恩诺沙星酶联免疫吸附检测方法(ELISA)的建立及其与HPLC方法的比较研究

建立了恩诺沙星残留检测的酶联免疫吸附检测方法(ELISA),并对方法的准确度和灵敏度等指标进行了评价,确定方法的最低检出限(LOD)为1ng/mL,线性范围为1ng/mL-1000ng/mL。以虾肉为样本进行的加标实验表明,在5ng/mL-200ng/mL的加标浓度下,孔间变异系数为9.8%-17.4%,批间变异系数为11.9%-23.4%,添加回收率为60.07%-120.8%。对ELISA和高效液相色谱(HPLC)的检测性能进行了比较,并通过水产品、畜禽等市售食品的同步检测进行了验证,结果表明在实验范围内,二种方法之间呈现较好的相关性,R2=0.9896,这表明建立的ELISA检测方法有较高的可信度是比较高的,可以有效地反映药物的残留情况。     

拉沙里菌素单克隆抗体的研制及间接竞争ELISA检测方法的建立

为制备拉沙里菌素（LAS）单克隆抗体,建立针对LAS的间接竞争ELISA（Ci-ELISA）方法,试验采用了活性酯法将LAS分别与BSA和OVA偶联成LAS-BSA和LAS-OVA作为免疫原和检测原,6次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,最终筛选出一株能稳定分泌抗LAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株C11。经鉴定,C11的抗体类型为IgG1,轻链为κ链;所制腹水效价为1∶16 000,与莫能菌素钠、盐霉素钠、马杜霉素胺、头孢噻吩钠和硫酸链霉素均无交叉反应。用此单克隆抗体建立LAS Ci-ELISA检测方法显示,Ci-ELISA标准工作曲线为y=0.376x－0.2374（R²=0.9914）,LAS在5~1 000 ng/mL时,线性关系良好,IC₅₀为90.22 ng/mL,加标回收率为81.76%~102.41%,表明方法精确度好、灵敏度高。LAS单克隆抗体的制备和Ci-ELISA方法的建立为下一步试剂盒的研发奠定了基础。     

恩诺沙星在鸡肉组织中残留的ELISA检测方法研究

分别用N-羟基琥珀酰亚胺法和氯甲酸异丁酯法把恩诺沙星(ENR)与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原和包被抗原,免疫新西兰大白兔得到ENR的多克隆抗体,建立了ENR间接竞争ELISA方法。结果表明:抗ENR血清效价达达1∶212以上,得到标准曲线的线性回归方程为Y=-0.2341X+0.1193(R2=0.9878),中值(IC50)为36 ng/mL,最低检测限(LOD)为10 ng/mL,标准曲线的线性范围为10~1000 ng/mL。批内变异系数为3.18%~7.64%,批间变异系数为9.69%~11.94%,鸡组织中的ENR的回收率为76.5%~89.42%。本试验建立的ELISA方法能够满足恩诺沙星兽药残留检测要求。     

农畜产品中三聚氰胺间接竞争ELISA检测方法的建立

利用制备的抗三聚氰胺单克隆抗体建立了间接竞争ELISA方法,采用棋盘滴定法确定最佳三聚氰胺-OVA包被浓度为1.0 μg/mL,单抗最佳稀释度为1∶1 000,最佳的封闭液为50 g/L的脱脂乳,标准曲线的线性方程为y=-15.12x+107.3(R2=0.997).批内变异系数(CV)为1.07％～5.53％,批间CV值为3.33％～11.92％,确定此方法精确度良好.利用建立的间接竞争ELISA方法,测定添加有三聚氰胺标准溶液的样品(宠物食品、小麦面筋、饲料、牛乳、鸡蛋),得到三聚氰胺在各样品中的回收率范围分别为宠物食品73.8％～84.32％,小麦面筋67.3％～88.27％,饲料70.3％～85.9％,牛乳83.47％～89.76％,鸡蛋76.2％～87.29％.确定可以利用此间接竞争ELISA方法检测样品中的三聚氰胺含量.     

鸡猪排泄物中恩诺沙星和环丙沙星含量HPLC检测方法的建立

建立了测定鸡、猪排泄物中恩诺沙星及环丙沙星含量的高效液相-荧光检测方法.将猪粪和鸡粪尿混合物样品分别用甲醇氨水溶液和醋酸甲醇溶液浸提,猪尿用固相萃取小柱富集净化,流动相为乙腈-三乙胺磷酸溶液（0.02 mol/L）,荧光激发波长280 nm,发射波长450 nm.检测结果表明,排泄物样品中恩诺沙星和环丙沙星含量的检测定量限,鸡粪尿混合物为0.010 μg/g,猪尿0.005 μg/mL,猪粪为0.020 μg/g.外标法标准曲线的线性范围鸡粪尿混合物中恩诺沙星为0.010～100.000 μg/g、环丙沙星为0.010～50.000 μg/g,猪尿和猪粪中恩诺沙星和环丙沙星的线性范围分别为0.005～0.500 μg/mL和0.020～1.000 μg/g.恩诺沙星和环丙沙星的回收率分别大于75%和88%.HPLC方法的样品前处理和检测方法简便、快捷,准确性较微生物检测法高.     

庆大霉素ELISA检测方法的建立与应用

本实验利用戊二醛法合成抗原,进行动物免疫,制备特异性强的单克隆抗体。建立了庆大霉素ELISA检测方法,方法灵敏度为0.1μg/L,半数抑制浓度IC50为0.295μg/kg,将建立的庆大霉素ELISA检测方法应用于肌肉组织的检测中,得到最低检测限为7.91μg/kg,样本添加回收率在70%～120%之间,变异系数小于15%,该方法的建立为庆大霉素的残留检测提供了可靠的分析检测手段。     

醋酸甲孕酮（MPA）间接竞争ELISA检测方法的建立

将半抗原醋酸甲孕酮（MPA）衍生物与牛血清白蛋白(BSA)偶联后,作为包被原与游离的醋酸甲孕酮竞争抗MPA多克隆抗体,通过该模式建立间接竞争ELISA方法检测MPA的残留量。试验结果表明：理想的包被抗原为0.625 μg/ml,抗体的工作浓度为1∶8000,标准曲线在1 ～50 ng/ml之间线性关系较好,最低检测限0.1 ng/ml, 得回归方程y=-1.1479x+0.9426(r2=0.9679),批内和批间变异系数分别为5. 35%、10. 89%。     

恩诺沙星单克隆抗体的制备及其鉴定

采用碳二亚胺法和氯甲酸异丁酯法合成恩诺沙星的人工抗原,结合比为15∶1。用人工抗原腹腔免疫BALB/c小鼠,有限稀释法筛选获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株2H10C2F11,并将该细胞株注射小鼠腹腔获得腹水。纯化后的抗体效价为3.96×10-6,紫外分析方法计算蛋白含量为1.139 mg/mL,琼脂双扩实验表明抗体为IgG1型,SDS-PAGE电泳图谱显示纯化效果理想;经间接ELISA方法测定,抗体的亲和力为1.8×108L/moL。     

直接ELISA检测沙门氏菌方法的建立及其应用研究

从已获得的４株沙门氏菌属特异杂交瘤单克隆抗体中，筛选出ＣＢ８和Ｄｅ７两株单抗相合成酶标检测试剂，并建立了检测沙门氏菌的直接ＥＬＩＳＡ方法，它能检出沙门氏菌属９９％的菌株，而不与其他肠道杆菌反应（包括大肠杆菌，阴沟杆菌，产气杆菌，志贺氏菌，枸椽酸杆菌，克雷伯氏菌，变形杆菌和沙雷氏菌）。应用本方法检测粪样，鱼粉，奶样，其敏感性和特异性分别高达１００％和９７．６％，仅出现２．４％的假阳性率，该法不受各要     

鸡粪中恩诺沙星和环丙沙星的HPLC检测方法

建立并验证了鸡粪中恩诺沙星及其主要代谢产物环丙沙星的HPLC检测方法。鸡粪匀浆后经氨-乙腈-水溶液提取、三氯乙酸溶液沉淀和酸化,样液经Strata-XC浓缩和净化后进行高效液相色谱-荧光检测器分析。方法的回收率CIP为90.5%,ENR为91.1%;批内变异系数CIP为5.5%,ENR为5.7%;批间变异系数CIP为7.4%,ENR为9.6%;CIP和ENR的最低检测限(LOD)<0.02mg/kg,最低定量限(LOQ)<0.10mg/kg。应用所建立的方法对鸡口服恩诺沙星溶液后鸡粪中的ENR和CIP的含量进行了检测。     

猪抵抗素（resistin）ELISA检测方法的建立

用纯化的可溶性重组resistin蛋白免疫健康家兔，制备抗血清，优化ELISA各反应条件（如工作浓度、温育时间、特异性试验），初步建立了检测猪resistin蛋白的间接ELISA方法。结果表明抗原、抗体最佳工作浓度为1∶200和1∶400，resistin最低检出限量为193.75 ng/ml；抗原和一抗、一抗和二抗的最适温育时间均为60 min。本试验建立的ELISA方法，具有灵敏度较高，特异性较好的特点，可作为猪组织和血清中resistin蛋白的检测方法。     

倍他米松ELISA检测方法的建立

为建立倍他米松(BET)ELISA检测方法,先使BET与琥珀酸酐反应,再采用活化酯法与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原;其次,利用免疫动物获得多克隆抗体,经Sephrose 4B-proteinA方法对抗体进行纯化;最后,建立倍他米松ELISA检测方法。结果表明,免疫抗原偶联成功,获得了亲和力较高的多克隆抗血清,间接竞争ELISA测定其滴度为102 400、IC15为6.60×10-5 ng/mL和IC50为0.97ng/mL。该方法适用于残留在动物性食品中的BET现场大批量检测。     

单抗夹心ELISA检测产蛋下降综合征病毒的研究

利用３株特异性单抗,建立了检测ＥＤＳＶ的夹心ＥＬＩＳＡ方法。经测定,ＭｃＡｂ最适包被浓度为２μｇ／ｍｌ,ＭｃＡｂ－ＨＲＰ最佳工作浓度为１∶４００,该方法最小检出浓度为０．０３μｇ／ｍｌ,与常见的几种鸡的传染病的病原无交叉反应。对某发病鸡场的５０份泄殖腔拭子样本进行了检测,阳性率为８４％（４２／５０）。     

间接ELISA检测抗氨苄青霉素抗体方法的建立

通过对最佳抗原包被浓度及包被条件、最佳血清工作浓度、封闭剂、待测血清、酶标二抗的最佳工作浓度及作用时间等反应体系的筛选和确定,利用人工制备的完全抗原及其免疫血清建立了检测抗氨苄青霉素(AMPI)抗体的间接ELISA 方法。结果表明,AMPI BSA抗原最佳包被浓度为1μg/mL,AMPI HSA抗原最佳包被浓度为2μg/mL;包被条件为37 ℃4 h 后4 ℃过夜;抗AMPI HSA血清和抗AMPI BSA 血清最佳工作浓度分别为1∶25 600 和1∶51 200;封闭剂、待测血清、酶标二抗的最佳作用时间均为30 min。血清检测结果表明抗AMPI HSA的抗体水平最高,抗AMPI BSA 的抗体水平稍低于抗AMPI HSA 的抗体,而抗AMPI KLH的最低。     

采用全菌抗原干燥包被法ELISA检测禽霍乱血清抗体的研究

利用戊二醛的偶联作用将禽多杀性巴氏杆菌的全细胞抗原在聚苯乙烯酶标板上进行干燥包被,酶标板以2.5%的戊二醛溶液预处理.通过直接和间接ELISA方阵滴定确定其包被的全菌抗原最适浓度为108个菌/mL.特异性、重复性、稳定性检验,以及初步建立的间接ELISA用于样品检测的结果表明,所创建的禽多杀性巴氏杆菌全菌抗原干燥包被方法能够很好地应用于建立检测禽霍乱血清抗体的ELISA.     

Establishment of Indirect ELISA Method for Detecting Antibodies against Avain Infectious Bronchitis Virus

The purpose of this research was to establish a rapid detection serological method against avain infectious bronchitis virus (IBV).In this study,an indirect ELISA method was established using IBV as the detected antigen and a variety of testing conditions were optimized.The results showed that the optimal antigen coating concentration was 19.2 μg/mL and the optimal condition for coating was incubated at 37 ℃ for 1 h and then 4 ℃ overnight.The optimal dilutions of serum and enzyme labeled antibody were 1:800 and 1:7 000 incubated at 37 ℃ for 60 min,respectively.The optimal condition of chromogenic substrate was incubated at 37 ℃ for 10 min in the dark.The specificity,repeatability and sensitivity tests proved that the indirect ELISA did not cross-react with positive antiviral sera of other chicken diseases,had good repeatability and could detect IBV antibody when serum was diluted 1:12 800.We concluded that the established indirect ELISA was specific,repeatable and sensitive.     

鸡肉中硝基咪唑类药物残留ELISA检测试剂盒的研制

分别利用戊二酸酐法和碳化二亚胺法合成半抗原和免疫抗原免疫动物,制备特异性强的单克隆抗体.在筛选硝基咪唑类单克隆抗体的基础上,建立ELISA检测方法,并研制出对鸡肉中硝基咪唑类药物残留检测试剂盒.试剂盒最低检测限为0.04μg/kg,样本添加回收率为69.4%～107.5%,批内变异系数为7.8%～14.6%,批间变异系数为10.90%～16.5%.该方法的建立为硝基咪唑类药物残留的检测提供了便捷、准确的分析检测手段.     

间接ELISA检测鸡传染性鼻炎抗体的研究

用副鸡嗜血杆菌Hpg-8菌株制备ELISA抗原,与抗鸡Ig单抗1B7酶结合物建立了检测鸡血清抗体水平的间接ELISA方法.交叉试验、阻断试验、重复性试验等表明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高.确立了检测FLISA效价(ET)的回归方程y=1.421+0.299x)(P＞0.05),可用于定量测定.间接凝集试验与间接ELISA方法的比较试验表明,ELJSA法比间接凝集试验敏感性高3倍以上.     

ELISA法测定牛奶和鸡肌肉中四环素类药物残留

以本实验室研制的四环素类药物多残留检测试剂盒为基础，建立了牛奶和鸡肉中四环素、土霉素、金霉素药和多西环素的ELISA检测方法。该方法对牛奶和鸡肉中四环素的检测限为7μg／L（μg／kg）左右。在牛奶和鸡肉中，4种四环素类药物100μg／L（μg／kg）浓度的添加回收率范围为43．6％～101．4％，批内变异系数小于25％，批间变异系数在30％以内。牛奶的临界值为39．5μg／L，鸡肉的临界值为35.3μg／kg。     

应用夹心阻断ELISA测定血清中抗狂犬病抗体的研究

本研究建立的检测狂犬病抗体的夹心阻断ELISA,直接利用未经提纯的病毒悬液代替提纯的抗原,并仅用一种酶标抗体,测定了9种动物的血清.本方法敏感度的95%可信限为0.0013～0.0071IU/mL,比小鼠中和试验和微量免疫酶试验均敏感.按阻断50%判定血清ELISA的阴阳性,9种动物的1134份血清中有91份阳性,其中发病点的牛、猪、犬、家鼠血清的阳性率均在10%以上.根据对一定量的抗原阻断率相同时,抗体浓度一致的原理,测定了7种动物的185份血清效价,结果狂犬病抗体浓度在0.01IU/mL以上的为63份.利用夹心阻断ELISA和小鼠中和试验测定了7种动物的23份血清,阳性份数分别为12和11.两种方法均证明家鼠血清中有狂犬病抗体.本研究表明,测定狂犬病抗体的夹心阻断ELISA,简便、敏感、快速,可用于流行病学调查.