六倍体小麦TaWRKY90的克隆和功能分析

WRKY转录因子家族在长期的进化过程中,由低等到高等植物中发展和扩增。在植物应对干旱,低温和盐害等渗透非生物胁迫的响应中占据重要角色。本研究立足六倍体小麦基因组数据库,筛选获得一条新的WRKY转录因子Traes_3B_41047D5E6(TaWRKY90),进一步克隆该转录因子全长序列,并通过荧光定量分析,构建进化树等相关方法验证了所筛选转录因子在植物对渗透胁迫相应中发挥作用。研究分析表明,所克隆TaWRKY90具有1个WRKY结构域,属于WRKY家族第ⅡC亚族;其在不同时间的PEG-6000、低温、H_2O_2、ABA处理下,在小麦幼苗的根、叶片组织中均表现出不同程度的上调表达,且与MDA、CAT、SOD、POD四种酶的活性表达具有较高的相关性,表明TaWRKY90在小麦抗渗透胁迫的响应过程中发挥重要作用。     

乌拉尔图小麦WRKY转录因子的筛选与分析

WRKY转录因子广泛参与植物抗逆胁迫反应,全面分析挖掘小麦A染色体组供体物种乌拉尔图小麦中的WRKY转录因子,对进一步挖掘分析六倍体小麦WRKY转录因子的分子功能具有重要意义。本研究通过生物信息学分析,在乌拉尔图小麦基因组数据中鉴定得到62条全长WRKY转录因子,其中14条能被准确定位在染色体上,并发现2对WRKY转录因子发生了复制;通过进化树分析,发现62条WRKY转录因子被分为8个小亚族,且小亚族内部的基因结构相对保守。通过荧光定量分析所选基因在非生物胁迫下的表达模式,筛选到2条在不同非生物胁迫下均上调表达的WRKY转录因子,为进一步分析其功能打下基础。     

拟南芥中AtACO3基因启动子DNA甲基化的调控机制

RNA介导的DNA甲基化途径(RdDM)在基因表达调控过程中起重要作用。沉默抑制因子(repressor of silencing 1, ROS1)能负调控RdDM途径。定量RT-PCR(quantitative RT-PCR, RT-qPCR)被利用检测拟南芥(Arabidopsis thaliana)中ABA途径相关基因AtACO3表达水平,结果表明非生物胁迫诱导后AtACO3表达水平显著上调。重亚硫酸盐测序结果证明非生物胁迫诱导该基因启动子重复序列的DNA去甲基化,并导致该基因的转录激活。进一步研究证实ROS1在诱导该基因启动子DNA去甲基化的过程中起作用。本研究揭示了非生物胁迫诱导逆境响应基因AtACO3表达的分子机制,为探索植物适应非生物胁迫的表观遗传调控机制提供了科学依据。     

非生物胁迫激活ABA途径ACO3基因的表达

DNA甲基化在植物生长发育和应答非生物胁迫过程中起重要作用。本研究揭示了ABA途径相关基因ACO3应答非生物胁迫的分子机制。定量PCR (quantitative PCR, qPCR)的检测结果表明用野生型拟南芥(Col-0)作对照,被干旱、低温和盐处理的拟南芥植物中ACO3基因表达水平显著增加。重亚硫酸盐测序的数据分析表明非生物胁迫能够诱导ACO3启动子DNA去甲基化并激活该基因的表达。RNA介导的DNA甲基化(RNA directed DNA methylation, RdDM)途径突变体ago4和dcl3中ACO3基因表达水平明显增加,暗示RdDM途径在调控ACO3基因应答非生物胁迫过程中起重要作用。     

玉米中低温应答ERF基因鉴定及表达分析

ERF转录因子在植物的多种发育过程和非生物胁迫反应中发挥重要作用。在玉米中,虽然ERF家族基因对盐胁迫和干旱胁迫的响应研究已经有报道,但尚没有研究从全基因组水平鉴定ERF家族基因对低温胁迫的响应。本研究采用高通量测序技术Illumina HiSeq,分别在5℃和22℃处理下构建玉米叶组织转录组,从中筛选出57条低温响应ZmERFs,包括53条上调表达的Zm ERFs,4条下调表达的Zm ERFs。不同的Zm ERFs在不同组织部位和发育阶段的表达模式有很大变化。蛋白保守结构域分析表明ZmERFs蛋白中共有20个保守基序,EAR基序出现在组B1成员中,LWSY基序出现在A1,A5和B2成员中。启动子分析显示,多种逆境相关元件ABRE、ARE、LTR和MBS在低温响应ZmERFs的启动子中高度富集。RT-qPCR结果进一步显示GRMZM2G544539和GRMZM2G040664基因可以同时受低温、盐和干旱胁迫诱导表达,GRMZM2G434203基因可以同时受低温和干旱胁迫诱导表达,表明ERF转录因子可以参与包括低温在内的多重非生物胁迫反应。此外,启动子中含有7个ABRE元件的GRMZM2...     

DNA甲基化参与调控马铃薯响应干旱胁迫的关键基因挖掘

植物受到干旱胁迫时,会通过DNA甲基化做出快速反应以帮助其应对胁迫。为探究在干旱胁迫下,DNA甲基化是如何影响基因转录表达,本研究对甘露醇模拟干旱和5-azadC(去甲基化)处理下,抗旱性不同的2个马铃薯品种(抗旱型,青薯9号;干旱敏感型,大西洋)进行转录组学分析,以Fold-change>2和校正后P<0.01进行差异表达基因(DEG)的筛选。GO富集分析发现,2种处理都共同显著富集到氧化应激和碳水化合物代谢过程相关的GO term。说明不同耐旱性马铃薯在响应干旱胁迫时,与这些GO term相关的基因也受DNA去甲基化调控。对既响应干旱又响应DNA去甲基化的1345个DEG进行KEGG功能富集发现,与植物抗旱相关的通路有植物MAPK信号途径、植物激素信号转导途径、植物谷胱甘肽代谢通路、糖酵解与糖异生和磷酸肌醇代谢通路。说明这些通路相关基因在大西洋和青薯9号2个抗旱性不同的马铃薯品种中,响应干旱的敏感性受DNA甲基化调控。接着对DEG上游1500 bp启动子区域进行顺式作用原件和甲基化CpG岛分析发现,干旱胁迫下参与植物谷胱甘肽代谢的GST基因通过DNA去甲基化来降低启动子区ABRE和CAAT-box作用元件的甲基化水平,进而激活该基因的表达以应对干旱胁迫。因此,利用比较转录组学分析干旱和DNA去甲基化处理下的差异基因,可挖掘到DNA甲基化参与调控马铃薯响应干旱胁迫的相关基因,为研究马铃薯干旱胁迫响应的表观遗传学机理提供新的研究思路。     

小麦G2-like转录因子家族基因鉴定与表达模式分析

Golden2-Like (G2-like)转录因子,是属于MYB类转录因子中GARP超家族的成员,在调节叶绿体发育中起重要作用。本研究利用生物信息学方法对小麦G2-like基因进行了全基因组鉴定,并对其理化性质、亚细胞定位、启动子顺式作用元件及对非生物胁迫和激素的响应模式进行了分析。从小麦中共鉴定出87个G2-like基因,不均匀的分布在小麦21条染色体上,系统发育分析将这些基因分为14个亚族。蛋白质二级结构预测表明,小麦G2-like基因的氨基酸序列均以α螺旋和随机卷曲为主要结构。启动子顺式作用元件分析表明其上游2 kb区域含有7种(P-box、SpI、LTR、ABRE、MBS、TGA-element和AE-box)与逆境胁迫诱导相关顺式作用元件。其中Ta3AG2-like19含有顺式调控元件结合位点最多,一共有18个结合位点。qRT-PCR验证发现,Ta3AG2-like19、Ta3AG2-like20、Ta4AG2-like29和Ta6AG2-like52在PEG和盐胁迫下以及GA、IAA和ABA激素诱导下表达量显著上调,这些基因可能介导了小麦对多种非生物逆境的响应。     

普通小麦MYB转录因子Tamyb59的克隆及表达分析

为进一步挖掘小麦逆境胁迫响应基因在植物非生物逆境胁迫应答中的作用,探究小麦逆境胁迫响应机制,从前期转录组结果中筛选出1个编码MYB蛋白的基因,暂命名为Tamyb59,通过PCR技术扩增Tamyb59的全长;利用NCBI和DNAMAN软件进行基因序列比对和保守结构域的分析;利用Expasy和TMHMM等在线软件进行氨基酸组成、亲水系数分析;采用MEGA 6. 0软件构建系统进化树;构建pMDC83-GFP融合表达载体,进行基因表达的亚细胞定位分析。采用qRT-PCR分析了基因在不同非生物胁迫处理过程中不同组织的表达特性,并利用SAS数据处理软件进行差异显著性分析。结果表明:该基因含有典型的SANT保守结构域,CDS序列全长为522 bp,编码173个氨基酸,编码蛋白分子质量为19. 7 ku,理论等电点为7. 61。基因系统进化分析结果表明,Tamyb59与山羊草、粳稻、玉米等9种植物MYB转录因子有52. 0%～85. 6%的同源性,其中与谷子的MYB蛋白同源性最高。亚细胞定位结果显示,Tamyb59基因编码蛋白定位在细胞核。利用qRT-PCR分析了基因在不同非生物胁迫处理过程中不同组织的表达特性,组织表达特异性分析显示,Tamyb59基因在小麦根中的表达量较高,茎、叶和幼穗中表达量较低; PEG和盐胁迫处理过程中,Tamyb59基因的表达均呈现先上升后下降的趋势,说明Tamyb59基因对不同非生物胁迫有不同的响应。     

普通小麦春化处理过程中wcor14a基因的表达分析

为进一步完善普通小麦春化特性理论基础,从不同春化特性小麦品种RNA-Seq结果中筛选得到一个春化诱导上调表达的EST序列Unigene3230,经NCBI比对与小麦wcor14a基因序列一致。为进一步明确该基因在春化过程中的功能,利用荧光定量PCR分析了wcor14a基因在非生物胁迫下的表达特性,结果显示,wcor14a基因能够响应低温、ABA、干旱等非生物胁迫。对wcor14a基因在不同春化发育特性小麦品种中的表达分析表明,该基因在不同发育特性小麦品种中的表达总体表现为春性半冬性冬性强冬性,而且表达时间表现为冬性和强冬性早于春性和半冬性。     

萌发期干旱胁迫下棉花转录因子的表达

[目的]检测所筛选的转录因子GhNAC 1-6、GhMYB、GhDREB、GhWRKY在新疆主栽品种新陆早17号中是否响应干旱胁迫。[方法]通过实时荧光定量PCR检测萌发不同时期,在子叶和胚根中转录因子的表达变化。[结果]所有筛选的转录因子都响应PEG模拟干旱胁迫,在胚根中,转录因子集中在4d响应PEG胁迫。[结论]在棉花种子萌发期干旱胁迫下,所筛选的转录因子都响应干旱胁迫,且在胚根中NAC 1、MYB、WRKY倍数较大。     

中国樱桃(Prunus pseudocerasus Lindl.)IRAP分子标记技术体系的建立

基于中国樱桃LTR类反转录转座子的反转录酶(RT)序列信息设计引物,并根据扩增谱带的数量、多态性和可重复性等指标筛选IRAP-PCR引物;采用5因素4水平L_(16)(4~5)的完全随机正交试验,对影响PCR体系的主要因子进行优化,建立了中国樱桃IRAP分子标记反应体系。结果表明,筛选出9条引物,可以扩增222个清晰位点,位点的平均多态性比率为90.09%。PCR的最佳反应体系为25 μL,含2.0 mmol·L~(-1)MgCl_2、1.0 U Taq酶、0.2 mmol·L~(-1)引物、20 ng模板DNA、0.3 mmol·L~(-1)dNTP,采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。     

外源ABA对干旱胁迫下不同品种灌浆期小麦psbA基因表达的影响

脱落酸(abscisic acid, ABA)是一种重要的植物激素,与作物的抗干旱胁迫密切相关。本试验以灌浆期的豫麦949和陕麦5号小麦品种为试材,PEG干旱处理72 h后,比较了脱落酸对小麦相对水分含量、叶绿素、丙二醛含量以及产量的影响,并采用反转录半定量PCR方法测定PSII中psbA基因转录水平的变化。结果表明,干旱胁迫明显降低小麦叶片中相对水分和叶绿素含量,增加丙二醛含量,抑制psbA基因的转录,降低小麦的产量,而外源脱落酸能明显缓解这些胁迫反应。与豫麦949相比,陕麦5号中质膜损伤较小,相对水分和叶绿素含量、产量以及psbA基因转录水平的下降也较小,外源脱落酸处理后,各参数也能够恢复到对照水平,说明不同小麦品种的抗干旱胁迫能力与psbA基因的表达水平密切相关。本试验的研究结果也首次发现了外源ABA能够调控干旱胁迫下灌浆期小麦psbA基因的表达,稳定PSII系统中重要基因的转录水平,从而提高灌浆期小麦的抗干旱胁迫能力。     

小麦抗坏血酸过氧化物酶TaAPX基因克隆与表达分析

为了研究非生物胁迫处理下小麦抗坏血酸过氧化物酶(APX)的作用,以小麦百农207为试验材料,根据小麦APX基因序列,采用RT-PCR技术对小麦APX基因进行克隆、生物信息学分析及组织表达模式分析;对小麦进行非生物胁迫处理,分析小麦APX基因在环境胁迫条件下的表达特征。结果表明,TaAPX基因包含876 bp的开放阅读框,编码1个291个氨基酸组成的蛋白质,分子质量为31.73 ku,等电点为7.74,分子式C_(1417)H_(2246)N_(394)O_(423)S_5,TaAPX可能是两性蛋白,无信号肽,为非分泌蛋白。蛋白质序列比对和进化树分析表明,小麦与大麦的APX编码蛋白的氨基酸全长序列相似性最高达到97.25%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,TaAPX在小麦幼根、茎、茎节、幼叶、叶鞘、雌蕊和雄蕊中均有表达,其中在幼叶中表达量最高,其次是茎、茎节,在幼根、叶鞘中表达量较低,在雌、雄蕊中表达量最低。在非生物胁迫条件下该基因受干旱、低温胁迫表达增强,而在NaCl胁迫和渗透胁迫下表达降低。综上,获得了TaAPX基因的编码区序列,分析发现其响应干旱、低温和盐等逆境胁迫,提示该基因可能与小麦抗逆境机制密切相关。     

利用WGCNA鉴定玉米非生物胁迫相关基因共表达网络

加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)是一种经典的系统生物学分析方法,可用来鉴定协同表达的基因模块,探索模块与目标性状的生物学相关性,并挖掘模块网络中的核心基因。本文收集了低温胁迫、高温胁迫、干旱胁迫和盐胁迫处理下玉米(Zea mays L.)根、茎、叶等组织的58份转录组数据,利用WGCNA方法鉴定玉米非生物胁迫的基因共表达网络模块。过滤转录组数据中12,552个低表达基因后,利用余下27,204个高表达基因构建共表达网络,分析得到25个模块。根据玉米中已报道非生物胁迫相关基因与差异表达基因在模块中的分布,筛选出与低温胁迫、高温胁迫、干旱胁迫和盐胁迫最相关的mediumpurple4、ivory、coral2、darkseagreen4模块和响应多种胁迫的green模块。随后对这5个模块的基因进行GO富集分析,发现在这些模块内与非生物胁迫相关基因的在非生物胁迫调控相关功能显著富集,如胁迫响应、过氧化物酶活性等。对这5个模块作相关性分析,预测出Zm00001eb072870、Zm00001eb32...     

扁蓿豆DNA甲基转移酶基因MrMET1的克隆及表达分析

DNA甲基化是一类重要的表观遗传修饰,在植物对非生物胁迫的响应中发挥重要作用。DNA的甲基化需要DNA甲基转移酶催化。为挖掘扁蓿豆中DNA甲基转移酶基因,解析其是否参与扁蓿豆抗逆性应答,本研究利用RT-PCR技术从扁蓿豆中克隆到1个胞嘧啶5-甲基DNA转移酶基因,该基因含1 071 bp的开放阅读框,编码357个氨基酸。生物信息学分析确定该基因为DNA甲基转移酶1 MrMET1基因。实时荧光定量PCR显示,MrMET1基因在不同非生物胁迫(低温,干旱, NaCl)及ABA处理下,不同时间表达量呈现不同的变化趋势,推测该基因参与了扁蓿豆对非生物胁迫的响应。本研究结果对深入解析METs基因的功能,理解牧草对非生物逆境胁迫响应机制具有一定的参考意义。     

甜菜ERF转录因子基因克隆及非生物胁迫响应分析

ERF(Ethylene-responsive element binding factors)是调控植物生长发育和响应胁迫的重要转录因子，在植物应对生物及非生物胁迫反应、调控胁迫相关功能基因的表达、提高植物的抗逆性中起着重要的作用。分析甜菜ERF转录因子基因在非生物胁迫下的表达规律，旨在为深入研究ERF转录因子在甜菜逆境胁迫应答中的作用机制提供理论依据。本研究以高糖型甜菜品系‘BS02’为试材，利用RT-PCR方法克隆得到Bv＿ammr基因，并对其进行生物信息学分析。该基因CDS区长906 bp，编码301个氨基酸。蛋白质分子量为33.19 kD，理论等电点为8.61，其二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主，具有一个AP2保守结构域；氨基酸序列的同源性和进化树分析显示其编码蛋白与马兜铃菌毛所编码的蛋白亲缘关系较近。采用实时荧光定量PCR方法观测非生物胁迫下该基因表达模式，结果表明，Bv＿ammr基因对低温、高温、干旱、盐、ABA等非生物胁迫有不同程度响应。     

扁蓿豆DNA甲基转移酶基因MrDRM2的克隆和生物信息学分析

由DNA甲基转移酶催化的DNA甲基化在调控基因表达及植物生长发育中发挥重要作用。本研究根据扁蓿豆(Medicago ruthenica L.)的转录组测序信息设计特异性引物,利用RT-PCR技术从中克隆到1个DNA甲基转移酶基因的c DNA片段,长1 767 bp,编码588个氨基酸残基。利用生物信息学分析推测这个基因属于DNA甲基转移酶中的结构域重排甲基转移酶(domains-rearranged methyltransferases, DRMs)亚家族。系统发育分析表明该基因与豆科其他植物的DRM2基因具有较高的同源性。利用实时荧光定量PCR分析其在扁蓿豆受到低温(4℃)、Na Cl、干旱胁迫及ABA处理下不同时间的表达量,发现其表达受非生物胁迫诱导。推测MrDRM2基因参与了扁蓿豆对非生物胁迫响应的调控。本研究结果可进一步丰富扁蓿豆DNA甲基转移酶基因信息,为深入理解扁蓿豆DNA甲基转移酶基因的功能及其在非生物胁迫应答中的表观遗传调控提供一定的基础。     

百合响应非生物胁迫的分子机制研究

非生物胁迫严重影响了百合的生产、生长发育过程,百合有应对高温、寒冷、干旱、高盐或激素ABA等非生物胁迫的能力,百合可以通过胁迫信号感知、信号激活、信号转录和转导,并通过一系列相应胁迫的基因的表达以及生理反应来响应非生物胁迫。百合对非生物胁迫的响应过程比较复杂,响应过程分为胁迫信号的接受与感受,信号的转导,转录调控基因的表达。本研究分别从转录组测序和蛋白质组学方面,对百合响应非生物胁迫的基因表达机理及百合在非生物胁迫分子机制成果进展进行总结阐述,并讨论了培育抗逆性强的百合品种的前景,为百合分子育种提供理论参考。     

山羊草谷胱甘肽S-转移酶基因家族鉴定及表达分析

谷胱甘肽S-转移酶是一种多功能蛋白酶,在植物体内参与干旱、盐、低温、重金属等多种非生物胁迫的调节;山羊草是普通小麦D染色体组的供体物种,深入挖掘山羊草中GST基因,对进一步分析六倍体小麦GST基因的功能具有重要意义。本研究利用信息生物学手段,在山羊草中共发现114条GST基因序列,分属于6个亚族;基因复制分析发现共4对基因发生了基因复制,且均为纯化选择;采用荧光定量PCR对部分GST基因在非生物胁迫下的表达分析发现,8个GST基因在响应干旱和盐胁迫时,主要在根部显著上调表达,3个GST基因在响应低温胁迫时,在根和叶中均显著上调表达,说明山羊草中的GST基因在应答非生物胁迫时,在不同组织中的表达存在着差异。     

二穗短柄草BdDREB1 H基因的克隆和表达分析

植物DREB转录因子在应答干旱、低温和高盐等非生物胁迫过程中发挥着重要作用,为了探讨二穗短柄草BdDREB1H转录因子在应答逆境胁迫的作用,对其序列进行了克隆、生物信息学和转录激活分析。然后利用qRT-PCR法对其在根、茎、叶3种组织和冷、干旱、盐和过氧化氢4种非生物胁迫条件下的表达模式进行了研究。结果显示,BdDREB1H转录因子基因全长编码框为735 bp,编码244个氨基酸,相对分子量26.34 ku,理论等电点5.63,不稳定指数(Ⅱ)64.17,为不稳定蛋白质;总亲水平均值-0.261,为亲水蛋白。多序列比对与结构域分析结果表明,BdDREB1H转录因子含有一个典型的AP2结构域,属于AP2/EREBP (APETALA2/ethylene-responsive element binding protein)超家族的DREB亚家族成员。进化分析显示,它与普通小麦的CBF蛋白亲缘关系较近,序列相似性64.44%。酵母单杂分析显示,BdDREB1H转录因子具有转录活性。组织表达分析显示,BdDREB1H基因在根、茎、叶中均有表达,其中在茎中表达量最高。胁迫处理表达分析结果表明,冷处理条件下,BdDREB1H的表达先升高后下降;干旱和氧化胁迫处理条件下,BdDREB1H在2 h后表达水平均显著高于对照;而盐胁迫条件下,BdDREB1H在2 h后表达水平均显著低于对照。这些结果表明,BdDREB1H转录因子可能参与了植物逆境胁迫反应,为进一步探索其在二穗短柄草中的抗逆分子机制奠定了基础。