向日葵HaLACS7基因的生物信息学和表达分析

LACS（long-chain acyl-CoA synthetase）编码长链酰基CoA合成酶,能把游离脂肪酸转化成长链酰基辅酶A,在油脂代谢过程中有重要的作用。对向日葵HaLACS7编码蛋白进行生物信息学分析,预测HaLACS7编码蛋白为酸性蛋白且为亲水性蛋白,蛋白二级结构为无规则卷曲,亚细胞定位于过氧化物酶体。经系统进化分析发现,HaLACS7与莴苣（Lactuca sativa L.）和洋蓟（Cynara cardunculus var. scolymus L.）的LACS6进化关系最近,序列相似性均为84%,且与拟南芥LACS6和LACS7聚在一个大分支上。HaLACS7在向日葵中组织的表达量大小为舌状花>根>种子>管状花>叶>茎。HaLACS7在高、低油酸向日葵种子发育后期表达量均较高,但2份材料种子在不同发育时期表达变化趋势明显不同,推测HaLACS7的表达可能影响向日葵种子油酸的合成。     

油用向日葵铵转运基因HaAMT1.1的克隆及功能分析

AMT1.1是铵转运家族的基因之一,在植物吸收转运 NH₄⁺中起到重要作用。为了明确氮素在植物体的转运吸收机制,本研究以油用向日葵‘早矮大头’为研究材料,成功从中克隆向日葵 AMT1.1 的同源基因HaAMT1.1。生物信息学分析表明该基因 CDS 区长 1 497 bp,编码 491 个氨基酸;正电荷残基 28 个,占氨基酸总数的 5.7%,负电荷残基 30 个,占氨基酸总数的 6.1%;其分子式为 C₂₄₁₇H₃₆₂₅N₅₉₇O₆₆₈S₂₂,预测分子量为52 439.29 Da,理论等电点为 6.58;HaAMT1.1 为疏水性蛋白,无跨膜结构域,具有 Ammonium Transp 超家族保守结构域,与黄花蒿 AMT1.1 亲缘关系最近。亚细胞定位结果表明 HaAMT1.1 位于细胞质膜和细胞核上。实时荧光定量 PCR 分析表明,不同组织中 Ha AMT1.1 基因在根系中表达量最高;不同 NH₄^...     

甘蓝型油菜BnMAPK2基因的克隆及功能分析

从甘蓝型油菜中分离克隆了BnMAPK2(BnaA01g21880D)基因,cDNA及其编码序列长度分别为1516bp、1113 bp,编码370个氨基酸。生物信息学分析表明, BnMAPK2蛋白分子量为42,497.0 kD,等电点为6.36,蛋白不稳定系数38.74,为疏水性蛋白,具有MAPKs蛋白特有的STKc_TEY_MAPK_plant(cd07858)保守结构域;蛋白二级结构中α螺旋所占比例最大,为44.05%,无信号肽;与拟南芥C族AtMAPK2的亲缘关系更近。核心元件预测结果显示,BnMAPK2-P含有响应水杨酸激素、热胁迫和光照等相关顺式作用元件,包括TCA-element、HSE、AAAC-motif和MYB结合位点等。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)结果表明, BnMAPK2在甘蓝型油菜中的各个组织器官中均有表达,受到茉莉酸甲酯、水杨酸、H₂O₂、损伤、高温和核盘菌的诱导。转基因异源表达BnMAPK2拟南芥株系的表型数据发现,与野生型相比,超量表达BnMAP...     

牛GDF-9基因的克隆与组织表达的分析

为了检测牛GDF-9基因mRNA在怀孕期牛生殖系统的表达情况,为GDF-9基因在雌性动物繁殖上的研究提供一定的理论依据。本试验根据GenBank中报道的牛GDF-9基因序列设计引物,从牛卵巢、输卵管、子宫、肾脏中提取RNA,采用RT-PCR技术进行cDNA扩增,扩增产物与载体pGM-T连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,测序。结果表明,已成功克隆的阳性重组子经测序鉴定其片段大小与预期大小完全一致,为264 bp。序列同源性分析比较表明,该cDNA及其推导的氨基酸序列与绵羊GDF-9cDNA和氨基酸序列同源性分别为97%和94%。以-βactin为内参照物,采用RT-PCR技术进行半定量分析,通过检测比较牛GDF-9基因在卵巢、输卵管、子宫、肾脏组织中mRNA的表达情况。结果表明,牛GDF-9基因在卵巢中表达量最高,在输卵管、子宫、肾脏中均有表达,但表达量不高。     

桃PpATP9与PpATP4基因的克隆与表达分析

为探究桃PpATP9和PpATP4基因在自然越冬过程中的表达情况,以‘21世纪’、‘珲春’、‘中华寿桃’为试材,根据PpATP9 (MF062454.1)与PpATP4 (MF062457.1)全长序列设计引物,从三个桃品种中分别克隆得到243 bp的PpATP9全长基因序列和597 bp的PpATP4全长基因序列。三个桃品种中的PpATP9和PpATP4氨基酸序列与已知序列完全一致,序列高度保守。氨基酸理化分析表明,PpATP9与PpATP4蛋白理论分子量分别为8.051和22.122 kD,理论等电点分别为5.32和9.34,脂肪族氨基酸指数分别为99.12和104.34,均为不稳定蛋白。聚类分析表明PpATP9与苹果(Malus domestica) ATP9基因亲缘关系最近,PpATP4与扁桃(Prunus dulcis L.)和红叶李(Prunus cerasifera) ATP4基因的亲缘关系最近。RT-qPCR结果显示,PpATP9基因在三个桃品种花芽中的表达量与温度变化趋势一致,而在韧皮部中,‘21世纪’与‘中华寿桃’呈先升高后降低趋势,‘珲春’则呈现降低趋势。PpAT...     

甘蓝型油菜BnCOP9基因的克隆及其环境信号响应分析

植物COP9(Constitutively photomorphogenic 9)信号体(CSN)是一个多亚基复合体,而CSN8是这个复合体必不可少的亚基。为了克隆油菜CSN8基因并分析其在各种环境信号下的表达变化,以甘蓝型油菜中双9号为材料,采用同源克隆法克隆油菜CSN8(BnCOP9)cDNA。序列分析表明,BnCOP9编码的蛋白含有197个氨基酸残基,在其蛋白质中部含有1个PCI结构域,与Arabidopsis thaliana CSN8(AtCOP9)有92%的相似性。定量RT-PCR分析显示,Scle-rotinia sclerotiorum、伤处理以及甲基茉莉酸快速激活BnCOP9的表达,苯丙噻重氮抑制其表达,表明BnCOP9作为各种环境信号的响应基因在水杨酸和茉莉酸信号的交叉谈话中及油菜对S.sclerotiorum和机械伤害反应的网络中起作用,这些结果为研究BnCOP9在油菜抗逆中的作用提供线索。     

向日葵HaFATB基因的生物信息学和表达分析

向日葵油中不饱和脂肪酸主要为油酸和亚油酸,当不饱和脂肪酸总量一定,油酸含量越高,营养价值和品质越好,且不易氧化腐败。FATB编码脂肪酸-酰基载体蛋白硫酯酶B,将脂肪酸链从酰基载体蛋白中释放出自由的脂肪酸。本研究对向日葵HaFATB编码蛋白进行了生物信息学的分析,预测HaFATB编码蛋白为碱性蛋白且为亲水性蛋白,蛋白二级结构为无规则卷曲,预测亚细胞定位于叶绿体。系统进化分析发现,HaFATB基因与同属菊科的青蒿(Artemisia annua L.) FATB进化关系最近,序列相似性高达88%。HaFATB组织特异性表达分析结果表明,HaFATB在茎、管状花和根中表达最低,其次是叶和舌状花,在部分发育时期的种子中表达较高,HaFATB在高、低油酸向日葵种子不同发育阶段表达变化趋势明显不同,但均在种子发育前期表达较低,总的来说低油酸种子中表达量要高于高油酸种子,因此认为Ha FATB的表达量很可能影响着向日葵种子的油酸含量。     

分离和鉴定油菜D型MAP激酶基因BnMPK9

为了应对不良的外界环境,植物形成了一整套复杂的信号网络体系以适应变化的外界环境。其中MAPK级联是其中一个重要而保守的信号传导系统。采用RT-PCR策略,从干旱处理的油菜cDNA中克隆出全长的细胞分裂原激活的蛋白激酶基因。该基因命名为BnMPK9(GenBank登录号为AY737714),包含一个蛋白激酶区和一个保守的CD区。该基因与拟南芥AtMPK9高度同源,其激酶的磷酸化位点为TDY,同为D型MAPK亚家族基因。Southern杂交结果表明该基因在油菜基因组中拷贝数不少于2个。Northern杂交结果显示该基因能在不同的植物组织中表达。其表达受到甘露醇、紫外线和双氧水诱导上调表达,但低温和水杨酸处理后下调表达。实时RT-PCR分析表明甘露醇和双氧水能长时间诱导该基因高表达。在根中,甘露醇也能促进其上调表达。BnMPK9连接到pYES2.1酵母表达载体中转化酵母,发现增强了酵母对600 mmol L^–1甘露醇和0.2 mmol L^-1 tBuOOH的抗性。以上结果说明BnMPK9是MAPK基因家族中的一员,涉及真核生物细胞渗透和活性氧胁迫,并增强其抗性。     

向日葵Ha KASI基因的生物信息学和表达分析

KASI编码β-酮脂酰-ACP合酶I,主要催化C4-ACP生成C16-ACP。为了解向日葵HaKASI基因的表达特性及功能,本研究对其编码蛋白进行生物信息学和基因表达模式分析,预测HaKASI为酸性且为亲水性蛋白;结果显示二级结构主要是无规则卷曲,预测亚细胞定位于叶绿体。系统进化分析发现,HaKASI与拟南芥及其他物种的KASI聚在一个大分支上,与莴苣(Lactuca sativa L.) KASI进化关系最近,序列相似性高达92%。HaKASI表达分析结果表明,HaKASI在向日葵种子中表达最高,其次为管状花和茎,在叶、舌状花和根中不表达,HaKASI在高、低油酸种子发育不同时期表达趋势大体一致,表达量均从7～12 DAF升高,之后降低,但在37 DAF,HaKASI在低油酸种子中表达量极高,明显高于高油酸种子,这暗示HaKASI在油酸含量不同的向日葵种子发育后期可能存在不同的表达调控机制。本研究为HaKASI基因功能的研究提供科学依据。     

向日葵病程相关蛋白HaPR1基因的克隆与功能研究

病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins)经常被用作植物抗病反应的分子标记。本文在核盘菌诱导向日葵转录组文库的基础上克隆1个病程相关蛋白1基因HaPR1的cDNA全长序列,并进行了表达模式和功能分析。结果表明, 该基因cDNA全长开放阅读框为489 bp,编码162个氨基酸,分子量为17.52 kD,等电点为8.19,具有6个保守半胱氨酸,4个保守的allergen V5/Tpx-1结构域,GenBank登录号为KR071874。经比较HaPR1与多种物种PR1高度同源。实时荧光定量PCR检测结果表明,HaPR1相对表达量在向日葵叶中最高,根中其次,茎中最低。干旱、盐、草酸、核盘菌及其代谢物均可显著诱导其表达。利用农杆菌介导法将该基因导入烟草,提高了转基因株系对核盘菌的抗性。对抗性株系烟草防御酶活性及丙二醛含量测定发现转基因烟草叶片在核盘菌胁迫下显著提高了SOD、POD和CAT活性,降低了MDA含量。初步推断HaPR1具有抗核盘菌的功能。     

向日葵甜菜碱醛脱氢酶的电子克隆与分析

采用电子克隆技术获得了向日葵甜菜碱醛脱氢酶基因的cDNA序列(HaBADH)。该序列长1901bp,编码一个由503个氨基酸残基组成的蛋白质。HaBADH与其他物种的BADHs在蛋白质水平上表现较高的相似性,在进化上与同科的甘菊BADH蛋白距离较近。HaBADH蛋白具有醛脱氢酶家族高度保守的十肽和与酶功能有关的氨基酸残基Cys。     

甘蓝自交不亲和相关基因BoPUB9的克隆及表达分析

自交不亲和性(self-incompatibility,SI)是指植株的雌蕊对自身花粉和异体花粉进行识别从而抑制自身花粉萌发的特性, PUB (Plant U-Box)蛋白在植物抗逆及信号转导过程中起着重要的作用。本研究通过分析甘蓝自花授粉0～60min的柱头转录组数据,筛选到1个受自花授粉诱导上调表达的PUB蛋白编码基因BoPUB9。BoPUB9 cDNA序列长度为1368 bp, gDNA序列全长1720 bp,含有1个臂重复结构域和1个U-box结构域。荧光定量PCR结果显示, BoPUB9基因在甘蓝的不同组织中均有表达,在萼片中的表达量最高,花瓣、雄蕊、柱头表达量次之,在花粉花蕾中表达量相对较低,同GUS染色结果保持一致。BoPUB9基因在自花授粉0～30 min内快速上调表达, 15 min后为异花授粉后表达量的20多倍,在30min后达到差异最大,自花授粉后的表达量为异花授粉的40多倍。亚细胞定位结果显示,BoPUB9蛋白在细胞核和细胞质中均有表达,且BoPUB9蛋白在大肠杆菌中被成功诱导表达,相对分子质量为51 kD,与预测结果一致。酵母双杂交与poll-down结果显示...     

一个棉花GDSL脂肪酶基因的克隆与功能分析

GDSL脂肪酶与GXSXG脂肪酶是2个重要的脂肪酶亚家族。其中, GDSL家族脂肪酶具有水解酶活性, 能水解多种酯类物质。本试验根据新乡小吉无绒无絮(XinWX)和无绒有絮(XinFLM)近等基因系纤维起始期29K芯片竞争杂交结果, 选择了一个在纤维起始期具有极显著表达差异的EST序列(GenBank登录号为DR458916), 以该序列信息为探针, 利用电子克隆方法并进行cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证, 克隆获得一个陆地棉GDSL脂肪酶基因(GhGDSL;GenBank登录号为KC186125)。该基因ORF长1065 bp, 编码354个氨基酸, 含有5个外显子和4个内含子。该基因在二倍体棉种基因组中含一个拷贝, 在四倍体棉种基因组中含2个拷贝。序列比对显示该基因在四倍体棉种的2个亚组中独立进化, 且D亚组比A亚组变异大。染色体定位显示该基因2个拷贝分别位于A4 (Chr. 4)和D4 (Chr. 22)染色体上。定量RT-PCR结果表明, GhGDSL在开花后3~10 d的纤维组织中表达量高, 其中在海7124中表达高峰在8DPA, 在TM-1中表达高峰从5DPA持续到10DPA。利用[(TM-1×Hai7124)×TM-1]的BC₁S₁群体开展GhGDSL功能与纤维、种子品质性状关联分析, 发现该基因A亚组的拷贝与种子脂肪含量存在显著相关(P=0.048);D亚组的拷贝与种子蛋白含量存在极显著相关(P=0.008)。推测GhGDSL基因功能与种子中脂肪、蛋白代谢相关, 同时也参与纤维伸长过程。     

小麦TaMKK2基因的克隆及功能分析

小麦在生育周期内会遭遇多种非生物胁迫，制约小麦的生长发育。为了提升小麦新品种的抗逆性，本研究基于MAPK抗逆性基因开展实验，以冬小麦新品种‘新冬43号’为实验材料，采用同源克隆方法，获得了MKK2基因，暂命名为TaMKK2，对其编码的基因序列进行了生物信息学分析，并对该基因进行了亚细胞定位和原核表达分析。结果表明，该基因的cDNA序列全长为531 bp，含有1个完整的开放阅读框，编码176个氨基酸，相对分子量约20.07 kD，等电点为8.37；与山羊草、二穗短柄草MKK2基因的亲缘性较近；理论定位于细胞核上，然而实验操作未能检测到荧光信号；各诱导条件下目的蛋白均以包涵体形式存在，纯化复性后得到大小为20.07 kD的目的蛋白。本研究结果为小麦应对非生物胁迫以及利用基因育种技术改良植物抗逆性提供理论依据。     

向日葵PMADS2 LIKE基因的克隆及表达分析

MADS-box家族基因是调控花发育进程的关键转录因子。在向日葵中大量的花发育相关基因有待于发掘和鉴定。本研究以向日葵(Helianthus annuus)为材料克隆到了一个MADS-box新成员PMADS2 LIKE。序列分析结果显示该基因具有MADS-box家族典型的MIKC保守结构域;系统发育树分析发现该基因与拟南芥PI基因亲缘关系最近;q RT-PCR组织表达模式分析该基因仅在花和果实中表达,且在6个花器官中仅在雄蕊和花瓣表达;q RT-PCR定量分析表示该基因从开花前25 d一直表达到开花期,并且在开花前5 d表达量最高。研究结果表明,PMADS2 LIKE基因在花发育和果实发育中具有一定的生物学功能。本研究的结果和推论为进一步探究向日葵PMADS2 LIKE基因在花发育和果实发育中的生物学功能提供前期数据基础,为理清MADS-box基因在向日葵花发育中的调控网络提供线索。     

大豆Gm TIP1;1基因的克隆与表达分析

利用RT-PCR方法从大豆根部组织获得Glyma03g34310.1开放阅读框(ORF)全长, 经测序验证、Blast比对与同源性分析发现该序列编码的蛋白质与其他植物的TIP1;1蛋白具有较高的相似性, 故命名为GmTIP1;1基因(GenBank登录号为AK285481), 该基因ORF长753 bp, 编码1个包含250个氨基酸的蛋白, 在ORF内部第381个核苷酸处含有1个94 bp的内含子, 符合↓GT--AG↓的剪接方式; 系统进化树分析发现Gm TIP1;1聚类到豆科植物分支, 其他不同科的植物也有规律地聚到了不同分支, 推测该蛋白氨基酸序列可以作为植物分类的依据; 半定量RT-PCR结果表明该基因在大豆的不同器官、不同器官的不同发育阶段均具较高且同等的表达水平, 暗示该基因在植物的整个发育进程中均具重要作用; 在盐胁迫的不同时间点其表达量有下降的趋势, 但仍然保持较高的表达水平; 以pYES2为酵母表达载体, 转化酿酒酵母INVSc1菌株, 获得重组酵母INVSc1 (pYES2-GmTIP1;1), 转化菌株在盐胁迫下的存活率明显高于对照INVSc1 (pYES2), 而在干旱胁迫下则没有显著差异, 表明该基因的表达能有效地提高酵母的耐盐性。     

甘薯抗旱相关基因IbNAC72的克隆与功能分析

NAC(NAM/ATAF/CUC,NAC)转录因子是植物中特有的转录调控因子,在植物体的生长发育与逆境胁迫响应等多种生理过程中起着重要的调控作用。本研究利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)从甘薯品种栗子香中克隆到甘薯抗旱相关基因IbNAC72,该基因cDNA长为1319bp,开放阅读框(open reading frame, ORF)为1008 bp,编码335个氨基酸,分子量为37.4 kD,等电点为8.76,基因组全长为1199 bp,含有3个外显子、2个内含子。多重序列比对和系统进化树分析显示, IbNAC72基因与牵牛花中同源基因的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,IbNAC72基因在甘薯叶片中的表达量显著高于在茎段和根系中;同时Ib NAC72基因受到干旱和盐胁迫显著诱导表达。利用农杆菌介导法转化烟草,获得过表达IbNAC72基因的转基因烟草植株。对IbNAC72转基因烟草植株的抗旱性分析表明,在长时间干旱条件下,转基因植株的根系更加发达, SOD活性显著提高, MDA的含量显著降低,抗旱性显著提高...     

一个棉花GDSL脂肪酶基因的克隆与功能分析

GDSL脂肪酶与GXSXG脂肪酶是2个重要的脂肪酶亚家族。其中, GDSL家族脂肪酶具有水解酶活性, 能水解多种酯类物质。本试验根据新乡小吉无绒无絮(XinWX)和无绒有絮(XinFLM)近等基因系纤维起始期29K芯片竞争杂交结果, 选择了一个在纤维起始期具有极显著表达差异的EST序列(GenBank登录号为DR458916), 以该序列信息为探针, 利用电子克隆方法并进行cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证, 克隆获得一个陆地棉GDSL脂肪酶基因(GhGDSL;GenBank登录号为KC186125)。该基因ORF长1065 bp, 编码354个氨基酸, 含有5个外显子和4个内含子。该基因在二倍体棉种基因组中含一个拷贝, 在四倍体棉种基因组中含2个拷贝。序列比对显示该基因在四倍体棉种的2个亚组中独立进化, 且D亚组比A亚组变异大。染色体定位显示该基因2个拷贝分别位于A4 (Chr. 4)和D4 (Chr. 22)染色体上。定量RT-PCR结果表明, GhGDSL在开花后3~10 d的纤维组织中表达量高, 其中在海7124中表达高峰在8DPA, 在TM-1中表达高峰从5DPA持续到10DPA。利用[(TM-1×Hai7124)×TM-1]的BC₁S₁群体开展GhGDSL功能与纤维、种子品质性状关联分析, 发现该基因A亚组的拷贝与种子脂肪含量存在显著相关(P=0.048);D亚组的拷贝与种子蛋白含量存在极显著相关(P=0.008)。推测GhGDSL基因功能与种子中脂肪、蛋白代谢相关, 同时也参与纤维伸长过程。     

巴西橡胶树HbACO16基因的克隆与功能分析

天然橡胶是一种战略性工业原料,中国消费的天然橡胶严重依赖进口。外源乙烯刺激可以激活橡胶树树皮乙烯的合成并提高橡胶树胶乳产量,但是其分子机制仍不清楚。1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)是植物体内乙烯生物合成途径中的关键酶,本研究从橡胶树树皮中克隆了预测的HbACO16的编码序列,通过生物信息学对其理化性质进行初步分析,该基因编码362个氨基酸,等电点为6.04,预测蛋白大小为48 kD。为了进一步验证其体外酶活性,在大肠杆菌中表达了HbACO16的重组蛋白,结果表明HbACO16重组蛋白不具有ACO酶活性。本研究为解析橡胶树内源乙烯合成中关键蛋白ACO的生理功能提供了参考。