短芒大麦DREB1转录因子的克隆与特性分析

【目的】克隆强抗寒性牧草——短芒大麦DREB1(dehydration responsive element binding protein 1)转录因子,分析其生理生化特性,为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定理论基础。【方法】利用RACE-PCR(Rapidamplification of cDNAends-polymerase chain reaction)技术分离短芒大麦DREB1转录因子全长cDNA序列,North-ern杂交和凝胶滞留试验分析其在逆境条件下的表达情况,及其与DRE(dehydration responsive element)元件的结合活性。【结果】从强抗寒性短芒大麦中成功分离了1个新的DREB1类转录因子HbDREB1,该基因全长899 bp,其蛋白序列中含有1个典型的AP2/EREBP DNA结构域及"PKK/RPAGRxKFxETRHP"和"DSAWR"、"LWSY"3个DREB1特征标签序列;序列比对分析表明,HbDREB1与其他植物的DREB1类转录因子的同源性较高。HbDREB1在转录水平上明显受冷胁迫诱导表达,具有结合DRE-顺式作用元件的功能及作为转录因子必备的核定位特性。【结论】HbDREB1基因参与了非生物胁迫信号转导,具有提高植物抗寒性的潜能。     

紫大麦草中DREB类转录因子基因Hvi917DREB2的克隆、原核表达及序列分析

DREB类转录因子是一类与植物逆境胁迫响应相关的重要蛋白,本研究利用同源克隆方法和RACE技术从紫大麦草(Hordeum violaceum)中分离到1个DREB类转录因子基因,命名为Hvi917 DREB2。序列分析表明Hvi917 DREB2基因含有1个792bp的开放阅读框,编码264个氨基酸残基,含有1个保守的AP2结构域,属于AP2大家族。该基因编码的氨基酸序列与Genebank中短芒大麦草AP2蛋白HbDREB2、DREB1(登录号分别为:AAU29412.1和AER42620.1)具有99%的氨基酸序列一致性。将该基因构建成原核表达载体,经IPTG诱导表达了1个分子量为34.5kD的蛋白。     

短芒大麦DREB2基因的克隆及其转基因烟草的鉴定

以短芒大麦为材料,应用RT-PCR技术扩增获得792 bp的DREB2基因,构建了重组植物表达载体pBI-DREB2。通过农杆菌转化法将其导入烟草,并利用PCR、PCR-Southern和RT-PCR技术对获得的20株卡那霉素阳性转基因烟草进行分子鉴定。结果表明:短芒大麦DREB2基因已整合到烟草基因组中,并能在转录水平上表达。     

茶陵野生稻DREB类转录因子的克隆及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术获得了茶陵野生稻DREB类转录因子的cDNA全长.序列分析表明,此基因核苷酸序列全长为958bp,编码314个氨基酸,该序列与水稻DREB基因的同源性为98%.其编码的蛋白与小麦CRT/DREB4蛋白的同源性为93%,与大麦CBF2A蛋白和CBFIVc-14.1蛋白的同源性分别为93%和92%.推导蛋白第43～112位氨基酸为典型AP2结构,具有AP2/DREB类转录因子的基本结构特征,并构建了茶陵野生稻DREB基因的植物表达载体pWM101DREB.     

长柄扁桃ApDREB基因的克隆与序列分析

DREB是存在于植物中的一类比较重要的转录因子,调节和控制一些与非生物胁迫相关的基因的表达,帮助植物提高抵抗逆境胁迫的能力。笔者研究从长柄扁桃体内克隆到一种DREB转录因子基因并进行了序列分析。结果表明:克隆得到的c DNA序列是长柄扁桃的一种DREB基因序列,命名为Ap DREB,该c DNA序列全长为705 bp,包含一个690 bp的最大开放读码框,编码230个氨基酸。通过序列比对,发现Ap DREB的N端具有典型的AP2结构域,且该结构域与其他高等植物DREB类转录因子的AP2保守结构域的同源性很高。发现了8种不同的Ap DREB基因的DNA序列,并编码6种氨基酸序列,有两对DNA序列编码相同的氨基酸序列。进化树分析结果表明我们克隆到的六种Ap DREB转录因子聚在一起,成为一支,说明它们的亲缘关系最近,它们与梅、巴旦木、杏、樱桃的DREB转录因子具有相对较高的同源性,亲缘关系较近,这与它们在系统分类上同属蔷薇科是一致的,黑杨由于属于杨柳科,所以与上述DREB转录因子的亲缘关系最远。从结构分析结果推测Ap DREB基因与其它蔷薇科植物的DREB基因的在功能上具有相似性。     

细叶百合DREB转录因子生物信息学及胁迫应答表达分析

DREB转录因子是AP2/ERF家族的主要成员，在植物应对非生物胁迫中发挥重要作用。目前还没有针对细叶百合DREB转录因子家族的系统分析。本研究基于细叶百合(根、茎、叶)转录组数据筛选出12个DREB转录因子，命名为LpDREB1-LpDREB12,并对其进行生物信息学及不同组织在胁迫下的表达模式分析。结果表明，细叶百合DREB蛋白多为不稳定蛋白且具有一定亲水性，α螺旋和无规则卷曲是蛋白二级结构的主要组成部分。系统进化分析显示，12个细叶百合DREB转录因子同61个拟南芥DREB转录因子聚类到一起，说明细叶百合和拟南芥DREB家族成员具有较高的保守性。表达模式分析表明，在干旱、盐、低温及脱落酸胁迫下12个细叶百合DREB基因的表达均有组织特异性。研究结果丰富了细叶百合DREB基因数据库，为挑选优质抗逆基因提供了理论依据。     

芹菜中转录因子基因AgDREB1的分离与表达研究

DREB类转录因子是植物AP2/ERF转录因子家族中一个重要的亚家族,参与植物对逆境的应答,是植物适应逆境的重要调节因子之一。本文从不同品种芹菜中分离DREB类转录因子基因,并研究其表达情况,以进一步研究芹菜中非生物胁迫逆境调控。基于芹菜(Apium graveolens L.)转录组数据,分别从2个芹菜品种‘津南实芹’和‘文图拉’中克隆得到一个编码芹菜DREB类转录因子的基因AgDREB1。采用生物信息学方法对AgDREB1的氨基酸组成、理化性质、进化关系、空间结构等进行了分析。通过实时定量PCR方法对‘津南实芹’和‘文图拉’中AgDREB1基因的表达进行分析。结果表明:来源于‘津南实芹’和‘文图拉’的AgDREB1基因全长分别为495和492 bp,分别编码165和164个氨基酸。芹菜中AgDREB1转录因子等电点约为9.64,包含1个α螺旋和3个β折叠结构,进化关系上属于DREB亚族中的A5组。芹菜AgDREB1转录因子与其他物种的DREB转录因子具有较高的一致性。实时定量PCR分析表明,AgDREB1基因在‘津南实芹’和‘文图拉’根中的表达较高,对低温、高温、干旱和盐胁迫等非生物胁迫有响应。结论:从芹菜中克隆获得一个与逆境相关的DREB类转录因子基因AgDREB1,通过基因表达分析发现,芹菜中AgDREB1基因在根中表达最高,而且该基因与芹菜非生物胁迫相关。     

梅花PmCBFa基因的克隆与序列分析

为了找到梅花抗寒关键基因,进一步了解梅花的抗寒分子机理,在分析了NCBI核苷酸数据库中已公布的CBF/DREB1同源基因序列基础上,通过基因同源克隆结合RACE技术,在‘雪梅’花蕾cDNA文库以及‘雪梅’gDNA中均成功扩增得到梅花的1个CBF/DREB1类基因,命名为PmCBFa。该基因CDS区全长845bp,编码231个氨基酸。经核苷酸序列分析、预测编码氨基酸序列比对分析以及编码蛋白系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白具有CBF/DREB1类转录因子保守的AP2结构域及其两翼结构序列,且与桃的DREB1同源蛋白同源性最高。该研究结果为后续PmCBFa基因在梅花抗寒分子机理的研究中提供了理论依据,为梅花抗寒育种开辟了新的途径。     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

胡杨中两个新DREB类基因的克隆、序列分析及转录激活功能研究

DREB转录因子(干旱应答元件结合因子)是逆境适应中的关键调节因子。该类转录因子的特点是拥有保守的AP2/EREBP(APETALA2/乙烯应答元件结合蛋白)结构域,能够特异性地与抗逆基因启动子上的DRE元件相结合,在低温、干旱和盐碱等条件下调节一系列下游逆境应答基因的表达。本研究从胡杨中分离出2个编码DREB2类蛋白的基因PeDREB3和PeDREB4。PeDREB3和PeDREB4在胡杨根、茎、叶中都有表达。序列分析显示,PeDREB3和PeDREB4均含有非典型性AP2/ERF结构域,即在AP2/EREBP结构域的第2个β折叠和第3个β折叠处多出8个氨基酸残基,用改进的酵母单杂交技术发现PeDREB3和PeDREB4能够在酵母中激活下游报告基因的表达,具有转录活性。     

水稻DREB1基因过表达载体的构建与转化

为了研究DREB1的功能,从水稻cDNA中克隆了DREB1基因,成功构建了该基因的高效植物表达载体pCAMBIA-DREB1。采用农杆菌介导法转化水稻,经PCR、Southern blot分析表明,DREB1基因已经成功地整合到水稻基因组中,获得水稻DREB1基因过表达转基因植株。     

DREB 2A基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

研究提取盐处理的拟南芥植株叶片总RNA,用DREB2A基因特异引物通过RT-PCR扩增出1050bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的DREB2A基因序列同源性达100%。进一步将DREB2A基因分别克隆至植物表达载体卡盒pCCE12和pCC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的DREB2A基因植物表达载体pCDRE12和pCDR29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导的DREB2A基因对植物的遗传转化奠定基础。     

不同启动子调控的DREB1A基因对黄瓜的遗传转化

以黄瓜(CucumissativusL.)主栽品种长春密刺的子叶节为受体材料,采用农杆菌介导法,将分别由诱导型启动子rd29A和组成型启动子35S调控的转录因子DREB1A基因导入黄瓜,获得大量PCR阳性植株。统计结果表明:诱导型启动子rd29A调控的DREB1A基因抗性芽率和再生植株PCR阳性率明显高于组成型启动子35S。     

小麦DREB基因的表达特征分析

[目的]对新春6号小麦的抗旱DREB基因进行表达特征分析。[方法]在干旱逆境胁迫下,考察不同胁迫处理时间下新春6号小麦中DREB基因的表达情况,分析该基因对小麦抗逆性的影响。[结果]小麦的抗旱DREB基因受干旱胁迫诱导,与对照相比,在小麦干旱胁迫12h后表达量上升。[结论]小麦的抗旱DREB基因可能参与小麦对干旱胁迫的应答,为研究小麦的抗旱分子机理提供了依据。     

植物DREB转录因子研究进展

DREB转录因子是重要的转录因子之一,在调控与逆境相关基因的表达、提高植物对逆境胁迫适应性中发挥重要作用.文章综述DREB转录因子的克隆、结构特点、表达、与植物逆境胁迫的关系、信号传导及在植物抗逆基因工程中的应用等的研究进展,指出该领域研究存在的问题如:其他多个逆境条件下DREB类转录因子的研究、受DREB直接调控的基因的特点及其调控机制、DREB自身和结构调控及其调控基因形成的表达调控网络,今后须针对这些问题进行深入研究,为提高作物抗逆性和选育抗逆作物品种奠定基础.     

DREB转录因子在植物逆境胁迫中的作用及研究进展

DREB转录因子能调控并激发不同基因表达,在多种胁迫下植物分子育种中被广泛的应用。通过对非生物逆境胁迫下不同DREB基因转入小麦、水稻、大麦和玉米等植物的研究,表明其能响应干旱、极端温度、重金属等胁迫。DREB基因过量表达也会促进CBF/DREB的基因及其与抗逆境有关的HSP/LEA等基因表达,保护转基因植物细胞免遭逆境胁迫损害。