs进行特异扩增弓l物设计,共获得158对引物,对48份包括31份魏可汉种质、12份1981'野生种质、2份色宝橡胶、2份光亮橡胶和l份少花橡胶扩增,其中60对引物扩增出l条预期长度DNA片段,占所有设计引物的38%,并筛选到40对具有多态性的引物.EST-SSRs标记的发掘为巴西橡胶树分子辅助育种、种质资源功能遗传多样性分析等研究提供了良好的标记.     

云南超高产橡胶树的SSR、AFLP和TRAP分析

利用SSR、AFLP和TRAP3种分子标记对云南勐腊农场发现的2株超高产橡胶树云PR107、云RRIM501与正常产量单株(PR107、RRIM501)进行遗传分析,共筛选到具有多态性的SSR引物7对、AFLP引物28对和TRAP引物12对,3种标记分别检测到多态性条带9、94和21条,平均每对引物可分别检测到1.16、3.36和1.4条多态性条带,结果表明,2株超高产橡胶树的遗传组成均发生了改变。     

云南紫稻细胞质无花粉型三系及杂种F1的AFLP指纹图谱的构建与分析

利用AFLP分子标记对云南紫稻细胞质无花粉水稻三系及杂种F1进行了指纹图谱的构建与比较分析。从14对引物中筛选出8对具有明显多态性的引物。天香018（天香A×珞恢018)材料组（不育系、保持系、恢复系及杂种F1）共扩增出179条带,其中有52条多态性谱带,占总带数的29.05％,平均每对引物可以扩增出6.50条多态性谱带;天香806(天香A×珞恢806)材料组(不育系、保持系、恢复系及杂种F1）共扩增出177条带,其中有50条差异带,占总带数的28.25％,平均每对引物可以扩增出6.25条多态性谱带。特别明显的是在引物对E ATG/M CAC的扩增中,在AFLP指纹图谱中出现两条特征带（a带和b带）,为保持系所特有,能够明显区别于不育系、恢复系和F1。在另外一些引物对中也观察到不育系与保持系之间的差异带。     

利用RAPD和微卫星标记对协优杂交稻及其亲本进行区别与鉴定

选用400个随机寡核苷酸和40个荧光标记的微卫星引物对,对我国主栽的协优杂交稻组合及其亲本进行多态性分析。RAPD分析显示,400个随机寡核苷酸引物中,有364个能够在供试基因型材料中扩增出肉眼可见的DNA条带,其中28个显示扩增的多态性,这中间9个引物产生的13条多态性条带具有清晰、易分辨的特点,可以在供试的水稻组合与亲本之间,以及杂交组合之间进行区别和鉴定。微卫星分析指出,40对荧光标记引物中,13对引物产生的31条标记带,能够在供试基因型材料中显示稳定的多态性,且杂种表现为双亲的互补型。与RAPD相比,微卫星分析具有多态性强、精确性高和重复性好的特点。     

两系杂交稻亲本SSR指纹图谱的建立及其在种子纯度鉴定中的应用

利用筛选到的20对SSR引物建立了两系杂交稻32个亲本(24个光温敏不育系和8个恢复系)的DNA指纹图谱,针对所涉及的9个杂交稻组合,获得能在父、母本间表现出多态性的特异SSR标记48个.以杂交稻组合两优932为例,在实验室用一个特异SSR标记(RM302)对200粒种子样本进行了纯度鉴定,结果鉴定纯度为90.50%,与田间种植鉴定结果90.60%(海南鉴定)和91.57%(武汉鉴定)基本一致,表明SSR标记技术适用于构建DNA指纹图谱和种子纯度鉴定.     

粳稻近缘品种的SSR分析

 选用38对SSR引物，对16个日本优质米品种越光及其近缘品种进行了SSR标记分析。结果表明，有8对引物在品种间表现多态性，多态性引物检出率为21.1%，平均每对引物检测到2.25个等位基因。8个引物组合在一起，除了早喜光和日光2个品种不能区分外，其余品种均能有区别。多态性检出率亲本间为18.4%，越光及其衍生品种间为0~158%，表明近缘品种间多态性检出率较低。     

应用SSR分子标记鉴定超级杂交水稻组合及其纯度

 应用SSR分子标记技术对超级杂交稻5个组合（HYS 1/R105、培矮64S/E32、两优培九、88S/0293、J23A/Q611）及其9个亲本进行了鉴定。用144对SSR引物进行筛选，有47对能够在实验材料中显示较好的多态性，其中，RM337与RM154呈现丰富多态性，可鉴别供试组合并分别与其亲本区分开。对于水稻的每一条染色体，各筛选出两条产生多态性的引物，共24对，并提供一组作为鉴定参考的图谱；通过杂种表现为父母本互补带型的特点，找到在杂交稻组合及其亲本间具有多态性的引物，筛选出5对引物分别作为鉴定上述5个超级杂交稻组合的特异引物，进而针对杂交稻不同的纯度问题设计鉴定方法。     

Diversity Analysis in Selected Non-basmati Scented Rice Collection

Diversity analysis among 23 rice varieties including 16 non-basmati scented accessions, 5 basmati accessions and 2 non-scented accessions was performed by random amplified polymorphic DNA (RAPD) and inter-simple sequence repeat (ISSR) marker systems. The varieties analyzed by 11 RAPD and 8 ISSR primers yielded an average of 65% and 80% polymorphism, respectively. The average number of polymorphic bands generated per RAPD primer was 6 and per ISSR primer was 5.87. RAPD and ISSR data analysis individually could not segregate basmati and non-basmati scented rice accessions. However, the analysis using a combined data could group basmati and non-basmati scented rice accessions separately. The bands present specifically among three accessions of non-basmati scented rice were also identified. The study revealed a high genetic diversity among non-basmati scented rice accessions.     

Identification and Purity Test of Super Hybrid Rice with SSR Molecular Markers

Five super hybrid rice combinations, i.e. HYS-1/R105, Pei‘ai 64S/E32, Liangyoupeijiu (Pei‘ai 64S/9311), 88S/0293, and J23A/Q611, and their parental lines were tested by means of SSR analysis. A total of 144 SSR primer pairs distributed on 12 rice chromosomes were used, out of which 47 detected polymorphism among the tested rice lines. Among all these primers, RM337 and RM154 produced polymorphic patterns in four or more of the tested experimental materials respectively, and they could distinguish among most rice genotypes tested. Twenty-four primer pairs, two on each rice chromosome, were selected to make a reference SSR marker-based fingerprinting for the rice lines. For most of the primer pairs, F1 hybrids mainly showed complementary pattern of both parents, which could be very useful to distinguish the F1 from its parental lines. In addition, 5 primer pairs were selected as special primer pairs for five hybrid rice combinations respectively. By combining the rapid, simple method on DNA extraction, it is suggested that SSR technique has wide prospective in variety authentication and purity identification.     

太空诱变玉米雄性不育突变体的DNA-AFLP分析

利用AFLP标记及克隆测序技术对太空诱变玉米雄性不育突变体的基因组DNA进行分析,寻找与不育性状紧密连锁的分子标记。在供试的56对引物中,32对引物能够扩增出稳定、清晰的条带,4对引物能够在不育株和可育株之间扩增出多态性条带。通过对多态性片段的回收、克隆测序及序列分析结果表明,不育株特有的条带(Zmd1-302)与玉米基因组的克隆(AC187265)和玉米雄配子cDNA文库中的EST序列(gi33771201)同源性都很高,推测该片段和玉米太空诱变核不育之间的育性差异有关。将具有多态性的AFLP标记转化为SCAR标记,3对SCAR引物在8个不育单株和8个可育单株中均有扩增,通过聚丙烯凝胶电泳未检测到不育和可育之间的长度多态性,序列比对分析发现不育与可育之间存在多个单碱基差异。     

甜菜抗丛根病基因(Rz1)ISSR分子标记的初步研究

利用ISSR(简单重复间序列)技术对感病甜菜品种KVS3418及3个以KWS3418为轮回亲本的甜菜抗丛根病近等基因系进行分析，综合RAPD、SSR两种分子标记技术，经过多次重复，在一套ISSR引物中，筛选到与抗病性状相连锁的3个RAPD标记：Boya940、Boya800、Boya770。筛选到一个引物BA0061，在甜菜抗丛根病基因系间表现多态性。当用这个引物对已知的3个抗病材料及其它不舍此基因的感病材料进行检测时，多态性标记BA0061-1200，可从3个含抗丛根病基因的抗病材料中检测到1条12001bp的多态性带，而在其它感病材料中未出现。此标记可用于甜菜的分子育种。     

Optimization of a Reaction System of Sequence Related Amplified Polymorphism and Segregation of Polymorphic Loci in an F_2 Population of Rice

An effective PCR protocol for detecting the sequence related amplified polymorphism (SRAP) in rice was developed.One hundred and ten pairs of SRAP primers were used for segregation analysis in an F2 population derived from a cross between Shennong 606 and Lijiangxintuanheigu.Among the 110 primer pairs,35 pairs generated 143 polymorphic bands with an average of 4.09 polymorphic bands per primer pair,and 24 pairs (16.78%) showed the genetic distortion (P＜0.05).Of the 24 primer pairs,12 pairs deviated toward the male parent Shennong 606 and 11 pairs toward the female parent Lijiangxintuanheigu,only one toward heterozygote.It was found that the segregation distortion might be caused by the joint gametic and zygotic effects.