山羊促性腺激素释放激素1基因外显子克隆及序列分析

促性腺激素释放激素1(gonadotropin-releasing hormone 1,GnRH1)是GnRH存在于脑下垂体的主要形式,它在调节生殖内分泌系统产生促性腺激素方面起着主要作用。根据牛GnRH1基因全序列设计3对引物,采用PCR-SSCP技术检测GnRH1基因外显子2、3和4在高繁殖力山羊品种（济宁青山羊）、中等繁殖力山羊品种（波尔山羊）和低繁殖力山羊品种（内蒙古绒山羊和安哥拉山羊）中的单核苷酸多态性,分析该基因对山羊高繁殖力的影响;并对山羊GnRH1基因3个外显子进行克隆测序,推导出编码的氨基酸序列,然后将山羊核苷酸和氨基酸序列与牛、人、狗、黑猩猩、猴、大鼠和小鼠7个物种的序列进行同源性比较。结果表明,在4个山羊品种中均未检测到GnRH1基因3个外显子的多态性;8个物种的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为73.6%～99.3%和62.0%～97.8%。可见,哺乳动物GnRH1基因外显子2、3和4序列保守性较强,该区域可能不是影响山羊高繁殖力的功能结构域。     

山羊骨形态发生蛋白2基因外显子克隆及序列分析

设计4对引物,采用PCR-SSCP技术检测骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）基因外显子2、3在济宁青山羊、安哥拉、波尔、内蒙古绒山羊4个品种共191个个体中的单核苷酸多态性,分析该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响,并对济宁青山羊BMP2基因2个外显子进行克隆测序。结果表明,4对引物的扩增片段在4个山羊品种中均无多态性;山羊扩增片段核苷酸和氨基酸序列与人、黑猩猩、牛、犬、大鼠、小鼠6个物种的同源性分别为86.5%～91.3%和88.8%～99%;与其他物种相比,山羊BMP2扩增片段推导氨基酸序列存在3处特有突变,分别是位于第131、353、365位的脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸变为苏氨酸(P131T)、天冬氨酸(V353D)、脯氨酸(L365P)。可见,哺乳动物BMP2基因外显子2、3序列保守性强,该区域可能不是影响山羊高繁殖力的功能结构域。     

济宁青山羊多羔性候选基因BMP15的研究

根据绵羊骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15,BMP15）基因序列设计2对引物（P1和P2）,分别扩增随机选取的安哥拉山羊和济宁青山羊各5个个体的BMP15基因外显子1、2并克隆测序。测序结果与绵羊BMP15基因外显子1（AF236078）相比,山羊BMP15基因外显子1在第268-270位插入3个核苷酸CTT（268insCTT）,导致编码的氨基酸第12位插入亮氨酸（12insL）;山羊BMP15基因外显子2序列长度与绵羊（AF236079）一致,但存在7处核苷酸不同,引起4个氨基酸变化,济宁青山羊与安哥拉山羊相比在963位存在核苷酸变化（A963G）。依据A963G变异设计引物P3,利用PCR-SSCP方法检测BMP15基因外显子2在高繁殖力品种（济宁青山羊）、中等繁殖力品种（波尔山羊）和低繁殖力品种（安哥拉山羊和内蒙古绒山羊）中的单核苷酸多态性,分析该基因对济宁青山羊多羔性的影响。结果在济宁青山羊中检测到AA、AG和GG基因型,在波尔山羊中检测到AG和GG基因型,在安哥拉山羊和内蒙古绒山羊中仅检测到AA基因型;测序分析发现GG与AA基因型相比存在1个突变（A963G）,导致第300位的丝氨酸变为甘氨酸（S300G）;济宁青山羊AA、AG和GG基因型频率分别为0.008、0.059和0.933;高繁殖力山羊品种与中、低繁殖力山羊品种之间BMP15基因型分布存在显著（P〈0.05）和极显著（P〈0.001）差异;GG基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比AG和AA基因型的分别多0.71只（P〈0.05）和1.57只（P〈0.05）,AG基因型比AA基因型的多0.86只（P〈0.05）。本研究结果初步显示BMP15基因可能是影响济宁青山羊多羔性的一个主效基因或是与之紧密连锁的一个标记。     

促黄体素β基因多态性及其与济宁青山羊产羔数的关系

为了解促黄体素β基因多态性与济宁青山羊产羔数的关系,采用PCR-SSCP技术检测促黄体素v亚基(Luteinizing hormone beta-subunit,LHβ)基因5'调控区和3个外显子在高繁殖力(济宁青山羊)、中等繁殖力(波尔山羊)和低繁殖力山羊品种(辽宁绒山羊和安哥拉山羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响.结果表明:山羊与绵羊的LHB基因核苷酸序列相似性为98%.6对引物中,仅引物P1和P5扩增片段存在多态性.对于P1扩增片段,在4个山羊品种中均检测到AA、AB和BB 3种基因型;测序分析发现BB与AA基因型相比在5'调控区存在2处突变202C→A和210C→T;济宁青山羊3种基因型之间产羔数差异均不显著(P>0.05).对于P5扩增片段,在济宁青山羊中检测到CC、CD和DD 3种基因型,辽宁绒山羊中检测到CC和CD2种基因型,波尔山羊和安哥拉山羊中都只检测到CC基因型;测序分析发现DD与CC基因型相比在外显子2存在单碱基突变1124C→T;济宁青山羊CC、CD和DD基因型频率分别为0.38、0.44和0.18;DD和CD基因型济宁青山羊平均产羔数分别比CC基因型的多0.99(P<0.01)和0.87只(P<0.01).济宁青山羊在P1、P5两个座位上都处于哈迪-温伯格平衡状态(P1座位:X2=1.66,P=0.437;P5座位:X2=1.22,P=0.544).     

山羊BMP15基因FecX-L突变的检测

采用PCR-SSCP方法在高繁殖力山羊品种（济宁青山羊、波尔山羊和文登奶山羊）和低繁殖力山羊品种（内蒙古绒山羊、安哥拉山羊和辽宁绒山羊）中检测骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因的FecX-L突变,同时研究该基因突变对济宁青山羊高繁殖力的影响。结果表明这6个山羊品种都没有发生与Lacaune绵羊相同的FecX-L突变（C53Y）。可见BMP15基因中影响Lacaune 绵羊高繁殖力的突变位点对济宁青山羊的高繁殖力没有显著影响。     

济宁青山羊BMP15基因外显子2的克隆与序列分析

本研究对高繁殖力的山羊品种济宁青山羊和低繁殖力的山羊品种内蒙古绒山羊共20只母羊的骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15, BMP15）基因第2外显子的扩增产物进行了克隆测序及序列比较分析。结果表明：BMP15基因第2外显子的第3对引物扩增片段存在多态。济宁青山羊与内蒙古绒山羊相比，其BMP15基因外显子2差异由2个核苷酸和2个氨基酸改变组成，核苷酸同源性为99%。济宁青山羊与鸡、小鼠、人、猪、牛、绵羊之间BMP15基因外显子2的核苷酸序列同源性为71%～99%，氨基酸序列同源性为43%～99%。     

4个山羊品种BMP6基因部分片段的多态性分析

根据GenBank发表的绵羊骨形态发生蛋白6（bone morphogenetic protein 6,BMP6）基因部分序列所包含的外显子5、6、7和小鼠BMP6基因外显子5、6、7序列设计3对引物,采用PCR SSCP技术检测BMP6基因外显子5、6和7在济宁青山羊、安哥拉山羊、波尔山羊、内蒙古绒山羊4个山羊品种250个个体中的单核苷酸多态性。结果发现这3对引物的扩增片段在检测的4个品种中均无多态性,说明所检测的BMP6基因外显子5、6、7序列比较保守。     

基因外显子2的克隆与序列分析

 本研究对高繁殖力的山羊品种济宁青山羊和低繁殖力的山羊品种内蒙古绒山羊共20只母羊的骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15, BMP15）基因第2外显子的扩增产物进行了克隆测序及序列比较分析。结果表明：BMP15基因第2外显子的第3对引物扩增片段存在多态。济宁青山羊与内蒙古绒山羊相比，其BMP15基因外显子2差异由2个核苷酸和2个氨基酸改变组成，核苷酸同源性为99%。济宁青山羊与鸡、小鼠、人、猪、牛、绵羊之间BMP15基因外显子2的核苷酸序列同源性为71%～99%，氨基酸序列同源性为43%～99%。     

绵羊和山羊BMP15基因FecXR突变的检测

为了检测骨形态发生蛋白15(BMP15)基因在绵羊和山羊中的突变,本研究采用PCR-SSCP方法在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊和湖羊)、山羊品种(济宁青山羊和波尔山羊)和低繁殖力绵羊品种(多赛特和特克塞尔)、山羊品种(内蒙古绒山羊和安哥拉山羊)中检测BMP15基因FecXR突变,并对小尾寒羊和济宁青山羊扩增片段进行核苷酸和氨基酸序列分析.结果表明,这8个羊品种均没有发生与Rasa Aragonesa绵羊相同的FecXR突变;小尾寒羊核苷酸序列与GenBank中绵羊BMP15序列(AF236079,NM_001114767)完全一致,济宁青山羊与小尾寒羊相比存在3处碱基不同(T529G、C530G和T576C)和2个氨基酸差异(V155G和S171P).可见BMP15基因影响Ra-sa Aragonesa绵羊高繁殖力的突变FecXR对小尾寒羊、湖羊、济宁青山羊和波尔山羊的繁殖力均没有显著影响.     

绵羊雌激素受体基因外显子4多态性分析

根据GenBank发表的人、鸡、大鼠雌激素受体(estrogen receptor,ESR)基因外显子4的序列设计1对引物,采用PCR SSCP技术分析ESR基因外显子4在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊和湖羊）和低繁殖力绵羊品种（特克塞尔、中国美利奴、考力代和杜泊）中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明,ESR基因的此对引物扩增片段在所检测的6个绵羊品种中均不存在PCR SSCP多态性,说明所检测的ESR基因外显子4序列比较保守,该区域可能不是影响绵羊高繁殖力的功能结构域。     

Polymorphism of <Emphasis Type="Italic">GDF</Emphasis>9 gene and its association with litter size in goats

Growth differentiation factor 9 (GDF9) was studied as a candidate gene for high prolificacy in goats. The polymorphism of exon 1 and flanking of GDF9 gene was detected by PCR-SSCP in five goat breeds with different prolificacy. Three genotypes (AA, AB and BB) were detected in goat breeds joined and two silent mutations (c.183A>C and c.336C>T) were identified in comparison genotype AA with genotype BB. Heterozygous genotype AB and wild type BB were detected in all five goat breeds and homozygous genotype AA was only detected in Jining Grey goats. The frequencies of genotypes AA, AB and BB were 0.18, 0.42 and 0.40 in Jining Grey goats, respectively. The genotype distribution was different (P < 0.01) between high prolificacy breed (Jining Grey goat) and low prolificacy breeds (Boer, Wendeng Dairy, Liaoning Cashmere and Beijing native goats). The Jining Grey goat does with genotype AA and AB had 0.72 (P < 0.01) and 0.56 (P < 0.01) kids more than those with genotype BB, respectively. The does with genotype AA had 0.16 (P > 0.05) kids more than those with genotype AB. These indicated that the allele A may have certain correlation with prolificacy in Jining Grey goats.     

山羊生长分化因子9基因FecTT突变检测

本研究采用PCR-RFLP方法检测生长分化因子9(growth differentiation factor 9, GDF9)基因FecTT突变在济宁青山羊、贵州白山羊、大足黑山羊、陕南白山羊、古蔺马羊、马头山羊、波尔山羊、成都麻羊、萨能奶山羊、文登奶山羊、板角山羊、金堂黑山羊、关中奶山羊、川东白山羊、安哥拉山羊、辽宁绒山羊、内蒙古绒山羊等17个山羊品种中的分布。结果表明,在17个山羊品种中都未检测到FecTT突变,提示,GDF9基因影响Thoka绵羊高繁殖力的FecTT突变对以上17个山羊品种的繁殖力均没有显著影响。     

促性腺激素释放激素受体(GnRHR)基因多态性及其与山羊产羔数的相关性分析

本研究采用候选基因法对与繁殖性能有关的遗传标记进行筛选,旨在为山羊高产仔数的标记辅助选择提供确切的遗传依据。参考牛的促性腺激素释放激素受体(Gonadotropin releasing hormone receptor,GnRHR)基因序列设计4对引物,采用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测GnRHR基因在波尔山羊以及我国西南地区9个地方山羊品种中的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP),同时在川东白山羊、古蔺马羊和贵州白山羊3个群体中研究该基因多态性与山羊产仔数之间的相关性。结果显示,4对引物中只有引物P1扩增片段检测出多态性。对于P1的扩增片段,在不同的山羊品种中检测到AA、GG和AG 3种基因型,测序分析表明GG与AA型相比有一处单碱基突变(154G→A)。AA基因型个体在3个群体中产羔数最小二乘均值都显著高于GG和AG基因型个体(P<0.05),GA基因型个体在古蔺马羊中的产羔数显著高于GG型个体(P<0.05),而在其它2个品种中差异不显著(P>0.05)。本研究结果初步表明山羊GnRHR基因的突变与其繁殖性能有关,可能是影响山羊繁殖率的一个因素。     

贵州白山羊GDF9基因编码区1007位点的多态性

生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)基因是卵母细胞分泌的生长因子,调节卵泡的早期生长和分化。对贵州白山羊GDF 9基因的研究结果显示,编码区1007位碱基与已知山羊不同。为了研究1007位点对贵州白山羊繁殖力的影响,采用锚定PCR对GDF 9基因外显子2第18位氨基酸密码子所在区域进行了扩增、克隆测序和基因型分析,结果表明,GDF 9基因编码区1007位点表现出C/T多态性,使成熟肽第18位氨基酸为丙氨酸/缬氨酸替换;低产母羊均为杂合基因型,高产母羊中90%为杂合基因型,高产羊群与低产羊群之间基因型频率差异不显著（P＞0.05）,表明GDF 9基因1007位点的多态性与贵州白山羊产羔数之间没有直接的相关性。