猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病二联核酸疫苗的构建及其免疫效力

[目的]构建猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病的二联核酸疫苗并研究其免疫效果。[方法]将辽宁某猪场发病猪病料中猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的ORF5基因克隆至真核表达载体pIRES-neo的CMV启动子下游,然后用猪2型圆环病毒（PCV-2）的内蒙古分离株的ORF2基因替换pIRES的neo基因,构建真核表达质粒。通过W estern blot和IFA方法检测构建的重组质粒在BHK细胞中的表达情况。将重组质粒免疫Balb/c小鼠,检测免疫后的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群的数量。[结果]成功构建了重组表达质粒pIRES-ORF2-ORF5,W estern blot和IFA试验证实该重组质粒在BHK细胞内成功表达了目的蛋白。与灭活苗相比,pIRES-ORF2-ORF5核酸疫苗免疫小鼠ELISA抗体水平差异不显著;其脾T淋巴细胞亚群数量显著高于灭活疫苗免疫组。[结论]构建的二联核酸疫苗能够诱导小鼠产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应,为更好地防制猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病提供了条件。     

猪圆环病毒2型核酸疫苗的构建及其免疫效果

【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因疫苗,并对其免疫效果和安全性进行研究。【方法】将PCV2ORF2基因从pMD-ORF2*质粒(包含PCV2 SCH A株ORF2基因)酶切回收,插入到真核表达载体pcD-NA-3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA-ORF2,对该质粒进行酶切和PCR鉴定。将pcDNA-ORF2转染IBRS-2细胞,进行Western blotting检测。将构建好的pcDNA-ORF2制成核酸疫苗,按100μg/只腿部肌肉注射免疫Balb/c小白鼠,同时设pcDNA-3.1(+),PCV2全毒和PBS为对照,共免疫2次,间隔2周。分别于首免后第14天和56天采血,用ELISA法检测抗体;于首免后第56天,采用淋巴细胞增殖试验(MTT法)和流式细胞仪(FACS)对小鼠的细胞免疫进行检测。取首免后56 d小鼠的心肝、脾、肺、肾和脑等实质器官,采用PCR方法检测pcDNA-ORF2核酸疫苗的安全性。【结果】Western blotting结果显示,pcDNA-ORF2构建成功,并在哺乳动物细胞中获得表达。pcDNA-ORF2核酸疫苗能诱导小鼠产生较强的细胞免疫和体液免疫应答。PCV2ORF2基因未整合到小鼠染色体上。【结论】pcDNA-ORF2可诱导小鼠产生免疫反应,其对小鼠是安全的。     

猪圆环病毒2型感染对高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫应答的影响

采用阻断ELISA法对单独接种高致病性猪繁殖与呼吸综合征组(hpPRRS,B组)及PCV2人工感染21 d后接种hpPRRS疫苗组(PB组)不同时期血清中的PRRSV抗体进行检测,同时对不同时期前腔静脉血进行CD4/CD8流式细胞术及血常规分析.结果表明,在接种后32 d B组白细胞含量极显著高于PB组(P＜0.01),接种后62 d B组淋巴细胞含量极显著高于PB组(P＜0.01),接种后75 d PB组幼稚型Th细胞含量显著高于B组(P＜0.05),接种后32、62及75 d B组Tc细胞含量为PB组的2.40、1.98和1.86倍,接种后32、48及62 d B组记忆/激活Th细胞含量分别为PB组的1.54、1.46及1.32倍.     

一例猪流行性腹泻和猪繁殖与呼吸综合征猪圆环病毒2型混合感染的诊断

为诊断贵州省都匀市某猪场送检病料的感染类型,调查了其流行病学、临床症状和病理剖检特征,并采用多重PCR检测技术对其进行检测。结果表明,该猪场存在猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合征病毒的混合感染。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪Ⅱ型圆环病毒混合感染的诊断

采用病理学、PCR等实验室检测方法对采自吉林省某猪场的发病猪组织病料进行PRRSV、PCV2检测,结果表明该猪场的发病猪存在PRRSV和PCV2混合感染。对PRRSV和PCR扩增结果进行克隆分析,该基因序列与模板(EF112445.1)碱基序列有很高的同源性。     

猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪细小病毒混合感染的流行病学调查

根据Genbank中PRRSV ORF7及PPVVP2基因序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PPV的RT-PCR及PCR方法。应用建立的方法对38个PCV2阳性病料进行了PRRSV及PPV检测,以确定猪群中PCV2与PRRSV和/或PPV混合感染情况,结果表明,15份样品表现为PRRSV与PCV2混合感染,占样品总数的39.4%;2份样品表现为PCV2与PPV混合感染,占5.3%。另外,还有一定比例的三重感染,共3个样品,占7.9%。由此可见,猪群中PCV2与PRRSV及PPV混合感染比较普遍。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型混合感染的流行病学调查

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)在我国猪场混合感染的发病情况,根据Gen Bank中PRRSV ORF5及PCV2 ORF1基因序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PCV2的RT-PCR及PCR方法,对2013—2015年采自吉林、辽宁、黑龙江、山西、山东、广东6省192份样品进行检测。结果发现:PRRSV感染率为22.9%,PCV2感染率为64.3%,28份样品为混合感染阳性,阳性率达14.58%。猪群中PRRSV和PCV2的感染比较普遍,混合感染率也较高,加重了疫病防控的难度。     

猪繁殖与呼吸综合征 圆环病毒病2型和副猪嗜血杆菌病混合感染的诊治

河南潢川县某猪场发生保育仔猪出现断奶后消瘦、呼吸困难、关节肿胀为主要特征的疫病。通过流行病学调查,临床症状、病理剖检和实验室诊断,证实为典型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型与猪副嗜血杆菌混合感染,经采取针对性措施,取得良好防控效果。     

猪圆环病毒2 型疫苗研究进展

疫苗免疫接种是防控猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)的主要方式,PCV-2疫苗的研究与开发已成为国内外兽医工作者的关注热点.在国际市场上销售的商品化PCV-2疫苗主要包括亚单位疫苗、嵌合病毒疫苗和灭活疫苗,其中PCV-2灭活疫苗已在我国规模化猪场中广泛使用.综述了近年来国内外各类PCV-2疫苗研究进展及存在的问题,以期为猪圆环病毒病的防制与PCV-2新型疫苗的研发提供参考.     

猪繁殖与呼吸综合征及猪圆环病毒病混合感染的诊断与防治

为了研究诊断与防治猪繁殖与呼吸综合征及猪圆环病毒病混合感染的有效措施,回顾性分析了自2015年3月至2016年3月期间某养殖场发生疫情的40例发病猪,以临床症状、流行病学、药物治疗分析、实验室抗体快速检查、病理剖检等检测方式进行处理,以计算机表法对发病猪进行分组,第1组(14例)发病猪应用乳酸环丙沙星注射液、自家苗、黄芪多糖注射液,第2组(13例)发病猪应用硫酸卡那霉素注射液、乳酸环丙沙星注射液、抗猪多价免疫球蛋白、黄芪多糖注射液;第三组(13例)发病猪不应用药物注射治疗,探究三组发病猪治愈率。结果发现,第1组发病猪治愈率92.85%、第2组发病猪治愈76.92%,第3组发病猪治愈15.38%,第1组显著高于低2组与第3组。结论:在预防与治疗猪繁殖与呼吸综合征与猪圆环病毒病混合感染中应用乳酸环丙沙星注射液、自家苗、黄芪多糖注射液具有显著作用,具有应用价值。     

4种猪群常见病毒基因芯片检测方法的建立与应用

【目的】建立猪瘟病毒(CSFV)、高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)及猪细小病毒(PPV)的基因芯片检测方法,为这4种病的实验室诊断和流行病学调查提供一种快速、高效的病原学诊断方法。【方法】根据GenBank中CSFV、高致病性PRRSV、PCV-2、PPV的相关基因序列,设计合成相关引物,采用PCR方法得到具有荧光标记的PCR产物,然后与含有特定检测探针的芯片进行杂交,建立其基因芯片检测方法,并对该方法的灵敏性和重复性进行检测。应用建立的基因芯片检测方法,对150份临床样品进行检测。【结果】建立了针对CSFV、PRRSV、PCV-2和PPV 4种病毒的基因芯片检测方法,该方法对临床150份样品的检测结果显示,CSFV阳性样品有25份,高致病性PRRSV阳性样品有45份,PCV-2阳性样品有70份,PPV的检测结果全部为阴性,其中混合感染样品有18份。【结论】建立了对CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV 4种猪群常见病毒的基因芯片检测方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。     

猪瘟病毒E2基因DNA疫苗的试验研究

用构建的E2-pcDNA4.0 DNA疫苗对Balb/c小鼠、家兔和仔猪进行免疫,经3次肌肉接种,间隔15 d免疫后,测定抗体水平.结果表明,构建的DNA疫苗能诱导小鼠产生中和性抗体,免疫家兔最少可抵抗10个最小感染剂量(M ID)的猪瘟兔化弱毒苗的攻击.攻毒试验结果表明,E2-pcDNA4.0 DNA疫苗可抵抗致死剂量的CSFV石门株强毒的攻击.     

Investigation on the co-infections of Toxoplasma gondii with PRRSV,CSFV or PCV-2 in swine in part of China

The objective of the present investigation was to estimate the prevalence of Toxoplasma gondii infection and co-infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV), classical swine fever virus(CSFV) and porcine circovirus type 2(PCV-2) in pigs in China. A total of 372 tissues or serum samples collected from pigs distributed in 9 provinces/municipalities of China during the period from February 2011 to November 2012 were assayed for T. gondii antigens and antibodies using enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) technique, while the PCR was designed for the detection of the PRRSV, CSFV and PCV-2, respectively. The total positive rate of T. gondii, PRSSV, CSFV and PCV-2 was 9.14%(34/372), 50.00%(186/372), 37.10%(138/372) and 3.23%(12/372), respectively. Among the 34 T. gondii positive samples, 26 samples were simultaneously infected with T. gondii and viruses, while the remaining eight samples were infected with T. gondii alone. In addition, the co-infection rate of T. gondii with PRSSV, T. gondii with PRSSV and CSFV, T. gondii with PRSSV and PCV-2, T. gondii with CSFV and PCV-2, T. gondii with PRSSV, CSFV and PCV-2 was 1.61%(6/372), 4.03%(15/372), 0.27%(1/372), 0.27%(1/372) and 0.81%(3/372), respectively. The results of the present survey revealed that PRRSV and CSFV were the common pathogens co-existing with porcine toxoplasmosis in China, and both of them could increase the chances of T. gondii infection in pig. This is the first report of T. gondii co-infections with viruses in pigs. It is very important to understand the interactions of parasite and virus, and can be used as reference data for the control and prevention of co-infections of T. gondii and viruses in pigs.     

PRRSV、PCV-2临床感染猪外周血中ACTH含量的变化

采集61头有呼吸道疾病症状猪的病料,采用分子生物学方法进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、PRRSV变异株、猪圆环病毒2型(PCV-2)的检测,并采集血液分离血清,用放射性免疫法检测其外周血中促肾上腺皮质激素(ACTH)的含量.结果表明:PCV-2核酸阳性率为72.13%,PRRSV为39.34%,PRRSV变异株为22.95%;临床存在混合感染,特别是PRRSV与PCV-2的混合感染,感染率达16.39%;PRRSV、PRRSV变异株和PCV-2的感染均比对照组极显著地提高ACTH的含量,其中以PRRSV变异株与PRRSV的混合感染对ACTH的影响最大,ACTH含量达32.20 pg.mL-1.可见,PRRSV、PCV-2的感染促进了ACTH的分泌,增加猪的应激反应,从而降低病猪的免疫功能.     

猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病复合PCR诊断方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株(ATCC VR-2332)的部分ORF6及ORF7保守序列和已发表的猪圆环病毒株PCV-2(DQ195679)的ORF-2基因保守序列,设计合成了2对特异引物,分别扩增出大小为426 bp和631 bp特异性基因片段,通过优化RT-PCR和PCR条件,最终建立了可同时检测PRRSV和PCV-2的复合PCR诊断方法。应用此方法分别对河南省不同地区送检的15头份病、死猪的血清、淋巴结、肺、肝等组织进行检测,结果8头份PRRSV阳性,5头份PCV-2阳性,其中3头份PCV-2和PRRSV同时为阳性,其余猪为阴性,健康猪对照样品全部阴性。结果表明,PRRSV和PCV-2复合PCR诊断方法具有高度特异性和敏感性,可用于兽医临床诊断。     

猪C3d分子佐剂PRRSV GP5基因核酸疫苗的构建及免疫效果的研究

 【目的】构建猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5基因C3d-P28分子佐剂重组质粒,探明C3d-P28分子佐剂的免疫增强效果。【方法】用大肠杆菌疫苗对健康猪进行免疫激活,提取猪肝脏总RNA,RT-PCR克隆C3d-P28并连接至pUC19载体,构建pUC19-P28.n（2、4、6）串联体,然后分别将P28.n（2、4、6）连接至真核表达载体pcDNA3.1构建成 pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）。RT-PCR扩增PRRSV GP5基因,分别定向克隆至pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）中,构建pcDNA3.1-GP5-P28.n（2、4、6）重组质粒;提取重组质粒进行双酶切、电泳,同时用重组质粒转染Marc 145细胞,经间接免疫荧光进行蛋白表达检测,并用重组质粒免疫小鼠,通过ELISA试剂盒检测小鼠体内抗体、IL-4和IFN-γ的水平,检验重组质粒的免疫效果。【结果】从猪肝脏中克隆了C3d cDNA,构建了pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）串联体,并将PRRSV GP5基因定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）中,构建了PRRSV GP5重组质粒（pcDNA3.1-GP5-P28.2、pcDNA3.1-GP5-P28.4、pcDNA3.1-GP5-P28.6）;通过检测小鼠血清中抗体、IL-4和IFN-γ的结果显示,抗体效价、IL-4和IFN-γ含量均比对照组高,且以pcDNA3.1-GP5-P28.6组的效果最好,与空白对照及PCDNA3.1-GP5组比较差异均显著（P<0.05）。【结论】构建了猪补体C3d-P28分子佐剂PRRSV GP5重组质粒,该质粒可刺激机体产生较高的体液免疫和细胞免疫水平,补体 C3d-P28分子佐剂能显著增强PRRSV GP5基因的免疫效果。     

猪园环病毒2型江西株的全基因序列分析

根据已发表的猪圆环病毒2型(PCV-2)的全基因组序列,设计1对特异性引物,进行PCR扩增,将1个扩增产物连接到pUCm-T vector上并克隆到大肠杆菌DH5α中,得到1个阳性克隆,经提取质粒进行PCR、酶切、测序鉴定,证明扩增出了PCV-2目的片段.结果表明本实验分离株(JXPCV-2)与国内外不同地域的PCV-2全基因组序列的差异很小,同源性在94.2%～99.7%;进化树分析表明JXPCV-2与其他10株PCV-2分离株的亲缘关系较近,与浙江分离株(AY691169)亲缘关系最近.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M蛋白共表达的自杀性DNA疫苗的构建及其免疫应答

【目的】探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）自杀性DNA疫苗的免疫效果。【方法】将ORF5和ORF6基因分别插入可以同时表达两个外源基因的表达载体pSCA2的26S启动子下游，获得ORF5和ORF6双基因共表达自杀性DNA疫苗pSFV-56。【结果】Western blot检测证实ORF5和ORF6基因获得正确表达，并且所表达的GP5和M蛋白可以形成异源二聚体。将pSFV-56免疫Balb/c小鼠，首免后4周可检测到特异性PRRSV中和抗体，首免后8周的中和抗体最高可达1﹕32，同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答。进一步将pSFV-56免疫断奶仔猪，二免后4周即可产生1:8～1:16的中和抗体，直到二免后6周仍维持这种高水平的中和抗体，而且也可检测到较高的特异性细胞免疫应答。【结论】上述研究结果表明pSFV-56具有良好的免疫原性和诱发免疫动物产生较高免疫应答的能力。     

左旋咪唑对金黄色葡萄球菌粘附素 ClfA重组 DNA 疫苗免疫效果的影响

为了探究左旋咪唑（LMS）作为免疫增强剂对金黄色葡萄球菌粘附素 ClfA 重组 DNA 疫苗免疫效果的影响.分别用含左旋咪唑的 ClfA 重组 DNA 疫苗、ClfA 重组 DNA 疫苗及空载体免疫昆明白小鼠,通过巨噬细胞吞噬试验、MTT 实验、免疫血清对金黄色葡萄球菌识别能力、酶联免疫吸附试验和攻毒试验验证免疫效果.结果表明,含左旋咪唑 DNA 疫苗组在巨噬细胞吞噬指数、脾脏淋巴细胞增殖、免疫血清对金黄色葡萄球菌识别能力方面有增强作用,与其他两组相比差异显著（P ＜0．05）,含左旋咪唑 DNA 疫苗组小鼠抗体水平及攻毒实验保护率高于单独 ClfA 重组 DNA 组和空载对照组,LMS 能够对 ClfA 重组 DNA 疫苗免疫效果起到增强作用.