克氏原螯虾细胞色素c基因通过调节凋亡途径抑制WSSV感染

细胞凋亡是由一系列相关基因严格调控的细胞程序性死亡,在抵御病原入侵、维持机体内环境稳态等方面有着重要意义。其中细胞色素c从线粒体释放到细胞质中是凋亡开始的关键一步。本研究利用RACE技术首次克隆获得了克氏原螯虾(Procambarus clarkii)细胞色素c基因(PcCytc),全长为897 bp,包括163 bp的5′-UTR、419 bp的3′-UTR和315 bp的开放阅读框,编码104个氨基酸。定量PCR检测结果显示,PcCytc基因在克氏原螯虾的各组织中均有表达,其中在鳃、肠道和肌肉中表达高,在胃中表达最低。WSSV感染实验显示,在病毒感染后PcCytc在肝胰腺、肠道和肌肉组织中的表达水平均出现上调,并在24 h达最高值,约是此时PBS组表达量的2.65、2.07和2.20倍,均存在极显著性差异(P<0.01)。PcCytc基因干扰后,克氏原螯虾体内WSSV病毒拷贝数显著增加(P<0.05),表明PcCytc能够抑制WSSV在克氏原螯虾体内的复制,延迟感染;同时,凋亡相关基因bcl-2、bax和caspase-3的表达均发生显著上调或下调(P<0.05)。本研究表明,PcCytc可通过调节凋亡途径抑制WSSV感染,为克氏原螯虾对WSSV感染的免疫反应提供了新的见解。     

WSSV感染对克氏原螯虾血细胞吞噬和肝胰腺磷酸酶活性的影响

分析了克氏原螯虾Procambarus clarkia人工感染白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)后,其血细胞吞噬(Phagocytosis)活性,肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性的变化规律,其目的是为WSSV感染与螯虾的免疫防御反应等研究提供依据.分析结果显示,随着WSSV感染克氏原螯虾时间的延长,血细胞吞噬活性、肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性也随之改变,其中血细胞吞噬活性的变化规律性比较明显,可作为WSSV感染的敏感指标,也可以用作间接指示克氏原螯虾健康状况的指标.而在不同的感染时间,克氏原螯虾肝胰腺ACP与AKP的活性波动较大,无明显的规律可循,难以作为WSSV感染的敏感指标.     

养殖克氏原螯虾体内白斑综合征病毒的绝对定量分析

近年来克氏原螯虾的养殖受到WSSV的威胁,病毒在宿主组织中的绝对定量对于了解病毒的致病性具有重要意义,但克氏原螯虾组织中WSSV的绝对定量分布还有待研究。实验调查了湖北省5个主养区克氏原螯虾WSSV的感染率,结果表明80%以上克氏原螯虾都携带有WSSV。采用WSSV-VP28蛋白特异性抗体对克氏原螯虾提取蛋白进行Western Blot检测,在WSSV-PCR阳性样品中可检测到VP28特异性条带,在WSSV-PCR阴性样品中没有检测到相应条带。采用实验室建立的WSSV绝对定量PCR方法,对携带病毒的克氏原螯虾6个组织(鳃、胃、肠、血淋巴细胞、肝胰腺和心脏)进行检测。结果表明,在鳃、胃和肠可检测到较多病毒量(约108拷贝/mg),其次是血淋巴细胞(107拷贝/mg)、肝胰腺(106拷贝/mg),在心脏中病毒的含量最低(103拷贝/mg),表明病毒的复制存在组织特异性。结果显示WSSV主要存在于消化系统中,预示着克氏原螯虾可能主要在摄食过程中感染WSSV;不同地区克氏原螯虾组织病毒携带量表现出一定差异,预示着WSSV感染可能受到环境因素的影响。     

湖北省潜江地区克氏原螯虾白斑综合征PCR诊断及组织病理学观察

近年来在湖北省范围内人工养殖的克氏原螯虾暴发了严重的疾病,其中白斑综合征病毒(WSSV)已成为危害克氏原螯虾健康养殖的重要病原。2016年5月湖北省潜江市养殖区暴发了一种传染性疾病,为探究此次疾病病因和流行规律,将染病虾进行临床症状观察、对病料进行PCR检测、系统发育树分析、人工感染和组织病理学观察。结果显示,发病克氏原螯虾临床症状主要表现为摄食减少,活力下降,反应迟钝;组织病理学观察结果显示,克氏原螯虾的肝胰腺、肠、肌肉、鳃组织均出现不同程度变性和坏死以及炎性细胞浸润等典型病理学变化,与WSSV感染克氏原螯虾出现的病变相似;PCR检测患病克氏原螯虾样品,结果显示WSSV呈阳性,阳性检出率为55.56%(15/27),未检测到斑节对虾杆状病毒(MBV)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV);检测产物测序并进行系统发育树分析,结果显示,该基因序列与WSSV的EG3株(KR083866.1)核苷酸序列同源性为100%。将病虾的肝胰腺、肠和肌肉组织投喂健康克氏原螯虾,投喂组均表现为急性死亡(累积死亡率为100%),并出现与自然发病虾相同的症状。WSSV的巢式PCR检测结果显示,人工感染病虾为WSSV阳性。根据以上显示,本次养殖克氏原螯虾大规模死亡的病原是WSSV。     

红螯光壳螯虾(Cherax quadricarinatus)酚氧化酶原基因的克隆与表达分析

为深入了解红螯光壳螯虾酚氧化酶原(proPO)基因的非特异性免疫机制,利用RACE技术从红螯光壳螯虾血细胞中克隆到酚氧化酶原基因cqproPO,cqproPO基因cDNA全长为2 962 bp,开放阅读框为1 998 bp,编码665个氨基酸,其结构中含有两个铜离子结合位点,预测分子量为75.86 ku;同源性比对结果显示,红螯光壳螯虾CqproPO与克氏原螯虾酚氧化酶原的同源性最高为79％,其次是淡水螯虾74％、挪威龙虾69％、美国龙虾67％等;进化分析发现CqproPO与克氏原鳌虾、淡水螯虾、挪威龙虾、美国龙虾等的酚氧化酶原亲缘关系最近;Realtime-PCR实验结果表明,CqproPO在血细胞中表达水平最高,其次是肠、触角腺、鳃等;在肝胰腺中有适量表达;WSSV感染后红螯光壳螯虾CqproPO mRNA在血细胞、肝胰腺和鳃组织中具有不同的时空表达趋势,但感染组和免疫后感染组mRNA表达量分别在感染后12h和24 h达到最大值,且在3种组织中2个感染组的CqproPO表达量为对照组的1.3 ～2.55倍,显著高于对照组(P＜0.05),之后cqproPO基因的转录水平明显下降.免疫后再受病毒感染的虾,CqproPO mRNA的表达量在3种组织中总体高于感染组,感染7d后的免疫保护率达到51.86％,表明免疫增强剂可使机体的抗病毒能力增强,对防御WSSV感染具有一定的免疫保护作用.     

湖北省潜江地区克氏原螯虾(procambarus clarkii)白斑综合征(White Spot Syndrome)PCR诊断及组织病理学观察

近年来在湖北省范围内人工养殖的克氏原螯虾暴发了严重的疾病,其中白斑综合征病毒（WSSV）已成为危害克氏原螯虾健康养殖的重要病原。2016年5月湖北省潜江市养殖区暴发了一种传染性疾病,为探究此次疾病病因和流行规律,将染病虾进行临床症状观察、对病料进行PCR检测、系统发育树分析、人工感染和组织病理学观察。结果显示,发病克氏原螯虾临床症状主要表现为摄食减少,活力下降,反应迟钝;组织病理学观察结果显示,克氏原螯虾的肝胰腺、肠、肌肉、鳃组织均出现不同程度变性和坏死以及炎性细胞浸润等典型病理学变化,与WSSV感染克氏原螯虾出现的病变相似;PCR检测患病克氏原螯虾样品,结果显示WSSV呈阳性,阳性检出率为55.56%（15/27）,未检测到斑节对虾杆状病毒（MBV）和传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）;检测产物测序并进行系统发育树分析,结果显示,该基因序列与WSSV的EG3株（KR083866.1）核苷酸序列同源性为100%。将病虾的肝胰腺、肠和肌肉组织投喂健康克氏原螯虾,投喂组均表现为急性死亡（累积死亡率为100%）,并出现与自然发病虾相同的症状。WSSV的巢式PCR检测结果显示,人工感染病虾为WSSV阳性。根据以上显示,本次养殖克氏原螯虾大规模死亡的病原是WSSV。     

白斑综合征病毒感染克氏原螯虾后的PCR检测及组织病理学研究

采用投喂感染白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)对虾肌肉的方式,对养殖克氏原螯虾(Procambarus clarkii)进行人工感染,以确定WSSV对养殖克氏原螯虾的易感性。结果发现,投喂病虾感染组螯虾的死亡率达到90%,而对照组未出现死亡。采用PCR对试验组螯虾的肌肉进行WSSV检测,发现投喂感染组的阳性检出率为100%,对照组的阳性检出率均为0。PCR检测结果发现,濒死螯虾的肝胰腺、中肠、肌肉、鳃、性腺、心脏六种组织的PCR结果均为WSSV阳性,而对照组的各组织检测结果均为阴性。组织切片的光镜观察也证实,濒死螯虾的肝胰腺、中肠、肌肉、鳃、性腺、心脏及血淋巴等组织均发生了不同程度的病变。     

白斑综合征病毒(WSSV)对不同规格克氏原螯虾(Procambarus clarkii)致病力及ATPase活性的影响

以投喂患白斑综合征病毒病(WSSV)的南美白对虾组织的方法人工感染健康的克氏原螯虾,利用PCR检测实验克氏原螯虾的感染情况;同时比较健康的克氏原螯虾和感染病毒的克氏原螯虾体内ATPase活性.结果显示:白斑综合征病毒可以感染克氏原螯虾,受感染的克氏原螯虾体内病毒含量与其死亡呈正相关;健康的克氏原螯虾和感染病毒的克氏原螯虾体内的ATPase活性分别为7.337 U/mgprot和4.212 U/mgprot,有极其显著的差异.     

转录组测序筛选克氏原螯虾卵巢发育、免疫和生长相关基因

为发掘克氏原螯虾卵巢发育、免疫和肌肉生长的重要功能基因,采用Illumina HiSeq~(TM) 2 500高通量测序平台对克氏原螯虾的卵巢、肝胰腺和肌肉组织进行了转录组测序。所得序列经质控、组装后比对到NR、Swiss-Prot、pfam、COG、GO和KEGG数据库中注释,并进行差异基因聚类分析。结果显示,测序共获得了53 006个unigene,平均长度为1 194 bp。对3个组织样品的测序文库进行两两比较,发现在卵巢vs.肝胰腺中有差异表达基因(differentially expressed gene, DEG)20 382个,在肝胰腺vs.肌肉中有DEG 12 753个,在肌肉vs.卵巢中有DEG 21 629个。GO功能分类分析发现,部分DEG被注释到繁殖(reproduction)、繁殖过程(reproduction process)、免疫系统过程(immune system process)和生长(growth)GO条目。KEGG pathway分析显示,一部分DEG在卵巢发育、免疫和肌肉生长相关的信号通路中得到了富集。根据GO功能分类和KEGG信号通路分析筛选出了大量与克氏原螯虾卵巢发育、免疫和肌肉生长相关的候选基因,如卵黄蛋白原、卵黄蛋白原受体、Toll样受体2、Toll样受体相互作用蛋白、肌肉生长抑制素和5-羟色胺受体等。本研究结果丰富了克氏原螯虾的基因资源,可为克氏原螯虾的遗传育种和免疫研究提供基础数据。     

高温应激对克氏原螯虾免疫酶活性及抗WSSV感染的影响

为探明高温应激对克氏原螯虾(Procambarus clarkia)抗病力的影响,分别采用30℃和35℃水温进行高温应激试验,应激前和应激后3、6、12、24和48 h分别采集血淋巴样本,测定总超氧化物歧化酶(T-SOD)、多酚氧化酶(PPO)、溶菌酶(LYZ)、酸性磷酸酶(ACP)以及碱性磷酸酶(ALP)等免疫相关酶类指标。并在上述高温应激下开展白斑综合征病毒(WSSV)人工感染实验,同时设置25℃为阳性和阴性对照组,于感染后3、6、12、24、48、72 h取鳃组织定量测定WSSV在组织中的载量,同时记录克氏原螯虾的发病和死亡情况,统计累积死亡率。结果显示,克氏原螯虾血淋巴中的T-SOD与LYZ含量在高温应激后都出现了显著性降低,而PPO、ACP和ALP的变化差异不大。在35℃饲养条件下,WSSV在克氏原螯虾体内的增殖受到抑制,实验虾发病慢,累积死亡率相对较低,但在30℃饲养条件下,WSSV在克氏原螯虾体内的增殖较常温(25℃)下更活跃,发病和死亡更快。结果表明,高温应激能导致克氏原螯虾机体非特异性免疫力降低,30℃时能加快克氏原螯虾感染WSSV的发病进程,而35℃时因病毒复制被抑制而导致疾病的发展受阻。     

注射白斑综合征病毒对克氏原螯虾酚氧化酶活力的影响

将白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)、大肠杆菌(Escherichia coli)(DH5α)用注射法接种克氏原螯虾(Procambarus clarkii),在0~72 h之间定时检测克氏原螯虾血细胞和肝胰脏中酚氧化酶(Phenoloxidase,PO)活力变化。结果显示:(1)0.1 mg/m L和1 mg/m L胰蛋白酶处理样品后,样品间差异不显著。(2)加胰蛋白酶处理与未加胰蛋白酶相比,供试克氏原螯虾PO活力均升高。(3)未加胰蛋白酶与加胰蛋白酶表现出相似的特征,WSSV和Ah注射组与对照组相比均表现为,12~48 h PO活力显著高于对照组,并且在48 h达到最大值,72 h时基本恢复正常;注射DH5α组与对照组相比没有显著性变化。可见感染WSSV后,克氏原螯虾体内酚氧化酶活力发生了变化,由此推测,PO参与了螯虾体内抵御病毒的免疫反应。     

Oral vaccination trials with crayfish, Procambarus clarkii, to induce resistance to the white spot syndrome virus

The potential of oral vaccination against white spot syndrome virus (WSSV) in crayfish Procambarus clarkii was investigated. The protective effect of binary ethylenimine (BEI)-inactivated WSSV was tested by oral vaccination, followed by an oral challenge with WSSV. The crayfish fed with feed pellets coated with BEI-inactivated WSSV showed a resistance to WSSV on the seventh day post vaccination (dpv). The relative percentage survival values were 60%, 70% and 75% for the vaccinated once, twice and thrice with inactivated WSSV. Following an intramuscular injection experiment, no mortality was recorded in the inactivated WSSV group and the negative control at 17 days post challenge. The cumulative mortalities in the heated WSSV group and WSSV group were 100%. Shrimp that survived the WSSV challenge on the seventh day after cessation of oral vaccination were positive for the presence of WSSV by a polymerase chain reaction assay specific for WSSV. This result indicated that inactivated WSSV could protect crayfish against WSSV by oral delivery.     

日本沼虾细胞自噬基因ATG13和ATG101的克隆及其低氧胁迫下表达分析

为研究自噬相关基因(autophagy-related genes, ATG) ATG13和ATG101在甲壳动物应答低氧胁迫过程中的调节作用,实验采用RACE PCR技术通过克隆测序和基因序列拼接,首次克隆了日本沼虾的细胞自噬基因ATG13和ATG101的全长cDNA序列,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13 cDNA全长2 043 bp (NCBI登录号为MT084347),包括211 bp的5′末端非翻译区(untranslated region,UTR),449 bp的3′UTR和1 383 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),开放阅读框编码460个氨基酸;ATG101 cDNA全长1 051 bp(NCBI登录号为MT084348),包括18 bp的5′末端非翻译区,373 bp的3′UTR和660 bp的开放阅读框,开放阅读框编码219个氨基酸。通过软件和生物信息网站对其序列进行分析,氨基酸相似度比对显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13富含高度保守的LC3作用结构域(LIR);系统进化树分析显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13与凡纳滨对虾ATG13具有最近的亲缘关系;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)实验分析发现,日本沼虾ATG13和ATG101在其肝胰腺和脑组织表达量较高,而在肌肉中表达量较低;利用qRT-PCR追踪其在肝胰腺组织低氧胁迫过程中出现的表达差异情况,结果显示,实验组日本沼虾在低氧胁迫6和24 h时,其细胞自噬基因ATG13和ATG101表达量显著高于对照组,而在复氧12 h后,实验组与对照组的ATG13和ATG101表达量差异不显著;Western blot分析结果显示,日本沼虾ATG13和ATG101表达丰度基本与基因表达模式相似。透射电镜分析结果显示,在低氧胁迫6和24 h后,肝胰腺组织中的溶酶体开始出现自噬空泡,表明急性低氧胁迫会诱导自噬体的形成,本研究结果可为了解日本沼虾应对低氧胁迫下的调控机制提供理论参考。     

克氏原螯虾卵黄蛋白原受体cDNA部分序列的克隆及mRNA表达量的相对定量

从成熟的克氏原螯虾卵巢中提取总RNA,通过同源克隆得到了卵黄蛋白原受体c DNA部分序列,长度为506 bp,在NCBI网站上进行比对后发现,其与斑节对虾、短沟对虾、罗氏沼虾的卵黄蛋白原受体(Vg R)c DNA序列有较高的相似性。采用实时荧光定量PCR方法,测定了卵巢不同发育时期卵巢和肝胰腺两个组织中卵黄蛋白原受体m RNA的相对表达水平。结果显示,卵巢是卵黄蛋白原受体基因表达的主要部位,而肝胰腺只能检测到少量表达,卵黄蛋白原受体基因在卵巢的卵原细胞增殖期相对表达量最高,随后下降,成熟期达到最低值,恢复期开始回升。结合卵巢不同发育阶段卵巢质量的变化计算表达总量,结果发现,卵黄蛋白原受体基因的表达总量在卵原细胞增殖期为最低,随后持续升高并至成熟期达到峰值,恢复期急剧下降,但仍略高于卵原细胞增殖期的表达量。此外,运用所构建的系统进化树比较了克氏原螯虾Vg R m RNA与其他物种间的遗传距离。     

常规PCR与巢式PCR法快速检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)

对传统对虾白斑综合征病毒(WSSV)的PCR检测方法中的病毒模板DNA的提取方法加以改进,建立了一种快速检测克氏原螯虾(Procambarus clarkii)WSSV的PCR方法。本方法将克氏原螯虾肝胰腺组织匀浆液冻融3次进行差速离心后,在病毒沉淀中加入50μL蛋白酶K溶液,室温消化5 min,沸水中煮10 min后,10000 r/min高速离心5 min即可取上清液用于PCR扩增,结果显示:与传统的病毒模板DNA提取方法相比,本方法的PCR结果特异性强,扩增效率高,准确率高,可应用于快速大规模检测克氏原鳌虾中的WSSV。     

Response of crayfish, Procambarus clarkii, haemocytes infected by white spot syndrome virus

White spot syndrome virus (WSSV) is a serious pathogen of aquatic crustaceans. Little is known about its transmission in vivo and the immune reaction of its hosts. In this study, the circulating haemocytes of crayfish, Procambarus clarkii, infected by WSSV, and primary haemocyte cultures inoculated with WSSV, were collected and observed by transmission electron microscopy and light microscopy following in situ hybridization. In ultra-thin sections of infected haemocytes, the enveloped virions were seen to be phagocytosed in the cytoplasm and no viral particles were observed in the nuclei. In situ hybridization with WSSV-specific probes also demonstrated that there were no specific positive signals present in the haemocytes. Conversely, strong specific positive signals showed that WSSV replicated in the nuclei of gill cells. As a control, the lymphoid organ of shrimp, Penaeus monodon, infected by WSSV was examined by in situ hybridization which showed that WSSV did not replicate within the tubules of the lymphoid organ. In contrast to previous studies, it is concluded that neither shrimp nor crayfish haemocytes support WSSV replication.     

白斑综合征病毒江苏分离株变异区和缺失区基因的序列比较

为了解白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)在养殖克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中的感染流行情况和分子流行病学特征,以及探讨不同病毒株间的遗传进化差异,2008年7月至2010年6月在江苏各主要克氏原螯虾养殖产区共采集了83份样品,应用环介导等温扩增技术(LAMP)检测42份样品为病毒感染阳性,阳性率达50.6%。在此基础上考虑地理和时间因素选取了兴化、盱眙等地的6份样品,PCR扩增、克隆了样品中所携带病毒的变异区和缺失区基因并对其进行了测序。分析结果显示,在变异区除兴化毒株为1 829 bp之外,其余各分离株间差异微小,均在1 440 bp左右;而在缺失区各毒株大小均为384 bp,且核苷酸序列完全一致。随后将各分离株序列与GenBank已公布的毒株做进一步的序列比较分析,结果表明在江苏境内流行的兴化毒株与其余毒株间存在明显差异,在遗传上相距较远,并且推测WSSV变异区和缺失区可能是各自独立进化变异的;同时,缺失变小的病毒基因组更易于适应宿主和环境的变化。