准噶尔无叶豆EsDREB2B基因在烟草中的抗逆功能分析

DREB(dehydration responsive element binding protein)转录因子在植物响应非生物胁迫上具有重要作用,是颇具潜力的植物抗逆育种候选基因。本研究旨在通过烟草体系,验证前期从准噶尔无叶豆中克隆的Es DREB2B基因在种子萌发和成苗成长阶段的抗逆功能,并初步探究其调控的下游靶基因。结果表明:转基因株系在干旱、高盐、冷和热胁迫处理下的萌发率都高于野生型烟草,其中盐和热胁迫下萌发率差异尤为显著;两月大转基因烟草与野生型植株进行干旱、高盐、冷和热胁迫处理后,转基因较野生型植株叶片萎蔫,黄化和伤害程度较轻,在热胁迫下差异最为显著;恢复培养后,大多野生型烟草表现为枯死状态,转基因植株则叶片萎蔫减轻并开始生长,并且转基因烟草存活率显著高于野生型,均达到了野生型的3~4倍。ERD10B和Hsp70基因在四种胁迫后的转基因烟草中的表达量均较野生型高,Hsp90在热胁迫下较野生型表达量升高,而Mn SOD,P5CS等基因的表达量变化不显著。以上结果表明,Es DREB2B基因能提高烟草抗干旱、高盐、冷和热胁迫的能力,是具有潜力的抗逆分子育种候选基因。     

费尔干猪毛菜病程相关蛋白SfPR1a基因的异源表达增强了烟草对干旱、盐及叶斑病的抗性

为明确一年生草本盐生植物费尔干猪毛菜(Salsola ferganica Drob.)病程相关蛋白基因SfPR1a (GenBank登录号为JQ670917)是否参与了植物对逆境胁迫的响应,采用qRT-PCR检测了该基因在不同组织部位和脱落酸(ABA)、茉莉酸(JAs)、乙烯合成直接前体(ACC)等相关激素胁迫及NaCl处理下的表达规律,同时对转基因烟草在盐、旱及丁香假单胞菌等胁迫下的抗性进行了鉴定。结果显示, SfPR1a基因在费尔干猪毛菜根中的表达量显著高于茎叶中,且受到ABA、JAs、ACC、NaCl的积极诱导;干旱胁迫下,转基因烟草的丙二醛(MDA)含量显著低于野生型烟草,显示出较强的抗旱表型;盐胁迫下,异源表达SfPR1a的转基因烟草幼苗生长显著优于野生型烟草;丁香假单胞菌攻毒后的转基因烟草叶片呈现严重的坏死反应,但植株的整体抗性表型显著优于野生型烟草;亚细胞定位结果显示该蛋白定位于植物细胞质外体空间。以上结果表明,费尔干猪毛菜病程相关蛋白SfPR1a基因参与了植物对非生物及生物胁迫的抗性。     

菊花DmDREBa/b基因提高转基因烟草耐逆性研究

本研究组前期从菊花(Dendranthema morifolium)中克隆得到两个DREB同源基因-Dm DREBa/b,发现两者都受到低温诱导。为了进一步探究该基因的功能,本研究通过农杆菌介导的叶盘转化法将Dm DREBa/b分别导入烟草,并对这两个基因进行了耐逆性分析。结果表明,在4℃低温处理下,过表达Dm DREBa和Dm DREBb基因的烟草的鲜重和存活率都显著高于对照,并且转基因烟草的MDA含量低于对照,而POD活性高于对照;在高盐胁迫下,过表达Dm DREBb基因烟草株系的鲜重、POD活性以及脯氨酸含量都显著高于对照和过表达Dm DREBa基因烟草株系,并且过表达Dm DREBb烟草的存活率达到53%,显著高于对照的存活率20%;而对转基因烟草进行干旱胁迫后,过表达Dm DREBa烟草株系鲜重、POD活性和脯氨酸含量则均显著高于对照和过表达Dm DREBb烟草,且有60%的过表达Dm DREBa烟草恢复生长,显著高于对照(13%)和过表达Dm DREBb烟草(27%)。因此,本研究进一步证明菊花Dm DREBa和Dm DREBb基因均参与低温胁迫调控网络途径,能够提高转基因烟草耐低温能力,其中,Dm DREBa表现为更加积极调控转基因烟草的干旱胁迫,而Dm DREBb则更可能参与响应转基因烟草的高盐胁迫。     

OsWRKY67负向调控水稻耐旱性的功能分析

WRKY转录因子在水稻生物胁迫及非生物胁迫中均发挥重要作用。本实验室前期发现OsWRKY67正向调控水稻应答病害胁迫,为研究OsWRKY67在水稻非生物胁迫中的作用,本研究对低温、干旱、高盐、ABA、高渗透压和活性氧等多种非生物胁迫处理下的OsWRKY67基因的表达量进行测定,结果表明该基因的表达受上述非生物胁迫的影响。此外,本研究对OsWRKY67基因的过表达株系(OX5-2和OX6-5)、基因沉默株系(R9-4, R11-2和R14-2)和野生型‘日本晴’进行模拟干旱胁迫处理,结果表明沉默OsWRKY67基因可显著增强水稻的耐旱性,过表达OsWRKY67基因会显著降低水稻的耐旱性。进一步研究发现OsWRKY67能够调控部分耐旱相关基因(DREB1A, DREB1B, DREB2A和DREB2B)、ABA合成相关基因(NCED3和NCED4)及ABA通路相关基因(RaB16A, LIP9和LEA3)的表达。综合以上研究表明,OsWRKY67参与调控水稻响应多种非生物胁迫,通过ABA信号通路介导负向调控水稻苗期耐旱性。本研究揭示了OsWRKY67在水稻耐旱性中的调控作用,为利用该基因进...     

玉米油菜素甾醇生物合成关键酶基因ZmCYP90B1的克隆及其对逆境胁迫的响应

油菜素甾醇作为一类重要植物激素, 在植物生长发育和抵御逆境胁迫等过程中发挥重要作用。CYP90B1基因编码酶是其合成途径中关键限速酶。本研究针对迄今有关玉米CYP90B1基因应答逆境胁迫特征尚未见报道现状, 采用RT-PCR结合RACE技术, 从玉米中克隆了油菜素甾醇生物合成关键基因ZmCYP90B1 (GenBank登录号KY242373)。ZmCYP90B1全长2058 bp, 开放阅读框为1518 bp, 编码506个氨基酸。ZmCYP90B1蛋白预测分子量为57.66 kD, 等电点为9.54, 含有1个跨膜结构域及1个p450保守结构域。序列比对表明, ZmCYP90B1与其他物种CYP90B1蛋白高度相似, 但在单双子叶植物中进化上具有明显差异。实时荧光定量PCR结果表明, 非生物胁迫(干旱、高盐、低温和脱落酸)、虫害(甜菜夜蛾取食)和茉莉酸甲酯均诱导ZmCYP90B1表达, 表明该基因响应多种非生物胁迫, 参与植物对虫害和茉莉酸甲酯的响应。进一步构建过量表达ZmCYP90B1基因的烟草株系并检测表明该烟草株系抗旱性增强, 叶片失水率下降, SPAD值增大。此外, 干旱胁迫下转基因烟草超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性以及游离脯氨酸(Pro)的积累量均显著高于野生型, 丙二醛(MDA)和脱落酸(ABA)含量明显低于野生型。通过检测下游胁迫响应基因表达, 表明ZmCYP90B1提高植物抗旱性可能不依赖ABA途径, 而与其对抗氧化相关途径相关基因的转录调控有关。     

超量表达CsADH17基因提高烟草抗旱性及香气成分分析

乙醇脱氢酶是植物香气物质合成的脂肪酸代谢等途径中的关键酶之一,对茶叶芳香物质的形成有着重要作用,因此探究CsADH17基因有利于茶树的生长发育与品质提升。以本课题组前期筛选的CsADH17基因为研究对象,克隆CsADH17基因并构建植物表达载体,遗传转化烟草,对转基因烟草非生物胁迫下CsADH17的表达量和相关生理指标进行测定与分析。结果表明,对转基因与野生型烟草进行模拟干旱胁迫后,转基因烟草植株在干旱胁迫处理下的CsADH17基因相对表达量比野生型植株高。野生型烟草植株和CsADH17转基因烟草植株在干旱胁迫处理21 d后,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性均高于野生型烟草;胁迫处理后,野生型烟草叶片中丙二醛(MDA)含量显著高于转基因烟草。香气成分分析,转基因烟草苯甲醛比野生型含量提高了44.4%,而烟碱含量比野生型提高不到5%。CsADH17基因在烟草干旱胁迫下具有抗旱作用,同时影响烟草的香气成分,为进一步揭示CsADH在茶树生长发育以及抗逆响应中提供参考。     

干旱诱导AtGSTF14基因DNA去甲基化

DNA甲基化在调控植物基因表达方面起重要作用。干旱、低温和盐胁迫严重地影响了植物的生长发育。然而,DNA甲基化是否在干旱诱导的AtGSTF14基因表达过程中起作用还不清楚。本研究揭示了干旱诱导AtGSTF14基因启动子重复序列的DNA去甲基化,并激活了AtGSTF14基因的表达。本研究采用实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测目的基因的表达,结果表明干旱处理的拟南芥植物中AtGSTF14基因表达水平显著增加,野生型拟南芥(Col-0)被作为对照。亚硫酸盐测序分析表明与野生型拟南芥中AtGSTF14基因DNA甲基化水平相比,干旱处理的拟南芥植物中AtGSTF14启动子区重复序列的DNA甲基化水平显著降低。本研究为进一步探索非生物胁迫诱导植物基因表达的分子机制奠定了基础。     

玉米胁迫诱导表达基因ZmSNAC1的功能分析

NAC转录因子是具有多种生物功能的植物特异转录调控因子,在植物生长发育、器官建成、激素调节和抵抗逆境等方面发挥着重要的作用。我们之前分离得到1个受干旱、盐、冷等非生物逆境胁迫和植物激素ABA诱导显著上调表达的玉米NAC家族成员ZmSNAC1,过表达转基因株系在苗期的耐脱水能力较野生型株系明显提高。在此基础上,本研究进一步对ZmSNAC1过表达转基因株系在植株生殖生长发育时期的抗旱性和耐盐性进行功能鉴定。结果表明,在干旱胁迫条件下,野生型株系相比转基因株系较存活率提高50%~52%,相对电导率降低17%~21%,叶绿素含量提高36%~47%,脯氨酸含量提高了17%~23%;在300mmol L^-1 NaCl胁迫条件下,转基因株系的存活率提高36~40%。ZmSNAC1可能作为一个正向调控因子在逆境胁迫信号转导过程中发挥重要作用。     

转GhMAPK基因烟草植株的获得及其耐盐性分析

促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是普遍存在于真核生物中的一类保守的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,在植物生长发育和多种生物、非生物胁迫信号转导过程中起着关键作用.GhMAPK是首个在棉花(Gossypium hirsutum)中克隆的MAPK基因,为了进一步研究其功能,本研究利用农杆菌介导法将GhMAPK转入本氏烟草,Northern杂交和Western杂交分析证实,在转基因植株中GhMAPK能够高效表达.烟草耐盐性分析显示,在高盐胁迫下,转基因植株种子萌发率高于野生型烟草,苗期转基因株系能正常生长;进一步试验证明,转基因植株中的抗氧化酶(POD、SOD)活性也有明显提高.这些结果表明,GhMAPK过表达的转基因植株可以通过有效清除活性氧来提高植物对盐胁迫的抗性,GhMAPK可能参与了植物高盐胁迫信号传递过程.     

烟草(Nicotiana tabacum)非生物胁迫抗性分子机制研究进展

非生物胁迫影响烟草的生长发育,是制约作物产量和品质的重要因素。本综述阐述了非生物胁迫对烟草的影响以及最新的信号调控机制,包括干旱、盐、低温胁迫。在此基础上,综合分析了某些信号基因可能介导两因素甚至多因素调控过程,以及一些转录因子参与植物对冻害、干旱、盐害等非生物胁迫的应答调控,证明其对植物非生物胁迫的调控往往是多效性的。从分子水平上解析烟草在各种胁迫条件下的适应机制,对烟草种质资源保存、抗逆育种以及提高产量具有重要意义,为进一步研究植物的非生物胁迫应答提供理论依据。     

拟南芥swn突变体耐盐性的初步分析

SWN (Swinger)蛋白是多梳抑制复合体2 (polycomb repressive complex2, PRC2)结构的核心成分之一,为了研究SWN在拟南芥中耐盐胁迫方面的作用,我们分析了拟南芥突变体swn与野生型之间转录组水平的基因表达差异,高盐胁迫下的萌发实验,以及与盐胁迫响应基因RD20 (Responsive to desiccation 20)、SOS1 (Salt overly sensitive)和MAPK6 (Mitogen-activated protein kinase)的表达。结果显示,GO富集分析表达上调的基因,共富集到20个GO通路,其中响应盐胁迫通路(Respond to salt stress)富集程度较高;在高盐胁迫下,swn表现出比野生型更高的萌发率,幼苗生长情况也优于野生型;盐胁迫响应基因RD20、SOS1和MAPK6表达量也更高。本研究表明,swn突变体对盐的耐受性强于野生型,SWN基因在拟南芥抗盐过程中发挥负调控作用。     

水稻OPR基因的克隆及其在烟草中抗镉性分析

12-氧-植物二烯酸还原酶是茉莉酸生物合成途径的一个关键性酶,广泛参与植物生长过程中生物与非生物胁迫。本研究主要探讨OPR基因在植物非生物胁迫中的作用。从水稻中克隆了OPR基因,该基因的cDNA编码区全长1 203 bp,编码400个氨基酸,将其连接到植物表达载体pSH 737上,通过农杆菌介导的方法,将含有目的基因的载体遗传转化烟草,获得31株转基因植株。选取生长状况基本一致的8株不同转基因株系和4株野生型烟草,在非生物胁迫下,用300μmol·L~(-1) CdCl_2溶液浇灌处理,观察植株生长并对抗镉能力进行初步分析;选取T 1代3个转基因株系(TP 7、TP 8和TP 12)和野生型烟草的种子,放入含有3个不同浓度CdCl_2溶液的滤纸上萌发进行镉胁迫并统计发芽率。在300μmol·L~(-1) CdCl_2溶液胁迫15 d后,种子发芽率比野生型高40%以上,转基因烟草的抗氧化酶活性显著高于野生型,丙二醛的含量显著低于野生型植株。利用RT-PCR方法分析相关基因表达情况,结果表明,在Cd~(2+)胁迫下,OPR,Snakin-2和GRP-2基因表达均上调,因此推测OPR基因的高表达是其具有高抗性的主要原因。OPR基因的过量表达使烟草提高了对重金属Cd~(2+)的抗逆性能力。     

烟草NtCYP734A1基因的克隆及表达分析

油菜素内酯是一种参与胁迫响应的甾醇类植物激素,CYP734A1基因是油菜素内酯代谢通路上的关键基因。为探索CYP734A1基因在烟草响应非生物胁迫时发挥的功能,本研究以普通烟草品种K326为材料,克隆CYP734A1基因,通过生物信息学技术分析NtCYP734A1蛋白的理化性质及进化关系,运用实时荧光定量法分析CYP734A1基因在不同组织、不同非生物胁迫处理下的基因表达模式。结果表明,CYP734A1基因全长1 638 bp,编码545个氨基酸;亚细胞定位预测NtCYP734A1蛋白存在于内质网。qRT-PCR分析表明,烟草CYP734A1基因在不同组织均有表达,叶中表达量最高,茎中的表达量最低。非生物胁迫处理下,CYP734A1基因在各组织的表达量显著改变,在干旱、盐和低温胁迫下根的CYP734A1基因表达上调;在干旱、盐、高温和低温共4种胁迫下,叶中CYP734A1基因表达下调。     

非生物胁迫激活ABA途径ACO3基因的表达

DNA甲基化在植物生长发育和应答非生物胁迫过程中起重要作用。本研究揭示了ABA途径相关基因ACO3应答非生物胁迫的分子机制。定量PCR (quantitative PCR, qPCR)的检测结果表明用野生型拟南芥(Col-0)作对照,被干旱、低温和盐处理的拟南芥植物中ACO3基因表达水平显著增加。重亚硫酸盐测序的数据分析表明非生物胁迫能够诱导ACO3启动子DNA去甲基化并激活该基因的表达。RNA介导的DNA甲基化(RNA directed DNA methylation, RdDM)途径突变体ago4和dcl3中ACO3基因表达水平明显增加,暗示RdDM途径在调控ACO3基因应答非生物胁迫过程中起重要作用。     

大豆转录因子GmWRKY58亚细胞定位及在非生物胁迫下的表达分析

WRKY转录因子在植物响应非生物胁迫,调控抗逆基因的表达方面具有重要作用。为了解析大豆转录因子GmWRKY58基因在非生物胁迫中的功能,从大豆中克隆了GmWRKY58 c DNA全长,推导其编码的氨基酸序列、生理生化特征与进化关系,并研究了其亚细胞定位和在不同组织及非生物胁迫下基因的表达变化。结果表明,GmWRKY58基因c DNA ORF全长为954 bp,编码317个氨基酸。亚细胞定位结果显示,GmWRKY58蛋白质定位于细胞核中。实时荧光定量PCR基因表达分析表明,GmWRKY58在大豆根、茎、叶、花和荚等组织均有表达,根、茎、叶中的表达量明显高于花和荚。在大豆根中,GmWRKY58基因受高盐、干旱、低N和缺Fe等非生物胁迫因子强烈诱导,在高盐胁迫下,基因表达量增加187.4倍;GmWRKY58基因受水杨酸(SA)、低温及低P和低K等诱导轻微,差异表达不显著。由此推测,GmWRKY58转录因子在大豆抗盐、抗旱、低N和缺Fe等非生物胁迫过程中起到重要的调控作用。     

茶树CsbZIP4转录因子正调控拟南芥对盐胁迫响应

bZIP转录因子是真核生物中一类多功能蛋白家族,参与种子成熟、光信号调节、胁迫响应等多种生物学过程,拟南芥中根据序列相似性和保守域主要分为10个亚家族(A-I和S)。本文以茶树的C亚家族转录因子CsbZIP4为研究对象,调查非生物胁迫下的表达模式,及转化拟南芥后CsbZIP4过表达对耐盐性的影响。结果显示,在4℃低温、外源ABA、盐和干旱胁迫处理后,CsbZIP4的表达在茶树叶片中呈上调模式,特别是在盐和干旱胁迫下其表达分别上调2.9倍和2.2倍;而在根中,低温、盐和干旱胁迫均能显著抑制CsbZIP4的表达,其中盐胁迫能将其表达抑制2倍;荧光显微镜下观察CsbZIP4-GFP融合蛋白,将CsbZIP4定位于细胞核中;CsbZIP4的过表达能够降低转基因株系种子萌发时对外源ABA、盐胁迫的敏感性,在300mmolL~(-1)NaCl盐胁迫下,转化拟南芥植株过表达CsbZIP4增强抗性,其叶片的SPAD值较高,同时过表达株系中盐胁迫响应基因AtSOS1的表达显著增强。根据CsbZIP4正调控拟南芥的盐胁迫响应,推断CsbZIP4与茶树抵御盐胁迫密切相关。     

拟南芥AT2G14260基因功能及其表达特异性分析

拟南芥AT2G14260基因编码脯氨酸亚氨基肽酶，基因芯片表达谱数据显示该基因响应高盐、低温等非生物胁迫。为研究其功能和表达特性，本研究采用野生型和突变体植株pip-1进行低温、干旱和盐胁迫处理，结果显示在正常培养基中野生型与pip-1植株表型没有区别。而在逆境处理下pip-1植株的根比野生型明显短，且在干旱胁迫下，突变体的叶子比野生型植株明显变黄萎蔫。在正常环境、冷、干旱、盐胁迫下，野生型植株脯氨酸含量的平均值分别是突变体的1.11、1.23、1.10和1.34倍，这说明AT2G14260基因对提高非生物胁迫的耐性具有一定的作用。同时分离了该基因的启动子，构建了表达GUS基因的载体并转化拟南芥，结果表明该启动子在正常环境中不表达。胁迫处理时从两叶期开始在根、叶、茎中表达，到达花期后，干旱处理下的花瓣、花枝和冷处理下的花柱头中也有表达。GUS相对活性试验也证明对胁迫的响应能力。可见AT2G14260基因启动子是逆境胁迫诱导表达启动子，同时具有组织表达特异性，因此，AT2G14260基因及其启动子在转基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

非生物胁迫条件下10个玉米ZmDOF基因表达模式分析

为了研究玉米转录因子Dof(DNA-binding with one zinc finger)锌指蛋白在玉米生长发育及非生物逆境胁迫响应途径中的作用与生物学功能。利用qRT-PCR技术系统研究了10个ZmDOF基因在玉米不同组织中以及应答不同非生物逆境胁迫下响应表达模式。进化树以及基因结构分析结果表明,这10个ZmDOF基因分布在3个不同的亚家族。qRT-PCR分析结果显示,这10个基因具有组织表达特异性。7个基因主要在雄花中表达,2个基因主要在授粉15 d后的小穗中表达,1个基因主要在根中表达,表明这10个基因可能参与这些组织的生长发育进程。在盐或干旱胁迫处理下,大部分基因的表达模式都发生了明显的改变,预示着这些基因参与玉米幼苗应答盐或干旱胁迫响应信号途径。在铵态氮缺乏胁迫下,ZmDOF3的表达上调了5倍以上。在硝态氮缺乏胁迫下,ZmDOF23和ZmDOF46的表达量下降了90%以上,表明这些基因可能参与调控玉米幼苗氮代谢平衡或者信号转导途径。     

烟草磷酸酶基因NtPP2C16的克隆、表达载体构建及表达分析

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C-type protein phosphatases,PP2C)是ABA信号转导途径中的关键组分,在植物生长发育、细胞周期调节及应对逆境胁迫的过程中发挥重要的作用。为探究PP2C基因在烟草适应非生物胁迫中的功能,从烟草栽培品种K326中克隆到了一个PP2C同源基因,该基因开放阅读框为1 617 bp,编码538个氨基酸残基。同源性分析结果显示,该基因所编码的蛋白与绒毛状烟草PP2C16的亲缘关系最近,故命名为NtPP2C16。生物信息学分析表明,NtPP2C16催化区域上具有PP2C家族进化中相对保守的11个结构亚区。qRT-PCR研究分析结果表明:该基因的表达显著受ABA和H_2O_2 2种信号分子诱导,并且响应干旱、高盐、低温和低钾胁迫。成功构建NtPP2C16-pBI121过表达载体,为解析NtPP2C16参与烟草非生物逆境胁迫响应提供一定的理论依据。     

异源表达棉花GhPRP5基因增强了拟南芥对盐和ABA的敏感性

富含脯氨酸的蛋白(proline-rich proteins, PRPs)代表一类富含脯氨酸和羟脯氨酸的细胞壁结构蛋白质,最先在伤害诱导的胡萝卜贮藏根中被发现。越来越多的证据显示这类蛋白在应答多种生物和非生物胁迫中起作用。我们之前从棉花cDNA文库中分离了一个命名为GhPRP5的编码富含脯氨酸蛋白的基因,为研究其功能,构建了GhPRP5的过量表达载体,转化拟南芥,获得GhPRP5高表达的8个株系的纯合体。在正常培养条件下,转基因株系和野生型种子的萌发率一致,但盐胁迫和ABA处理显著抑制了转基因拟南芥株系种子的萌发。盐胁迫条件下野生型的绿苗率明显高于转基因拟南芥株系,与正常生长条件相比,ABA处理抑制转基因拟南芥主根伸长的程度更大。利用Quantitative RT-PCR技术分析几个胁迫相关标记基因的表达情况表明,盐和ABA诱导了RD29A、RD29B和KIN1的表达,但诱导水平在转基因株系和野生型中不一样,说明GhPRP5参与调控拟南芥胁迫相关标记基因的表达,但具体参与的胁迫应答信号传导途径仍需进一步研究。