光皮桦BBX类基因BlCOL13的克隆与表达分析

利用RACE、RT-PCR以及基因组步移技术克隆得到光皮桦BlCOL13全长cDNA（GenBank登录号：KP663425）、全长DNA及其启动子序列。该基因DNA全长2 808 bp,具有4个外显子,3个内含子;cDNA全长1 370 bp,包含1 140 bp的开放阅读框,编码含379个氨基酸的蛋白。BlCOL13蛋白N、C端分别有两个B-box和一个CCT结构域,属于典型的BBX蛋白。以拟南芥中BBX蛋白的分类为参照,通过聚类分析表明BlCOL13属于Ⅱ型BBX蛋白;克隆得到的BlCOL13启动子序列长685 bp,含有多个与成花、光响应、激素信号转导以及逆境胁迫相关的顺式作用元件。亚细胞定位试验结果表明该基因主要在细胞核中表达。不同组织中该基因都有一定程度的表达,但在雄花中表达量最高。低温、干旱、ABA和盐胁迫等非生物逆境都在一定程度上诱导BlCOL13的表达,盐胁迫的影响最为明显,表明该基因在光皮桦逆境响应中可能发挥比较重要的作用。     

猕猴桃OSCA基因家族鉴定及其在非生物胁迫下的表达分析

【目的】揭示OSCA家族基因在猕猴桃响应非生物胁迫中的表达特征,为猕猴桃OSCA基因功能分析与猕猴桃抗逆性遗传改良提供参考。【方法】利用生物信息学方法对全基因组范围内猕猴桃OSCA基因家族成员进行鉴定和综合分析,通过q RT-PCR法分析它们在不同非生物胁迫下的表达特征。【结果】在中华猕猴桃基因组中共鉴定出16个OSCA基因,它们不均等地分布于13条染色体上,其启动子区域存在大量响应逆境胁迫的顺式作用元件。OSCA3在干旱、盐、高温和低温胁迫下表达量均较显著上调,OSCA8在干旱、盐和低温胁迫下表达量显著上调,OSCA1和OSCA14在低温胁迫处理下表达量显著上调,OSCA7和OSCA15均显著响应干旱胁迫。【结论】鉴定出6个受非生物胁迫显著诱导表达的猕猴桃OSCA基因,为进一步研究OSCA基因在响应猕猴桃非生物胁迫中的分子功能提供了重要依据。     

百子莲脱水素基因ApSK_3对逆境与激素信号的应答模式与调控机制

克隆了百子莲(Agapanthus praecox)脱水素基因ApSK_3上游2 195 bp的启动子序列,对百子莲不同组织和多种非生物胁迫与ABA处理的样品进行基因定量分析,构建多个ApSK_3不同长度缺失的启动子片段与GUS基因融合的表达载体并转化拟南芥,以揭示ApSK_3基因对不同逆境与激素信号的应答模式及顺式作用元件的调控功能。结果表明:ApSK_3启动子序列包含多个与植物逆境、激素应答及生长发育相关的顺式作用元件,且ApSK_3的表达具有组织特异性,果实中表达量最高,叶、根次之,花中最低;ApSK_3对ABA信号与盐胁迫最敏感,其次为干旱、高渗和低温胁迫,对高温胁迫响应不明显。ApSK_3-P::GUS融合表达载体转化拟南芥,ApSK_3启动子在拟南芥的整个生长发育过程中均具有较强的表达活性,幼苗根部的表达活性强于叶片,且随着果实的发育成熟启动子的活性明显增强。ApSK_3不同长度缺失的启动子片段分析结果表明–2 175～–950 bp片段对启动子的活性起到重要的调控作用;多个顺式作用元件响应干旱胁迫;ApSK_3-P通过两个ABRE元件共同响应ABA信号;–526～–533 bp的ERE元件参与响应乙烯信号;–561～–567 bp的P-box元件响应了赤霉素信号,–2 175～–1 167 bp区域可以增强对GA的响应。研究结果证明ApSK_3启动子可积极响应干旱、渗透、盐、低温、ABA、GA和乙烯信号;启动子上存在多个顺式作用元件响应干旱胁迫,ApSK_3-P通过两个ABRE、ERE与P-box元件分别响应ABA、乙烯与赤霉素信号。     

野生毛葡萄芪合成酶基因双向启动子活性分析

【目的】研究中国野生毛葡萄‘丹凤-2’(Vitis quinquangularis‘Danfeng-2’)芪合成酶(stilbene synthase)基因双向启动子的启动活性与差异。【方法】通过染色体步移技术克隆中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因双向启动子,并与Uid A基因(β-葡萄糖苷酶基因,GUS)融合,利用真空渗透法在葡萄叶片中瞬时表达,组织化学染色和GUS蛋白定量法分别检测白粉菌接种、温度处理、茉莉酸甲酯、脱落酸和水杨酸处理对双向启动子活性的影响。以毛葡萄‘丹凤-2’和欧洲葡萄‘赤霞珠’不同成熟时期果实的c DNA为模板,通过荧光实时定量PCR的方法分析Vq STS12/Vv STS31和Vq STS33/Vv STS32的表达情况。【结果】Pvq DSTS12受到白粉菌、茉莉酸甲酯、高温和低温的诱导后,启动活性增强,对水杨酸和脱落酸处理不敏感;Pvq DSTS33在茉莉酸甲酯处理下启动活性增强,在高温和低温的处理下启动活性降低,对水杨酸、脱落酸和白粉病处理不敏感。荧光实时定量PCR结果显示,在果实发育的6个时期中,‘丹凤-2’Vq STS12和Vq STS33的表达量均高于‘赤霞珠’Vv STS31和Vv STS32。4个基因的基本表达趋势为:浆果转色期之前持续增长,转色后期下降,浆果半熟期达到最高峰,浆果成熟期表达降低。其中毛葡萄‘丹凤-2’Vq STS12的表达量在转色后期并未降低且增加到上一时期的2.3倍;欧洲葡萄Vv STS32基因在成熟期表达量升高为前一时期的1.42倍。【结论】双向启动子活性的研究为利用植物天然双向启动子提供依据。     

香蕉MYB基因克隆和表达分析

【目的】获得香蕉抗逆相关转录因子。【方法】通过随机克隆测序的方法从香蕉根系c DNA文库中获得MYB基因,命名为Ma MYB1。【结果】对扩增获得的c DNA序列进行生物信息学分析,表明Ma MYB1是香蕉MYB基因编码框全长c DNA,包含一个951 bp的最大开放阅读框,编码一个长316个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的2个保守的MYB结构域R2和R3,属于典型的R2R3-MYB基因。系统进化树比对分析表明,Ma MYB1与海枣(XP_008808341.1)和油棕(XP_010914123.1)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明该基因在叶、根和花中的表达量较高。实时荧光定量PCR分析表明Ma MYB1响应干旱、低温、盐和枯萎病菌的侵染等胁迫处理。【结论】Ma MYB1基因在香蕉响应逆境中扮演重要的调控角色。     

扁桃AcCBF1转录因子的克隆及表达分析

【目的】分离和克隆新疆栽培扁桃CBF1转录因子基因,了解其在扁桃响应环境胁迫和逆境相关激素诱导的表达情况。【方法】以新疆扁桃幼苗为试验材料,对其进行低温、干旱、盐及ABA处理,使用PCR技术从新疆扁桃‘双果’克隆得到CBF1转录因子基因,通过农杆菌将35S-Ac CBF1-GFP融合质粒转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察结果,并通过实时荧光定量PCR技术分析了SG-Ac CBF1转录因子基因在不同非生物逆境胁迫下的表达情况。【结果】序列分析表明,该基因编码框为729 bp,编码242个氨基酸,蛋白质分子量为27.405 ku,命名为SG-Ac CBF1,GenBank登录号为KM245571。氨基酸序列同源比对分析证实,SG-Ac CBF1属于CBF转录因子家族基因。系统发育树分析表明,SG-Ac CBF1与甜樱桃Pa DREB1的亲缘关系最近。亚细胞定位分析显示,SG-Ac CBF1蛋白定位于细胞核中。实时荧光定量PCR分析结果表明,低温、干旱、盐及ABA均能诱导SG-Ac CBF1基因表达。【结论】SG-Ac CBF1转录因子具有核定位功能,并参与了植物对逆境胁迫的调控。由于该转录因子属于家族基因,因此其对环境胁迫响应的强弱还有待探讨。     

葡萄PYL基因家族的鉴定与表达分析

【目的】通过分析葡萄(Vitis vinifera L.)PYL基因在非生物胁迫条件下的响应情况,丰富PYR/PYL/RCAR(Pyrabactin Resistance/Pyr1-Like/Regulatory Components of ABA Receptor)在ABA信号和启动信号转导中的功能。【方法】利用生物信息学方法,筛选葡萄中的PYL基因,并对其进行生物信息学及非生物胁迫下的响应分析。【结果】从葡萄基因组中共鉴定出6个PYL基因,Vv PYL家族无染色体偏好性,Vv PYL5无内含子结构;除Vv PYL4外均富含酸性氨基酸,该家族成员主要定位于细胞质中,并有多个保守位点。10%(ω)PEG和100μmol·L~(-1)ABA处理6 h后,Vv PYL1和Vv PYL2表达水平与对照相比差异显著,分别为对照的1.3~1.8倍。50μmol·L~(-1)ABA处理6 h后,Vv PYL1表达水平与对照差异显著,为对照的1.5倍;400 mmol·L~(-1)Na Cl、10%PEG、50μmol·L~(-1)ABA和100μmol·L~(-1)ABA处理24 h后,Vv PYL1和Vv PYL2的表达水平显著高于对照,为对照的1.2~2.2倍,400 mmol·L~(-1)Na Cl处理24 h后,Vv PYL6的表达水平显著高于对照,为对照的1.6倍。【结论】克隆得到葡萄的6个PYL基因,高度保守,分为3个亚组;能够响应不同非生物胁迫。本研究为葡萄PYL基因在逆境应答中的功能研究提供了基础。     

火龙果DREB1D基因的克隆及在转基因拟南芥中的功能分析

【目的】DREB(dehydration responsive element binding)是一类脱水响应元件结合蛋白，在植物响应高温、干旱、高盐和低温等多种非生物胁迫过程中发挥关键作用。以紫红龙火龙果（Hylocereus monacanthus）为材料，克隆得到DREB转录因子，并命名为HmDREB1D(HU02G01866.1)，探究其生物学功能。【方法】构建HmDREB1D基因植物过表达载体，通过亚细胞定位分析HmDREB1D基因在细胞中的位置。异源转化拟南芥，对T3代纯合系转基因拟南芥（OE3、OE4、OE5）进行生物学功能验证。【结果】火龙果HmDREB1D基因的开放阅读框全长723 bp，产生的蛋白定位于细胞核内，属DREB1s亚家族，具有典型的AP2结构域。将HmDREB1D基因转化至拟南芥获得超表达转基因株系，与野生型相比，转基因株系表现出较高的抗逆性。在干旱胁迫下，转基因植株T3代纯合系种子的萌发率高于野生型。转基因植株的叶片在逆境胁迫下表现出更低的电导率及更高的保护性酶活性。实时荧光定量PCR分析显示，RD20、HSP70和COR15A等逆境胁迫响应基因在Hm...     

茶树CsMAPK3的全长克隆及其逆境表达分析

以‘福鼎大白’茶树为材料,克隆了CsMAPK3的全长cDNA序列(GenBank登录号:MF034662)、基因组序列及其启动子序列。CsMAPK3的cDNA序列全长1700 bp,含有1119 bp的ORF序列,编码373个氨基酸;CsMAPK3蛋白预测为亲水性蛋白,含有多个磷酸化位点;多序列比对和进化树分析表明CsMAPK3 C–末端含有保守的CD结构域,属于TEY类型的A亚家族MAPK;亚细胞定位预测CsMAPK3主要定位于细胞质和细胞核中。CsMAPK3基因组全长4930 bp,包含5个内含子和6个外显子,第1个内含子和第2个内含子较大,分别为1608和1318 bp,外显子长度在130~350 bp之间。克隆获得起始密码子上游1125 bp的启动子区序列,该启动子上含有干旱、低温、高温以及ABA等相关的顺式作用元件。荧光定量表达分析显示,ABA、低温和盐胁迫均能显著上调茶树叶片中CsMAPK3的表达。蛋白互作预测表明CsMAPK3可能与MYBR1互作来响应ABA依赖途径的非生物胁迫过程。综上表明,CsMAPK3可能与茶树抗逆响应密切相关。     

巴西蕉2个ERF转录因子基因的克隆及功能研究

【目的】筛选、克隆响应非生物胁迫的关键ERF转录因子基因,并研究其功能。【方法】综合运用转录组学、生物信息学、生物化学等技术手段,分析不同非生物逆境胁迫下AP2/ERF转录因子超家族基因的表达谱聚类变化,并从中筛选、克隆关键ERF转录因子,对其功能进行研究。【结果】不同非生物胁迫下,AP2/ERF超家族基因的表达模式不同,对低温胁迫的响应较其他胁迫敏感;筛选克隆的Ma ERF25和Ma ERF27基因是ERF家族基因,具备ERF家族基本特征,编码蛋白为核定位蛋白,C端具有转录激活活力,并参与了香蕉对非生物胁迫和激素的应答,在其中发挥着一定的作用。【结论】获得了2个巴西蕉ERF基因Ma ERF25和Ma ERF27,被定位在细胞核,具有转录激活活性,参与非生物逆境胁迫应答。