番茄组织培养及其农杆菌介导类胡萝卜素合成酶基因LvcB的遗传转化

LycB(番茄红素β-环化酶)基因是类胡萝卜素生物合成过要分枝点上,直接影响β胡萝卜素的合成.通过农杆菌介导法,利用LycB基因转化重要果菜两用作物--番茄.经PCR及PCR-Southem分子检测证明,目的基因LycB已整合进番茄基因组中.     

病毒诱导的基因沉默在番茄组织中的特异性分析

 病毒诱导的基因沉默（VIGS）是植物基因功能研究的新技术。以组成型表达gusA基因的转基因番茄为材料,通过VIGS技术沉默gusA基因,对VIGS在番茄中的组织特异性进行了初步分析。结果表明,VIGS技术能有效地诱导gusA基因在番茄植株的叶片、花、果实、侧枝、主茎及茎分枝点等部位和组织中沉默,证明VIGS在番茄中具有较强的系统性沉默特征。     

番茄雌核发育诱导及胚珠植株再生研究初报

番茄单倍体培养技术的建立对于番茄育种、分子标记、遗传图谱构建、基因定位、基因克隆等均有极其重要的意义。目前诱导番茄雄核发育——花药和小孢子培养是获得单倍体的主流技术,但未获得理想的结果。作者探索另一条获得番茄单倍体的途径——诱导雌核发育,目前已从离体胚珠获得大量愈伤组织,并获得一再生植株,其来源有待鉴定,现将方法报道如下。     

根癌农杆菌介导外源基因转化番茄体系优化

为建立优化的番茄外源基因转化体系,提高番茄的外源基因转化率,以番茄叶盘预培养时间和农杆菌与番茄叶盘的共培养温度、共培养时间为试验要素,摸索相对适宜的预培养及共培养的时间和温度范围,其余操作按常规步骤进行。结果表明:农杆菌与番茄叶盘的预培养适宜时间为27℃下32～48h;农杆菌与番茄叶盘的共培养的最适宜条件是:22～24℃下暗培养48h。     

番茄抗黄化曲叶病毒病相关基因ClNLR 的功能分析

 在前期通过转录组研究发现1 个NBS-LRR 类抗病基因（Solyc05g009760.1）在抗TYLCV 番茄材料‘CLN2777A’中上调表达，推测可能参与抵抗TYLCV 侵染的防卫反应的基础上，以‘CLN2777A’ 番茄为材料，通过RT-PCR 克隆该基因全长cDNA 序列，命名为ClNLR。荧光定量PCR 发现ClNLR 在番 茄‘CLN2777A’的根和叶片中高水平表达。ClNLR 在本氏烟叶片上的瞬时表达诱导了过敏性反应。病毒 诱导的基因沉默（VIGS）抑制ClNLR 基因在抗病番茄‘CLN2777A’中表达后，接种TYLCV，检测叶片 带毒量，发现VIGS 处理的番茄植株体内的TYLCV 积累量与其ClNLR 基因表达水平成反比。这些研究结 果表明ClNLR 可能为抗番茄黄化曲叶病的相关基因。     

樱桃番茄Ph-3基因调控元件与同源基因系统进化分析

以樱桃番茄品种"京番黄星"为试材,采用PlantCARE在线分析和Gcorn系统进化分析方法,研究了Ph-3基因的表达调控元件及同源基因系统进化特征,以期为进一步解析Ph-3表达调控机制奠定基础。结果表明:Ph-3启动子除了含有核心元件外,还含有光响应元件、赤霉素响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、厌氧诱导元件、昼夜节律调控响应元件等。Ph-3同源基因系统进化分析结果表明,当同源指数为0.70时,番茄、马铃薯、辣椒含有Ph-3的同源基因,且同源基因属于直系同源基因。另外,由同源指数分析结果发现,番茄与马铃薯的亲缘关系最近,其次为辣椒。     

不同基因型番茄高效组培再生体系的建立

以‘特大瑞光’、‘菜都982F1’和‘菜都六号’3种番茄为试材,用番茄的下胚轴、子叶、真叶为外植体,研究了不同基因型、不同外植体材料和不同激素浓度对番茄再生体系的影响,以期筛选出适宜不同基因型番茄离体培养的最佳培养条件.结果表明:3个番茄品种均在MS+2.0 mg/L BA+0.30 mg/L NAA培养基中的愈伤组织诱导率最高.‘特大瑞光’诱导不定芽分化的最佳培养基为MS+2.0 mg/L BA+0.10 mg/L NAA;“菜都982F1”诱导不定芽分化的最佳培养基为MS+2.0 mg/L BA+0.05 mg/L NAA;“菜都六号”,诱导不定芽分化的最佳培养基为MS+3.0 mg/LBA+0.05 mg/L NAA.3个不同番茄品种在MS+0.05 mg/L NAA培养基中均获得了最佳的生根效果.     

致瘤农杆菌的鉴定及与转基因741杨基因互作的研究

以从长瘤的转基因741杨和非转基因毛白杨的根际土壤中分离得到致瘤农杆菌为试材,采用切片、染色及活体接种的方法,对其进行了形态和生物学鉴定。结果表明:其形态符合致瘤农杆菌的特征;胡萝卜和番茄苗的致瘤性试验结果为阳性;该菌株在诱导胡萝卜和番茄苗肿瘤发生同时,还发现其有明显地促进杨树组培苗以及番茄实生苗不定根的诱导能力;该菌株回接转基因741杨组培苗后,并未发现与其寄主之间存在基因转移现象。     

半野生番茄GZ-01砧木增强嫁接植株耐旱性

以贵州半野生番茄GZ-01为砧木，以红果番茄R、粉果番茄P为接穗，使用20%PEG-6000溶液模拟干旱胁迫处理未嫁接(R、P、GZ-01)、嫁接(RGZ-01、PGZ-01)和自嫁接(RR、PP)番茄植株，对嫁接植株生长生理指标、气孔开闭状态、防御酶活性、活性氧积累以及MAPKs和ABA合成相关基因的表达进行分析。结果表明，干旱处理下，GZ-01砧木能够增强嫁接植株防御酶、抗氧化酶活性，降低叶片气孔开放状态比例和H₂O₂、O₂^-积累量，诱导嫁接植株MAPKs、ABA相关基因的表达，以增强嫁接植株的耐旱性，且耐旱性强弱与接穗植株相关。     

番茄ERFb.2转录因子的克隆、生物信息学及表达特征分析

通过克隆番茄SlERFb.2基因,并运用生物信息学对该基因的编码产物进行一级、二级、三级结构分析,并通过qRT-PCR技术检测SlERFb.2基因在不同处理不同时期的表达量,以期为番茄对非生物胁迫的响应机制提供参考依据.结果 表明:SlERFb.2基因含有开放阅读框5个,共编码258个氨基酸,属于酸性蛋白;其二级结构以α-螺旋为主,预测蛋白定位于细胞核上;且含有39个磷酸化位点与15个糖基化位点;启动子区主要以I-box为主,且含有多个诱导基因表达的顺势作用元件;三级结构相对简单,且该转录因子在番茄中存在4个互作蛋白,系统发育树得番茄与马铃薯的亲缘关系最近;qRT-PCR显示该基因对低温的响应特别敏感.     

LycE基因对番茄的遗传转化

本研究以影响番茄遗传转化的4个因子基因型、外植体类型、菌液浓度和是否添加AS进行了试验,结果表明不同基因型间、不同菌液浓度间、是否添加AS对番茄抗性愈伤率的影响都存在显著差异,以东农704,菌液浓度为0.6~0.8,添加AS有利于番茄的遗传转化。以LycE为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对番茄进行了遗传转化,获得了完整的抗性植株,有3株经PCR和PCR-Southern分析鉴定,初步证明外源基因LycE已整合到番茄的基因组中。     

农杆菌介导的几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因转化辣椒研究

以苗龄7～10 d的辣椒组培苗为被侵染的外植体,通过农杆菌介导几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因,研究基因型、外植体类型、抗生素浓度对辣椒遗传转化的影响,以期获得抗真菌病的转基因辣椒植株.结果表明:不同基因型间、外植体类型、抗生素种类和浓度对辣椒的遗传转化影响存在较大差异.以几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对辣椒进行了遗传转化,获得了3株抗性植株.     

提高农杆菌介导番茄遗传转化效率的研究

利用农杆菌介导法对番茄进行遗传转化,比较了不同的农杆菌种类、农杆菌侵染时间、外植体种类及番茄品种对农杆菌侵染效率的影响.转化后得到的再生植株,利用PCR、Southern杂交检测GUS基因是否整和进入基因组.结果表明:农杆菌介导法成功介导了GUS基因导入番茄.农杆菌EHA105侵染番茄的效率明显高于LBA4404,侵染时间3 min较好.子叶外植体的转化明显优于下胚轴,黄色串珠樱桃番茄的遗传转化效率高于中蔬5号;优化的转化条件可以使番茄获得较高的遗传转化效率.     

甜菜转基因体系的相关影响因素研究

以16种基因型的二倍体甜菜（Beta vulgarisl L．）为材料,建立并优化了甜菜的植株再生体系;对影响甜菜转基因的相关因素进行了比较分析,确定了抗生素标记基因的适宜筛选浓度为200mg／L;菌液适宜浸染浓度OD600为0．3;浸染最适时间为10min;外植体与农杆菌适宜共培养时间为4d;添加乙酰丁香酮的适宜浓度为100μmol／L。研究结果的获得,为完善甜菜的遗传工程以及甜菜基因组学的相关研究奠定基础。     

木糖筛选剂在辣椒遗传转化上的应用

为了缓解转基因食品安全性问题,利用安全的木糖筛选系统,开展了辣椒遗传转化技术研究;设置不同的木糖和蔗糖浓度组合,探讨木糖选择压力,初步确立20/5,25/5(g/L,木糖/蔗糖)两个组合为最适木糖筛选浓度;利用农杆菌介导法将pCAMBIA3301-xylose导入辣椒,开展了辣椒安全标记遗传转化技术研究。     

双抗虫基因转化欧美杨107的研究

以欧美杨107为试材,采用农杆介导法进行双抗虫基因(Bt Cry1Ac基因+API慈姑蛋白酶抑制剂基因)的遗传转化研究,探讨了影响欧美杨107的遗传转化的不同因素,初步建立了欧美杨107品种高效组织培养再生体系及遗传转化体系。结果表明:经PCR检测和虫试效果,证明了目的基因已经整合到欧美杨107的基因组中,从转基因株系中筛选出生长发育正常并抗虫能力强的优良株系。     

根癌农杆菌介导北海道黄杨遗传转化体系的建立

 在建立北海道黄杨(Euonymus japonicus 'Cu zhi')再生体系的基础上,建立其遗传转化体系,以获得转雪花莲外源凝集素(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)基因植株。采用根癌农杆菌(Agrrobacterium tumefaciens)　( LBA4404菌株)介导法,研究影响北海道黄杨遗传转化的若干因素。结果表明,预培养与否、菌液浓度、侵染时间、共培养时间等对转化频率都有一定的影响。在遗传转化过程中,不经预培养,根癌农杆菌浓度OD₆₀₀ = 0.6,侵染下胚轴40 min,再共培养3 d,有利于获得最高遗传转化效率。抗性植株经PCR和DNA-Southern blot检测表明,目的基因已整合到北海道黄杨基因组中。     

根癌农杆菌介导的白菜类作物转化体系研究进展

白菜类作物是我国乃至世界性的大众蔬菜,利用农杆菌介导技术将目的基因转入蔬菜中,从而选育具有特殊性状的新品种。文章综述了根癌农杆菌介导的白菜类作物高频再生转化体系构建的影响因素,简要介绍了转化植株的分子检测及遗传行为,在此基础上分析了目前遗传转化技术在白菜类作物改良上存在的问题及广阔的应用前景。     

葡萄器官离体再生和遗传转化体系的建立

以‘森田尼无核’为试材,研究了生长调节物质、外植体类型、抑菌素等主要因素对葡萄离体不定芽再生和转化效率的影响,建立和优化了葡萄的再生和转化体系。结果表明：相对于BA和KT,细胞分裂素TDZ无论单独使用还是与生长素配合使用均可使葡萄不定芽再生频率达到最高;在MS + TDZ 2.0 mg·L^-1 、MS + TDZ 4.0 mg·L^-1 或MS + TDZ 4.0 mg·L^-1 + IAA0.1 mg·L^-1培养基上均可以较好地诱导森田尼无核葡萄再生不定芽,再生频率分别为37.4%,40.2%和50.0%;叶盘、茎段和叶柄都可以诱导再生不定芽,在同一种培养上再生频率有差异,但差异不大;采用根癌农杆菌介导的叶盘法转化葡萄时,卡那霉素抗性筛选浓度为20 mg·L^-1;抑菌抗生素使用头胞霉素适宜浓度为400 mg·L^-1,而使用羧苄青霉素时以300 mg·L^-1最佳;获得转化芽45个,部分株系用PCR和Southern 杂交证实,外源基因已整合在葡萄基因组DNA上。     

葡萄糖氧化酶( GO ) 基因在番茄中的遗传转化

 将来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶( glucose oxidase, GO ) 基因与病原诱导启动子Prp1-1融合,构建了植物表达载体pCPGO, 该载体具有抗除草剂PPT选择标记。经农杆菌介导转入番茄自交系, 获得了阳性转基因植株58株, Southern杂交结果表明, GO基因已整合到番茄基因组中。通过淀粉- KI显色反应和定量检测, 表明GO基因已经表达。转基因植株花器及开花正常, 种子一旦萌发, 其生长、发育各时期均正常。但结实率有所减少, 种子萌发率有所降低。用番茄叶霉病( Fulvia fulva) 病原菌1.2.3.4生理小种侵染T₁ 代转基因植株, 结果显示转基因番茄植株的抗病性有不同程度的提高, 多数发病时间推迟, 病情明显减轻。经测定与抗病性相关的几个指标, 结果转基因番茄叶片中SOD、POD、CAT的活性和蛋白质含量均增高。