响应面法优化猪伪狂犬病病毒耐热保护剂的研究

为提高猪伪狂犬病活疫苗的保存温度,本实验应用响应面法(RSM)筛选并优化出猪伪狂犬病病毒(PRV)耐热保护剂最佳配方。结果表明:谷氨酸钠、L-精氨酸盐酸盐和D-山梨醇能够显著提高病毒对冻干环境的耐受能力,酶解酪蛋白、海藻糖、明胶、蔗糖和牛血清白蛋白显著性依次递减;以冻干后病毒保护率为响应值,响应面优化出最优配方为:谷氨酸钠2%、L-精氨酸盐酸盐2%、D-山梨醇2%、酶解酪蛋白7.6%、海藻糖1%、明胶4%、蔗糖15.2%、牛血清白蛋白2%。采用该配方进行验证试验,冻干保护率达到80.40%,经37℃保存7 d的耐老化试验及2℃~8℃保存24个月,3批疫苗病毒滴度分别下降0.55、0.62、0.47及0.47、0.51、0.41,证明该配方制备的疫苗具有良好的热稳定性。     

猪伪狂犬病变异株及其疫苗的研究进展

猪伪狂犬病(PR)是由猪伪狂犬病病毒(PRV)引发的高致死率的一种急性传染病。PRV变异株的出现使得PR在全国范围内广泛流传,其发病特征和致病性也变得十分严重,并且现有疫苗起不到完全的保护作用。本文对PRV变异株的致病性、分子特征和分子基础及PRV变异株疫苗研制等方面的研究进展进行了综述,以期为PRV的防控和净化提供新思路。     

猪瘟冻干活疫苗保护剂的研究（简报）

猪瘟冻干活疫苗保护剂的研究（简报）李道义，王成业，黄东文，陈开胜，农超群（广西生物制品厂，南宁５３０００１）猪瘟活疫苗按《规程》规定，在，－１５℃保存１２个月，０－８℃保存６个月，在２５℃以下时，要求１０天内用完。给疫苗的运输、保存、使用带来许多的困...     

重组猪α干扰素冻干保护剂的筛选

为使重组猪仪干扰素（rPoIFN—α）制品更好地应用于生产实践中,采用保守的冻干工艺重点对rPoIFN-α制品的冻干保护剂进行筛选,通过外观检测、水分含量、活性检测对14种冻干保护剂进行了比较和筛选。研究结果表明,终浓度2％、4％和5％的甘露醇的保护效果较好,活性保持率分别为102．8％、95．1％、108．3％。按照活性好的这三个配方再冻干三批制品进行放置40℃加速稳定性实验。结果表明,在40℃放置三个月后,三个保护剂制品效价基本没变化,稳定性良好,有效期暂定为两年。本研究初步探索了rPoIFN一仪的冻干配方,为rPoIFN-α的产业化打下了基础。     

猪瘟冻干活疫苗保护剂的研究（续报）

应用耐温保护剂Ａ１或无硫脲Ａ１制成兔化猪瘟病毒冻干疫苗若干批。所有应用Ａ１作保护剂的产品都出现干缩现象，而应用无硫脲Ａ１的未出现。５批无硫脲Ａ１的疫苗经在３７℃中保存１５天或在２５℃保存１００天后，都能保护疫苗接种动物抵抗强毒攻击，此种保护力与规定标准一致，而应用Ａ１的对照疫苗达不到此项标准。     

禽偏肺病毒病（B亚型）活疫苗（LN16-A株）冻干保护剂筛选和冻干工艺的优化

通过调整蔗糖明胶保护剂中蔗糖和明胶的比例、调整病毒液和冻干保护剂的添加比例,确定蔗糖添加量为40%、明胶添加量为8%配制的保护剂,病毒液与其按7∶1的比例冻干的制品性状较好,病毒含量较高。同时进行了禽偏肺病毒病（B亚型）LN16-A株不同装量最佳冻干曲线优化,对预冻时间、升华阶段（一期干燥）温度和时间、解析干燥（二期干燥）最高许可温度及时间进行了优化,结果表明,1.5 m L/瓶装量的预冻时间2 h、升华温度为5～10℃、升华时间为11 h、干燥温度为30℃维持6 h;2.0 m L/瓶装量的预冻时间h、升华温度为5～10℃、升华时间为14 h、干燥温度为30℃维持6 h;3.0 m L/瓶装量的预冻时间4 h、升华温度为5～10℃、升华时间为17 h、干燥温度为30℃维持6 h,为最优冻干曲线。     

猪伪狂犬病病毒鲁A株的分离鉴定

从山东省某些猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑及内脏中分离到多株病毒，对其中一代表毒株进行了全面鉴定。该分离毒株在兔肾原代细胞(RK)上和鸡胚成纤维细胞(CEF)上连传5代．均出现典型细胞病变．再接种于RK-13细胞、BHK-21细胞、Vero细胞、PK15细胞和143TK细胞，均出现典型细胞病变；在RK-13细胞上的TCID50为10^-0.52/0．1mL；在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子；对氯仿、乙醚敏感，56℃30min灭活；能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和；病毒接种于家兔和小鼠，均出现典型伪狂犬病症状与病变；提取所分离病毒的DNA作为模板。应用特异性引物，以PCR方法可扩增出伪狂犬病病毒gD基因中272～534nt之间262bp长的特异性片段。上述结果证明，所分离病毒为猪伪狂犬病病毒，并将其命名为猪伪狂犬病病毒鲁A株。     

猪伪狂犬病基因缺失耐热保护剂活疫苗免疫效果试验探究

猪伪狂犬基因缺失疫苗免疫可以与自然感染相区分,可以结合相应的鉴别诊断方法,进行猪伪狂犬净化计划,达到较理想的结果。近年来,一些国家已经推广应用基因缺失疫苗来免疫猪群。笔者使用酶联免疫吸附试验和中和抗体试验对引种猪群伪狂犬抗体水平进行检测和分析,作为猪场使用伪狂疫苗的理论依据,对猪场猪伪狂犬病抗体水平和野毒感染情况进行评估,从而来验证猪伪狂犬病基因缺失耐热保护剂活疫苗C株在用于我国防治和根除猪伪狂犬病的适用性。     

猪伪狂犬病病毒LA株的分离鉴定

从辽宁省某猪场大批死亡的新生仔猪脑及内脏中分离到多株病毒，通过初步验证后选择其中一代表毒株进行了鉴定。该病毒株在PK-15细胞上连续传12代均出现典型的细胞病变，用适应PK-15细胞的病毒接种Veto细胞、猪肾传代细胞IBRS-2及SPF鸡胚成纤维细胞均出现典型的细胞病变。在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子。该病毒对氯仿、乙醚敏感，在pH5．0-9．0下稳定，56℃30分钟即可灭活该病毒。该病毒能被伪狂犬病病毒标准阳性．血清中和。取处理后的病料上清液和传代病毒接种家兔均出现典型的伪狂犬病症状。用所分离病毒提取的DNA及培养病毒液经简单的预处理后作为模板，应用特异性引物进行PCR能扩增出伪狂犬病病毒1240bp的gD基因的特异性片段。结果表明，所分离病毒为伪狂犬病病毒，并将该毒株命名为猪伪狂犬病病毒IA株。     

猪伪狂犬病病毒（PRV-JL 株）的分离与鉴定

从吉林某猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织病料中分离出1株病毒,感染猪以后病理变化明显,经幼仓鼠肾传代细胞系（BHK-21）接种、毒价测定、病毒形态观察、PCR扩增及相关动物试验证实为猪伪狂犬病病毒（PRV）野毒,并命名为PRV-JL。经BHK-21接种,病毒生长良好;毒价稳定,可达10-7.59/0.2 mL;电镜负染观察到病毒粒子呈椭圆或圆形外观,无囊膜的病毒粒子直径约110-150 nm,有囊膜的成熟病毒粒子直径约150-180 nm;PCR鉴定该毒株为强毒,其gE序列与Genbank登录的PRV gE序列同源性为99%-100%;本研究构建了小鼠的感染模型,并进行了病毒载量检测,结果用不同剂量病毒培养物接种Balb/C小鼠,小鼠死亡明显,最初在其脑组织中检测到PRV病原,随后在肾、肺、心逐步检出,试验初步证实了PRV的脑组织嗜性。试验表明, PRV-JL是1株强毒,对易感动物具有高致病性,为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫与诊断研究奠定基础。     

ST悬浮细胞培养猪伪狂犬病病毒工艺参数的优化

为优化ST悬浮细胞培养条件及其生产猪伪狂犬病病毒的工艺参数,对影响ST悬浮细胞生长的接种细胞初始密度、培养时间和摇瓶转速等工艺参数进行优化比较,对影响猪伪狂犬病病毒增殖的接种细胞初始密度、感染量和培养时间等条件进行优化.结果显示:接种细胞初始密度1.00×106 cells/mL、摇瓶转速140 r/min、悬浮培养4...     

猪伪狂犬病活疫苗（Bathar-K61株）免疫佐剂的筛选

为筛选到一种适合猪伪狂犬病活疫苗的免疫佐剂,本研究通过稳定性试验、病毒效价测定、安全性试验、效力试验对5种不同类型免疫佐剂(AD01、AD02、AD03、AD04和AD05)进行了比较筛选.稳定性试验结果表明,AD01、AD03、AD04和AD05 4种佐剂稀释疫苗后6h不分层,表现出良好的稳定性,而AD02佐剂稀释疫苗1h后出现分层;病毒效价测定结果表明,AD01、AD03、AD04 3种佐剂稀释后疫苗病毒滴度为106.25-6.50TCID50/100 μL,与对照组病毒滴度无差异,而AD05佐剂稀释疫苗后,测得的病毒滴度低于对照组,仅为103.5～5.17TCID50/100 μL,对病毒效价有干扰;安全性试验表明,用AD01佐剂稀释疫苗免疫猪群后,猪只体温升高,平均体温为(40.3±0.2)℃,20％(2/10)的猪只出现呕吐,40％ (4/10)的猪只出现食欲下降和精神不振的临床症状,AD03、AD04佐剂稀释疫苗免疫猪群后,临床表现无异常,与对照组一致;效力试验结果表明,剩余的AD03、AD04两种佐剂稀释疫苗后在第7天均可检测到中和抗体,第60天抗体中和效价平均值达到高峰,分别为69.8±3.3和69.5±2.8,高于对照组的57.8±7.0.筛选结果说明,AD03、AD04两种佐剂均适用于猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株),此研究为提高猪伪狂犬病活疫苗(Bathar-K61株)的使用效果进行了有益的探索.     

猪伪狂犬病活疫苗(SA215株)保存条件的研究

为研究猪伪狂犬病活疫苗(SA215株)在-15℃和2～8℃保存的稳定性,本试验选择了 6批试制疫苗以12个月有效期为基础,延长保存至21个月(即有效期后9个月)后按照质量标准进行性状观测、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、鉴别检验、病毒含量测定、安全检验、效力检验、剩余水分测定、真空度测定.检测结果显示:6批猪伪狂犬...     

布氏菌病活疫苗（Rev.1株）冻干保护剂工艺的研究

布氏菌病活疫苗(Rev.1株)的冻干工艺借鉴、采纳布氏菌病活疫苗(S2株)成熟的冻干工艺及菌液的配比,对冻干保护剂的选择进行了优化。我们选择蔗糖明胶保护剂和蔗糖脱脂乳保护剂,保护剂与布鲁氏菌Rev.1株菌液以16的比例混合,冻干后测定其活菌含量。结果显示,3批使用蔗糖脱脂乳保护剂的不同配比比例的冻干疫苗活菌数分别为12×10^9CFUmL、12.44×10^9CFUmL、12.65×10^9CFUmL;使用蔗糖明胶再加入终浓度约1%硫脲的不同配比比例的冻干疫苗活菌数分别为12.34×10^9CFUmL、12.62×10^9CFUmL、12.91×10^9CFUmL;使用蔗糖明胶的不同配比比例的冻干疫苗活菌数分别为12.22×10^9CFUmL、12.64×10^9CFUmL、12.8×10^9CFUmL。3种冻干保护剂对冻干疫苗的活菌含量影响无明显差异,但使用蔗糖明胶保护剂制备冻干疫苗时加入适量硫脲可适当增加冻干疫苗的耐热性,因此我们选择10%明胶、20%蔗糖冻干保护剂与菌液以1∶6配比比例混合,再加入终浓度约为1%的硫脲作为布氏菌病活疫苗(Rev.1株)的冻干工艺。     

猪伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)对变异株的保护效力

本研究旨在检测仔猪免疫猪伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)后,抵抗伪狂犬病病毒(PRV)变异株攻击的保护效果。取4~6周龄PRV抗体阴性仔猪,接种猪伪狂犬病活疫苗,1周后用PRV变异株(AH02LA株)攻毒,检测攻毒后临床症状、直肠温度、鼻腔排毒和肺部病变。疫苗免疫组在免疫后7 d均可以检测到gB抗体。攻毒对照组攻毒后出现典型伪狂犬症状,发病率为100%,死亡率为60%,所有猪只鼻拭子均检出排毒,所有猪只肺部均有出血、淤血等病变。免疫组的猪只攻毒后,所有猪只均未出现明显临床症状,部分猪只鼻拭子检出排毒,排毒持续时间缩短,排毒量显著减少,所有免疫猪只肺部未见明显病变。结果表明:伪狂犬病活疫苗免疫猪后对PRV变异株的攻击具有良好的保护效果。     

猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定

从湖北省某些猪场大批死亡的新生仔猪的脑及内脏中分离到的多株病毒,并用其中一代表毒株进行了全面鉴定。该病毒株在仓鼠肾传代细胞上连传１５代均出现典型细胞病变,用适应ＢＨＫ－２１细胞的病毒接种鸡胚成纤维细胞,Ｈｅｌａ细胞,Ｖｅｒｏ细胞,犊牛睾丸原代细胞,猪肾传代细胞ＩＢＲＳ－２均出现典型细胞病变,在电镜下可见到典型的伪狂犬病毒病粒子,病毒对５－碘脱氧尿核苷,氯仿,胰蛋白酶,乙醚敏感,在ｐＨ５．０～９．０     

猪伪狂犬病防控与净化

伪狂犬病（Aujeszky’s Disease）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus PRV）引起的多种家畜和野生动物以发热,奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要特征的一种重要传染病;猪是伪狂犬病毒的自然宿主,可造成种猪繁殖障碍、仔猪早期大量死亡、商品猪生长迟滞,给畜牧业带来巨大损失。本病曾在全世界流行,中国自1947首次报道以来,目前已扩大到全国各地,隐性感染、临床发病及混合感染日趋严重,每年因为该病造成巨大的经济损失。世界上主要的养猪国家都已开始实施猪伪狂犬病的控制和净化项目,并在一些国家取得成功;借鉴国外成功的经验,根据我国猪伪狂犬病的流行状况及研究进展,并提出我们国家伪狂犬病防控策略和净化方案。     

猪伪狂犬病病毒NP株的分离鉴定

2013年下半年,福建某免疫接种过猪伪狂犬病疫苗(Bartha)的规模化猪场大批妊娠母猪发生流产、新生仔猪发生共济失调的神经症状,疑似为猪伪狂犬病病毒感染发病症状,为确定发病原因,从该猪场疑似伪狂犬病病毒感染的仔猪脑、肝脏和肺脏中分离到一株未知病毒,PCR检测及测序比对鉴定为猪伪狂犬病病毒,并将分离的病毒命名为NP株。用Reed-Muench法测定分离株病毒的组织细胞半数感染量(TCID50)为10-9.13/0.1mL,动物攻毒试验出现猪伪狂犬病病毒感染的典型症状。试验结果表明,成功分离到一株猪伪狂犬病病毒毒株,为研究福建省猪群伪狂犬病病毒分子流行病学奠定基础。