珍珠黄杨ITS-PCR体系的建立与优化

本研究利用改良CTAB法从珍珠黄杨叶片中提取基因组DNA作为模板,在TaqDNA聚合酶量不变的基础上,利用正交设计L9（34）对4个因素（模板DNA、Mg2＋、dNTP和引物）在3个水平上对珍珠黄杨ITS-PCR反应体系进行优化。实验结果表明,在总体积50μL的反应体系中,建立了最佳ITS-PCR扩增条件：Mg2＋浓度2.0mmol/L、引物浓度0.3μmol/L、dNTP浓度0.3mmol/L、DNA模板浓度240ng/50μL、TaqDNA聚合酶的用量1.75U/50μL和退火温度56℃,该优化体系保证了珍珠黄杨ITS-PCR产物的纯度和质量要求。珍珠黄杨ITS片段克隆测序后获得的序列长度为642bp,其系统学信息将为珍珠黄杨的起源进化提供有力的分子水平证据。     

籽粒苋蛋白质的提取研究

为了探索籽粒苋蛋白质的提取工艺，研究了不同的介质pH值、提取时间、提取温度和加水比例对籽粒苋蛋白质的可溶出率的影响，分析了3种pH值下提取的蛋白质氨基酸组成。结果表明：pH值极大地影响籽粒苋蛋白质的溶出率，pH 2.0～4.6时，随pH值上升，溶出率下降，pH 4.6～12.0时，随pH值上升，可溶出率增大；pH值4.6时为最低点，此时可能为籽粒苋蛋白质的等电点；水与籽粒苋之比为20时，蛋白质的可溶出率较其它比例为高；其它因素对籽粒苋蛋白质的溶出率影响不大。因此，籽粒苋蛋白质最佳提取工艺条件采用料液比为1∶20，在pH 8～10的碱性环境下，室温浸提1 h。     

小麦花药蛋白质组双向电泳技术体系的优化

以小麦单核期花药为材料,比较了两种不同蛋白质提取方法TCA/丙酮法和酚提取法及不同的蛋白质裂解液组成对双向电泳的影响,并在蛋白质上样量和SDS-PAGE胶浓度等方面也进行了探索与优化。结果表明,采用TCA/丙酮提取法比用酚提取法提取的蛋白质所得的2-DE胶图谱上蛋白质点数增加,图谱背景也比较清晰;样品溶解于含有硫脲和TBP的蛋白质裂解液Ⅱ中,可显著提高蛋白质的溶解性,在2-DE图谱上可分辨出554个蛋白质点,比用蛋白质裂解液Ⅰ提取的蛋白多39个点。以TCA-丙酮法提取小麦花药组织中的蛋白,用蛋白质裂解液Ⅱ[7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS、2%TBP、65mmol/L DTT、0.2%载体两性电解质(其中0.1%pH 3~10,0.1%pH4~6)]溶解蛋白,以pH4~7线性17cm的IPG胶条进行双向凝胶电泳,在上样量为800μg,13%SDS-PAGE胶浓度下,蛋白质得到了更好的分离,2-DE图谱上可分辨出631个蛋白点,图谱质量最佳。优化后的双向电泳技术体系,适合于小麦花药全蛋白质的双向电泳分析。     

土壤宏蛋白质组学之土壤蛋白质提取技术的发展

随着土壤宏基因组学的日益成熟和发展,作为后基因组时代重要技术平台的土壤宏蛋白质组学越来越受到关注。土壤宏蛋白质组学的研究是解析土壤宏基因功能的重要手段之一,对于碳氮磷的生物地球化学循环以及土壤有机质积累的研究具有重大价值,可将蛋白信息与相关的生态系统过程联系起来。但是,土壤蛋白含量少,样品复杂程度高,极大限制了土壤蛋白的分离提取和进一步分析。因此,通过改进和优化土壤蛋白的提取技术,得到高浓度的蛋白是土壤宏蛋白质组学研究的前提条件。本文总结了近几年来土壤蛋白提取方法,并对其适用的土壤性质以及适用的不同种类和功能的蛋白进行了分析。此外,本文也对现有的土壤蛋白提取技术以及土壤蛋白鉴定技术的方法改进进行了探讨。     

大麦条纹病侵染对大麦叶片蛋白组的影响

大麦条纹病由麦类核腔菌(Pyrenophora graminea)引起,是一种世界性病害.为进一步探索条纹病与大麦(Hordeum vulgare)的相互作用,以大麦品种甘啤6号和Issto为实验材料,在接种麦类核腔菌(代号DWC)7和21d后提取叶片蛋白,运用2-DE和质谱分析技术研究条纹病菌侵染后叶片蛋白质组学的变化.结果显示,与对照相比,甘啤6号和Isotta差异表达量在1.4倍以上的蛋白点28个,其中在甘啤6号中表达上调的蛋白点4个,下调的6个,诱导表达的2个,抑制表达的2个;在Isotta中,表达上调的蛋白点3个,下调的4个,诱导表达的4个,抑制表达的3个.质谱鉴定分析发现,表达上调的蛋白包括二磷酸核酮糖羧化酶A(2号蛋白点)、肌动蛋白(9号蛋白点)、核糖体再循环因子(ribosome-recycling factor,RRF)(10号蛋白点)、ATP合酶γ链(11和27号蛋白点)、琥珀酸脱氢酶(辅酶q)黄素蛋白亚基(15号蛋白点)和假定蛋白(26号蛋白点):表达下调的包括过氧化物还原蛋白(4号蛋白点)、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit,RuBisCo)(3、5、12、14、16和18号蛋白点)、ATP合酶CF1α亚基(13号蛋白点)、Ycf3蛋白(17号蛋白点)和α-1,4葡聚糖蛋白合酶(alpha-1,4-glucanprotein synthase,UTPG)(28号蛋白点);诱导表达蛋白包括假定蛋白(6号蛋白点)、脂氧合酶2(lipoxygenase 2,LOX2)(7号蛋白点)、捕光叶绿素a/b结合蛋白质(light harvesting chlorophyll a/b-binding protein,LHCP)(19号蛋白点)、3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglycerate kinase,PGK)(20号蛋白点)、凝集素(21号蛋白点)和ATP合酶γ链(22号蛋白点);抑制表达的蛋白包括RuBisCo(1、8、24和25号蛋白点)和二磷酸核酮糖羧化酶小链(ribulose bisphosphate carboxylase small chain,RuBPCase)(23号蛋白点)等.按照其功能分类,这些差异表达蛋白点分别参与了光合作用、蛋白质生物合成、植物防卫反应、能量代谢和细胞信号转导、细胞结构和纤维素生物合成等生理功能.这些差异表达蛋白可能与大麦响应条纹菌侵染过程有关,研究结果有助于从蛋白质水平揭示不同抗性大麦品种抗条纹病的抗性机制.     

不同生态区同一基因型烤烟叶绿体差异蛋白质组分析

为了揭示同一烤烟品种在不同生态烟区香型风格的形成机制,以烤烟(Nicotiana tabacum)品种K326为材料,分别提取典型清香型烟区玉溪和典型浓香型烟区桂阳烟叶的叶绿体,TCA-丙酮法提取烟叶叶绿体蛋白质,利用双向电泳技术联合质谱技术对清香型和浓香型烟叶叶绿体的差异蛋白质组进行分析。结果表明,在分子量为14.3~97.2 kD之间,桂阳可检测到的蛋白质点数为1 270个,其中上升表达的蛋白质点为41个,特异表达的蛋白质点为10个;玉溪可检测到的蛋白质点数为892个,其中上升表达的蛋白质点为48个,特异表达的蛋白质点为4个,两者共同表达的蛋白质点为716个。对其中特异表达的14个蛋白质点进行MALDI-TOF-TOF质谱分析和生物信息学的综合比对,桂阳得到6个同源匹配蛋白质,特异表达的蛋白为ATP合酶的β亚基、核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶/加氧酶和NADPH脱氢酶;玉溪得到1个同源匹配蛋白质,特异表达的蛋白为1,6-二磷酸果糖醛缩酶。其中与光合作用密切相关的蛋白质在湖南桂阳特异性表达;与糖代谢密切相关的蛋白质在云南玉溪特异性表达。本研究首次从叶绿体蛋白质组水平对烟叶香型风格形成的机理进行了探讨,为烤烟的育种和生产提供一定的理论依据。     

不同提取方法及上样量对牡丹试管苗茎基部蛋白双向电泳的影响

为建立一套适合于牡丹试管苗茎基部蛋白的双向电泳技术,以便更好地利用蛋白质组技术研究牡丹试管苗不定根的发生机理,本研究比较了三种不同蛋白质提取方法对双向电泳结果的影响,并在蛋白质上样量方面进行了比较。结果表明,乙酸铵/甲醇酚提取法所得2-DE图谱的蛋白点很少,仅检测到45个,且较模糊,有明显的拖尾现象,分辨率很低;乙醇/乙醚丙酮法所得的蛋白点也较少（101个）,较模糊,且横竖纹干扰较大;三氯乙酸/丙酮法所得蛋白点数较多,可检测到434个清晰的蛋白点,且形状规则,重复性好,适合后续分析,操作也较为简便。用三氯乙酸/丙酮法提取蛋白,采用800μg、1000μg和1200μg三个不同的上样量进行双向电泳,在上样量为1200μg时（IPGpH3～10,24cm）,蛋白质在12%SDS-PAGE胶上得到了较好的分离,在2-DE图谱上可分辨出562个蛋白点。因此,三氯乙酸/丙酮法是较适合于牡丹试管苗茎基部蛋白质提取的方法,1200μg是较为合适的上样量。     

硼对甘蓝型油菜蛋白质的影响

利用比色法和聚丙烯凝胶电泳法分析了不同硼营养状况下甘蓝型油菜的幼苗叶片及开花期花药内可溶性蛋白质含量及组分的变化。结果表明,缺硼或硼过量部会造成幼苗叶片及花药内蛋白质含量显著下降;从电泳图谱中也可看出,可溶性蛋白质的组分也发生了变化。不适当供硼(缺硼或硼过量)幼苗叶片及花药内所测的大部分蛋白质含量减少,有个别的蛋白质增加或缺失。     

梅花鹿鹿茸再生干细胞蛋白质组双向电泳条件优化

鹿茸是目前唯一可以完全再生的哺乳动物附属器官,这种再生基于鹿茸再生干细胞。本研究以梅花鹿(Cervus nippon)鹿茸再生干细胞为样品,在处理方法、染色方法、蛋白纯化和等电聚焦条件4个方面对蛋白质组双向电泳进行优化。结果显示,利用Bullet Blender细胞组织破碎仪处理细胞优于超声波破碎;双染法染色能够得到更多且更清晰的蛋白点;等电聚焦总volt-hours在15 000 volt-hours时竖条纹相对较少;通过比较6种不同的蛋白提取方法与纯化方法组合,发现采用自制裂解液与双向电泳纯化试剂盒纯化相结合的方式获得的电泳图谱较好。通过综合优化后的双向电泳技术所得到的蛋白图谱中蛋白点相对较多且圆滑,条纹现象较轻,重复性较好,满足后续软件分析以及数据处理的要求,本研究为不同发育期梅花鹿鹿茸再生干细胞比较蛋白质组学研究提供了基础实验数据。     

内蒙古白绒山羊毛囊发育周期蛋白质表达谱分析

山羊绒毛的产量和绒毛纤维的质量与角蛋白有关。本研究旨在探讨内蒙古白绒山羊(Capra cashmere)毛囊差异表达蛋白质的变化规律,采用双向凝胶电泳(two dimensional gel electrophoresis,2-DE)技术分离一年中12个月份毛囊总蛋白质,建立了毛囊发育周期蛋白质图谱。使用质谱鉴定差异表达蛋白点,并分析部分蛋白点的表达趋势。结果表明,12个月样本的2-DE图谱显示,平均每块胶上可检测到255个蛋白点,分布在pI 4~7,分子量30~85 kD;软件分析得到20个差异表达蛋白点,质谱成功鉴定出12种蛋白质;这些蛋白质主要为角蛋白(keratin,K),参与细胞生物过程并发挥生物学功能。将12个月做以下划分:11、12、1和2月4个月归为毛囊退行期,3和4月归为毛囊休止期,此时蛋白质表达量明显降低;5、6、7、8、9和10月归为毛囊兴盛期,蛋白质表达量为一年中最高。初步得出K1、K5、K71和K25在毛囊发育的兴盛期表达量高,可能促进毛囊的生长发育。K83和K10在毛囊休止期表达量高,可能与毛囊的休止有关。研究建立了良好的皮肤毛囊蛋白质表达谱,分析并鉴定了差异蛋白质及其表达趋势,对于从蛋白质组学研究内蒙古白绒山羊毛囊生长和发育,寻找标记蛋白应用于绒山羊育种提供了新的研究线索。     

超声波微波协同提取沙棘叶黄酮及其组成和活性研究

沙棘叶中富含黄酮类化合物等多种活性成分,为提高其提取率和利用率,本研究采用常规溶剂萃取、超声辅助、微波辅助、超声波微波协同提取4种方法对沙棘叶黄酮进行提取,测定沙棘叶黄酮得率并观察沙棘叶的微观组织结构,比较筛选沙棘叶黄酮的最佳提取方法。并采用响应面法对最佳提取方法进行工艺优化,同时测定沙棘叶黄酮组成和体外抗氧化活性。结果表明,超声波微波协同提取法是提取沙棘叶黄酮的最佳方法,黄酮得率较常规溶剂萃取法提高了42.54%(P<0.05),沙棘叶细胞损伤最严重。超声波微波协同提取沙棘叶黄酮的最佳工艺为乙醇体积分数61%、提取时间18 min、微波功率446 W,此时黄酮得率为42.09 mg·g^-1。沙棘叶黄酮提取液中共鉴定出6种黄酮类成分,分别为儿茶素、丁香酸、山萘酚、槲皮素、异鼠李素、杨梅素,其中儿茶素含量最高,为1.474 8 mg·g^-1,其余5种的含量均在0.1~0.3 mg·g^-1之间,山萘酚最低,为0.125 2 mg·g^-1;沙棘叶黄酮提取液具有较强的还原力及较高的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和羟基自由基清除率,抗氧化活性较高。本研究为沙棘叶黄酮的工业化生产提供了科学依据。     

鱼腥草叶总黄酮的提取分离

采用微波辅助提取鱼腥草叶总黄酮,并用正交试验进行工艺参数的优化。同时选择7种大孔树脂,比较其对鱼腥草叶总黄酮的吸附量和解吸率,筛选出较优的大孔树脂并对其动态吸附及解吸性能进行考察。结果表明:优化的工艺条件为乙醇浓度50%,固液比1∶50(w/v),预浸泡30 min,微波作用时间30 s,微波功率540 W;与传统乙醇提取法相比,微波法使每次提取时间由3 h减少为30.5 min,提取率从92.14%增加到95.93%。NKA-9型大孔树脂对鱼腥草叶总黄酮有较好的吸附和解吸效果;较优的吸附分离工艺参数为:样液pH值在3.00～3.50,上样液流速1 mL/min,上样液浓度2.21～3.10 mg/mL,用70%乙醇洗脱时,解吸率达97.8%,3BV洗脱液基本上能将鱼腥草叶总黄酮洗脱下来。     

中国水仙凝集素基因NTA的克隆、序列分析及蛋白结构预测

凝集素是一种糖专一性结合蛋白,它可以识别不同的糖类。植物凝集素是植物防御系统重要的组成部分。本研究采用RT-PCR的方法,从中国水仙花蕾中克隆了凝集素基因NTA,运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析以及对其蛋白结构进行预测。结果表明,得到的NTA基因全长698bp,包含一个完整的开放阅读框516bp。该基因编码一个含有172个氨基酸的凝集素前体蛋白,该前体蛋白的等电点和分子量分别为5.84和18615.19Da。序列比对结果表明该基因编码的蛋白与其他单子叶植物如杂种水仙、雪花莲、君子兰、石蒜花和孤挺花的凝集素蛋白的同源性较高,分别为84%、80%、77%、78%以及82%。蛋白结构预测表明,中国水仙凝集素蛋白与洋水仙凝集素蛋白在结构上非常相似。对该基因编码的蛋白进行分析及蛋白结构模拟可知,该蛋白含有三个特殊的功能结构域和alpha-D-甘露糖结合表面(QXDXNXVXY)。     

干燥温度对2个品种木薯嫩茎叶黄酮提取率的影响

为提高木薯嫩茎叶黄酮资源利用水平,以木薯品种SC09与SC205为研究对象,分析不同干燥温度(40~120℃)对黄酮提取率及干燥后其贮存稳定性的影响,探讨木薯嫩茎叶采后干燥收贮方法。结果表明,随干燥温度增大,总黄酮提取率先升后降再升,黄酮成分芦丁、穗花杉双黄酮或儿茶素、山奈酚、二氢黄酮甙、槲皮素提取程度依次减小。120℃与110℃分别干燥的SC09、SC205嫩茎叶,总黄酮达提取峰值,并120 d贮存期内稳定性最好。干燥嫩茎叶贮存后,二氢黄酮甙提取程度增大,其他5种成分随品种、温度增减不一;山奈酚提取率变异系数(CV)最小,其值为1.03%~6.86%,稳定性最好;110℃干燥后SC205中芦丁和山奈酚的提取程度增加最大,增加率分别为44.89%和7.27%,变异程度小(CV为6.94%、4.59%),提取率稳定性好;儿茶素、穗花杉双黄酮、槲皮素、二氢黄酮甙提取率的最大提升率分别为211.60%、17.60%、186.39%、538.08%,但贮存期内变异程度大(CV=18.47%~50.03%),不稳定。本研究还进一步提出了基于黄酮利用的木薯茎叶干燥贮存预处理方案。     

小麦幼穗蛋白质双向电泳条件的优化

本研究以温光敏小麦为试材,用TCA/丙酮和酚提取法提取小麦幼穗蛋白样品,进行了双向电泳优化分析,并对双向电泳过程中出现的问题进行了讨论。结果表明,用TCA/丙酮法提取小麦幼穗蛋白质其产率（浓度）高于酚提取法。SDS-PAGE电泳显示,用TCA/丙酮提取法提取的蛋白质能获得较清晰条带,分辨率较高,而酚提取法提取的蛋白质其条带模糊,分辨率低。对蛋白质纯化除盐可以提高分辨率,减少横竖纹,获得背景清晰的圆形蛋白点。通过ImageMasterTM 2D Platinum5.0软件分析凝胶图谱,结果显示纯化后可降低噪点,纯化后蛋白点数可从未纯化蛋白点数的216增加到583。显然,采用TCA/丙酮法可获得高浓度高质量的蛋白质,而进一步纯化、除盐离子可进一步获得背景清晰可高重复性的电泳图谱。在双向电泳实验过程中,观察到一些异常缺陷胶的出现,如双向电泳图谱中蛋白点扩散,蛋白聚集形成斑点串,没有点或点很少,出现纵纹横纹及图谱扭曲等影响图谱质量的严重问题,本研究对这些问题做了分析并提出了解决方案。     

响应面法优化提取花椒籽蛋白质工艺研究

本研究以花椒籽为原料,采用盐提法提取花椒籽中蛋白质。在单因素实验基础上,根据Central-Composite中心组合实验设计原理,采用响应面分析法,考察NaCl浓度、提取时间、提取温度、料液比、pH值对蛋白质得率的影响。结果表明,响应面法优化所得的最佳工艺条件可靠,其最佳工艺条件为:NaCl浓度0.79mol·L-1,提取时间60min,提取温度35℃,料液比1∶17.5,pH值8.78。在此最佳工艺条件下花椒籽粗蛋白得率为18.92%。     

土壤铅污染对密毛白莲蒿茎叶解剖结构影响的研究

对200 mg/L铅溶液处理的非矿区、矿区密毛白莲蒿的茎、叶解剖结构进行了比较研究.结果表明,非矿区密毛白莲蒿茎在铅胁迫下组织结构变化较小.矿区密毛白莲蒿茎表现出对铅的适应性,茎表皮加厚,细胞壁加厚,木质部导管壁出现加厚现象,导管中有黑色物质.非矿区密毛白莲蒿叶在铅胁迫下整个组织结构极其松散,组织内部的细胞形状不规则,细胞大小不规律,且排列混乱,部分细胞出现了解体的现象,完整的细胞中叶绿体含量明显减少.而矿区密毛白莲蒿叶解剖结构变化较小,其组织结构较完整而且内部细胞排列很紧密,细胞形状较规则,大小均一.矿区密毛白莲蒿在铅胁迫下表现出了很强的耐受性,为铅污染土壤植物修复的理论研究和技术实施提供了一种新的种质资源.     

干制羊肉基因组DNA不同提取方法的比较

为了研究干制加工羊肉基因组DNA的最佳提取方法,本试验采用传统酚-氯仿法、磁珠法、改良CTAB法、离心柱法分别提取干制处理后的羊肉基因组DNA,并对4种方法提取的羊肉基因组DNA浓度、纯度、完整性以及提取所需时间、PCR扩增效果等进行比较。结果表明,采用磁珠法提取DNA的效果更好,DNA浓度为118.87 ng·μL^-1,A₂₆₀/A₂₈₀值为1.89,而且此方法具有提取时间短、效率高、污染小等特点。本研究结果为干制加工羊肉基因组DNA的大批量提取和检测提供了参考依据。