黄瓜花叶病毒壳蛋白基因转化辣椒及其在转基因株后代的表达

借助二元Ｔｉ载体系统，用农杆菌与子叶外植体共培养，进行黄瓜花叶病毒壳蛋白基因转化三个辣椒品种的工作。经过抗卡那霉素的筛选和再生培养，得到转基因株。转基因株叶的切片在含卡那霉素的培养基上表现明显的抗性，经过对后代植株的ＤＮＡ和ＲＮＡ分子杂交以及蛋白质ＥＬＩＳＡ检测表明转基因株后代染色体上带有ＣＭＶｃｐ基因，后者在叶片中表达出ＣＭＶｃｐ。经过对表达植株叶面接种ＣＭＶ病毒，表现出明显的抗ＣＭＶ病毒的性能     

菜豆几丁质酶基因转化马铃薯及后代表达

通过农杆菌侵染和原生质体直接转化法把菜豆几丁质酶基因导入到马铃薯加工品种大西洋中,获得了13株转化后代,经过PCR分析和Southern blot分析,在5株后代中扩增出900bp目标带,说明菜豆几丁质酶基因已整合到马铃薯四倍体基因组中。RT-PCR分析结果表明,其中的3株叶片中有菜豆几丁质酶基因的表达,而且抗病试验进一步证明了该基因在叶片中有较强的表达强度,转基因植株的抗病性比对照提高了30%以上。     

应用玉米核糖体失活蛋白基因改善马铃薯对立枯丝核菌抗性

为探索在马铃薯中表达玉米源核糖体失活蛋白基因(RIP)是否可以改善受体对真菌病原立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的抗性,本研究以根癌农杆菌菌株LBA4404(p2301-RIP)转化马铃薯易感品种"Favorita"并进行了目的基因表达的分子生物学鉴定和对R.Solani的抗病性鉴定。结果表明:卡那霉素抗性再生株系的基因组中扩增到了目的基因,经Southern印记分析证实各独立转化株系基因组中均整合了2个拷贝RIP基因;RT-PCR分析表明RIP基因在转录水平正常表达;酶促活性测定表明部分转基因植株蛋白提取物具有RIP基因产物应有的脱嘌呤活性;温室盆栽试验证实有1个转基因株系显著提高了对由R.Solani引起的马铃薯黑痣病的抗性。     

宁夏地区马铃薯X病毒分离及其CP基因克隆

马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)对马铃薯生产影响较大,不同区域内PVX存在多样性和株系差异。本研究通过指示植物法和分子生物学鉴定法,从宁夏隆德县区域内的感病马铃薯上分离到一株马铃薯X病毒(PVX-NX1)。利用RT-PCR技术,克隆该病毒的外壳蛋白(CP)基因,序列分析结果表明,CP基因全长714 bp,编码237个氨基酸残基,与已报道CP基因的核苷酸序列同源性为72.42%~97.34%,氨基酸序列同源性为91.53%~100%。其中,与荷兰分离物X3(属PVX的X3株系)、中国新疆的核苷酸序列同源性分别为96.36%、97.34%,氨基酸同源性均为100%。初步确定PVX-NX1属PVX的X3株系。     

花粉管通道法转化大豆的分子表征

采用花粉管通道技术将含有gus基因的pBI121质粒DNA导入辽豆14，从处理的100朵花中获得53粒种子。经PCR检测53粒种子的幼苗，共检测出6株阳性植株。采用RT—PCR和GUS组织化学染色法对所获得阳性植株进行检测，其中2株幼苗(T0代17号和33号)均出现阳性结果，进一步对这2株阳性植株进行Southern blot检测，同样获得了阳性结果。上述检测结果表明，gus基因已整合到染色体上并得到了表达。对转基因植株后代进行了PCR跟踪检测，结果从17号株系的28株中检测出19株阳性植株，33号株系的35株幼苗中检测出17株阳性植株，表明gus基因可以在转基因植株后代遗传。本研究结果为大豆花粉管通道转化技术提供了比较充分的分子生物学证据。     

对转蚕丝芯蛋白轻链基因棉花的分析

利用根癌农杆菌介导转化法,将棉纤维特异表达启动子GAE6-3A驱动的蚕丝芯蛋白轻链基因（FBN）转入陆地棉R15中。T₀代转基因再生株FNB基因PCR检测阳性率达70%。随机选取4个转基因株系T₁代材料的Southern杂交显示,3个为双拷贝插入、1个为单拷贝插入;Northern分析结果证实FBN基因在转基因棉纤维中表达。转基因后代的纯合选育主要以田间卡那霉素检测结合实验室内GUS组织化学检测进行,其中4个株系已获得了T₃代转基因材料,其他若干个转化子也获得T₁代和T₂代的不同材料。对6个转基因棉花株系后代纤维检测结果表明,蚕丝芯蛋白轻链基因对棉花纤维品质的影响主要体现于对纤维强度的改良。H18、H32、H34株系转基因棉花后代纤维强度较对照显著提高,其中H18纤维强度提高12.3%。     

农杆菌介导的马铃薯试管薯遗转化体系的优化及反义class Ⅰ patatin基因的导入

用两个马铃薯栽培品种“鄂马铃薯3号”和“甘农薯2号”的试管薯为供体材料，建立了一种农杆菌介导的简单、快速和高效的遗传转化系统。在含有75mg／L卡那霉素的选择培养基上，2～3周可产生抗性芽，4～5周获得完整的转基因植株。筛选出了试管薯遗传转化的优化条件，特别是在再生培养基中加入2mg／L玉米素，两个品种的转化频率分别高达45．5％和43．9％。周期短(4～5周)、一步培养和转化频率高，使该转化体系能够广泛用于马铃薯转基因的研究。用含有反义class Ⅰ patatin基因的表达载体pBSAP转化两个品种，共获得120株卡那霉素抗性植株。PCR、PCR-Southern和Northern杂交分析证明，此反义基因已整合到马铃薯基因组中并在转基因植株中正常转录。反义基因的表达导致部分转基因植株的试管结薯株率和单株结薯数降低。结果表明，该class Ⅰ patatin基因可能参与了块茎形成的调控。     

马铃薯X病毒25 kD运动蛋白基因和外壳蛋白基因介导的抗病性研究

以马铃薯X病毒（potato virus X,PVX）的RNA为模板,应用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法分别扩增出长度为681 bp的非翻译马铃薯X病毒25 kD运动蛋白基因（PVX-p25）和长度为714 bp的非翻译马铃薯X病毒外壳蛋白基因（PVX-CP）。并分别构建植物表达载体pROKⅡ-p25和pROKⅡ-CP。利用农杆菌介导方法转化烟草NC89。经卡那霉     

马铃薯锌转运蛋白基因StZIP12调控锌吸收功能

马铃薯作为世界第四大粮食作物,是全球2/3人口的主食,是锌生物强化策略的重要目标作物,因此研究马铃薯锌吸收具有重要作用。锌转运蛋白调节植物锌吸收过程。本研究在前期研究基础上克隆了马铃薯锌转运蛋白基因StZIP12,定量PCR结果表明该基因在马铃薯各组织中均有表达,在新叶中表达量显著高于其他组织,且受到低锌诱导表达;利用异源酵母互补试验证实了StZIP12能够恢复锌吸收障碍酵母突变体ZHY3(zrt1zrt2)的锌吸收功能;利用转基因手段过表达StZIP12于马铃薯品种鄂薯3号,在缺锌处理下,与非转基因对照植株相比较,过表达StZIP12提高了转基因马铃薯株高,转基因组培苗的根长和总锌含量以及盆栽转基因植株块茎的锌含量增加,其中2个株系块茎锌含量分别比对照提高22.00%和32.95%。以上结果证明了StZIP12在马铃薯锌的吸收过程中起着重要调节作用,为马铃薯锌生物强化提供了理论依据。     

转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因稳定遗传和高效表达及抗虫性研究

通过对转Bt杀虫蛋白基因油菜植株的后代进行卡那霉素抗性分析和PCR技术检测,结果表明:Bt杀虫蛋白基因是以单拷贝、 杂合地整合到转基因植株(T01、 T02、 T03、 T05、 T06、 T07、 T08)的基因组中,并稳定地遗传.ELISA检测表明:在第3～第9叶期Bt杀虫蛋白基因在转基因油菜植株中高效地表达,Bt杀虫蛋白的表达量为170～260 ng/25 m     

马铃薯Y病毒siRNA介导抗病基因工程研究进展

马铃薯病毒病是危害马铃薯生产的重要因素,尤其马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)严重影响马铃薯产量和品质,为防治带来很大困难。近年来,通过基因工程技术培育抗病毒转基因植株为抵抗PVY侵染提供有效途径。简述了目前PVY病毒siRNA介导抗病基因工程的主要方法策略,包括PVY不同功能基因介导的病毒抗性差异、影响PVY抗病毒基因工程效率的主要因素以及PVY不同株系联合抗病基因工程研究概况,分析了这些方法存在问题及发展趋势,旨在为更好地控制PVY危害提供借鉴。     

马铃薯A病毒RT-LAMP检测方法的建立

马铃薯A病毒(potatovirusA,PVA)是一种侵染马铃薯的病毒,严重影响马铃薯的经济价值和产量,为有效防止该有害生物的传入和扩散,建立马铃薯A病毒RT-LAMP检测方法,根据PVA的外壳蛋白基因序列设计RT-LAMP反应的特异引物,通过实验成功建立了PVA的RT-LAMP特异性检测方法。该方法检测快速,36min即可检测到扩增曲线;特异性强,可有效区分同样侵染马铃薯的马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯V病毒(PVV)、马铃薯Y病毒(PVY)以及同属的百合斑驳病毒(LMoV);灵敏度高,比普通RT-PCR灵敏度高10倍;并可通过肉眼观察浊度或颜色反应直接进行结果判断。该方法适用于现场PVA的快速检测。     

惠州马铃薯卷叶病毒病原分子鉴定及序列分析

对广东省惠州市疑似感染马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的病株毒源进行分子生物学鉴定,为广东省马铃薯卷叶病的防治提供参考。依据CP基因设计的一对特异引物,以马铃薯总RNA为模板,应用RT-PCR技术,成功扩增出336bp的DNA片段。用BLAST对序列进行同源性分析,用Clustal X构建PLRV的聚类图。结果表明:4个惠州PLRV不同分离物的DNA序列和氨基酸结构具有高度同源性,惠州PLRV分离物与国内外13个PLRV分离物具有高度同源性。广东省惠州市的疑似病株确定为感染PLRV的马铃薯病株。     

利用类甜蛋白基因诱导表达提高马铃薯对晚疫病的抗性研究

将类甜蛋白基因 (TLP)及其紧密连锁的抗除草剂bar基因以农杆菌介导法导入脱毒微型种薯“津引薯 8号” ,经除草剂筛选后的转基因单株无性繁殖用于分子检测 ,标记基因bar基因的PCR反应和含TLP基因特异探针的Southern检测结果 ,转基因植株分别显示出 0 54kb和 3 0kb的特异性条带 ,证明TLP基因已成功地整合到转基因马铃薯基因组中。利用TLP基因特异性抗血清对转基因植株进行Western反应检测 ,结果表明 ,转基因植株中TLP基因表达量显著高于对照组 ,经晚疫病菌游离孢子接种离体抗性分析 ,转基因株系表现出对晚疫病的明显抑制作用和症状发生的延迟作用     

转甜菜碱醛脱氢酶基因马铃薯的抗旱耐盐性

通过根癌农杆菌介导法将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入马铃薯栽培品种甘农薯2号, 经PCR、Southern杂交和Northern杂交证明BADH基因已整合到马铃薯基因组中并在转基因植株中转录和表达。测定表明对照植株没有BADH酶活性, 各转化株系在胁迫前后BADH酶活性近似, 在2~11 U之间。BADH酶活性与叶片的相对电导率呈一定的负相关(y= –3.7738x+57.083, r=0.989^**)。在NaCl和PEG胁迫下, 转基因植株生长正常, 株高比对照提高0.41~1.00 cm, 单株重量比对照增加10%~35%, 说明外源BADH基因的导入提高了马铃薯植株对干旱和盐碱的抗性。     

转甜菜碱醛脱氢酶基因马铃薯的抗旱耐盐性

通过根癌农杆菌介导法将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入马铃薯栽培品种甘农薯2号, 经PCR、Southern杂交和Northern杂交证明BADH基因已整合到马铃薯基因组中并在转基因植株中转录和表达。测定表明对照植株没有BADH酶活性, 各转化株系在胁迫前后BADH酶活性近似, 在2~11 U之间。BADH酶活性与叶片的相对电导率呈一定的负相关(y= –3.7738x+57.083, r=0.989^**)。在NaCl和PEG胁迫下, 转基因植株生长正常, 株高比对照提高0.41~1.00 cm, 单株重量比对照增加10%~35%, 说明外源BADH基因的导入提高了马铃薯植株对干旱和盐碱的抗性。     

Inheritance and stability of the virus-resistant gene in the progeny of transgenic sweet potato

Viral diseases of sweet potato are very prevalent and often seriously damaging to the plants. In particular, the severe strain of the sweet potato feathery mottle virus (SPFMV‐S) causes ‘obizyo‐sohi’ disease in Japan. In order to confer viral resistance against SPFMV using current biotechnology, a transgenic sweet potato has been produced, introducing hygromycin‐resistant (hpt) and SPFMV‐S coat protein (CP) genes, which have shown a significant resistance to SPFMV‐S. In the breeding programme, it is important to confirm that the viral resistance conferred in T₀ plants can be inherited by their progeny. In the present study, progeny were obtained from crosses between the transgenic T₀ and a non‐transgenic variety of sweet potato. The results showed that the CP gene was inherited by the next generation and that the stability of viral resistance was also confirmed. Thus, this production system for the virus‐resistant transgenic sweet potato is useful in practical breeding.     

马铃薯抗晚疫病基因工程育种研究

通过改进外植体处理方法、添加乙酰丁香酮提高外植体芽分化频率、筛选芽分化培养基中激素浓度和确定转化后再生体系的筛选物质及其使用浓度等方法建立和优化了马铃薯脱毒微型种薯的根癌农杆菌遗传转化体系。利用该体系将水稻类甜蛋白基因和水稻几丁质酶基因导入津引薯8号脱毒微型种薯中,并获得转基因株系。通过PCR和southern杂交分子检测,证明ZGY-298,ZGY-283和ZGY-3013个株系均整合了这2个基因。采用晚疫病主要生理混合小种温室活体接种和离体接种进行抗病性分析表明,在晚疫病发病高峰期(接种后5～6d),转基因株系对晚疫病抗性明显高于对照品种,并可使病情蔓延推迟2～3d。