菜豆几丁质酶基因转化马铃薯及后代表达

通过农杆菌侵染和原生质体直接转化法把菜豆几丁质酶基因导入到马铃薯加工品种大西洋中,获得了13株转化后代,经过PCR分析和Southern blot分析,在5株后代中扩增出900bp目标带,说明菜豆几丁质酶基因已整合到马铃薯四倍体基因组中。RT-PCR分析结果表明,其中的3株叶片中有菜豆几丁质酶基因的表达,而且抗病试验进一步证明了该基因在叶片中有较强的表达强度,转基因植株的抗病性比对照提高了30%以上。     

转几丁质酶基因烟草酶活性及抗病性研究

采用荧光定量法对转几丁质酶基因烟草T2植株的几丁质酶活性进行了测定，结果表明，转基因烟草株系的几丁质酶活性明显高于未转基因烟草，同时发现，pH对转基因烟草中的几丁质酶活性有一定的影响。对转基因烟草接种烟草炭疽病菌进行抗病性鉴定。     

转Lchi1烟草T_2代对梨腐烂病菌的抗性研究

获得转化梨几丁质酶基因Lchi1的烟草,检测组成型表达Lchi1基因烟草是否能提高对梨腐烂病菌(Valsa ceratosperma)的抗性,从而初步确定Lchi1基因的功能,为进一步开展梨抗腐烂病分子育种工作提供参考。构建梨几丁质酶基因Lchi1的植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,进而对转化的烟草T2代进行PCR及RT-PCR检测。利用离体叶片接种法,更直观地验证转基因烟草对梨腐烂病菌的抗性。Lchi1基因已经整合到烟草基因组中,并在烟草T2代中有效表达,在接种腐烂病菌后转基因烟草较未转基因烟草的抗腐烂病菌能力明显增强。梨几丁质酶基因Lchi1与腐烂病抗性相关联,可作为今后梨的抗腐烂病分子育种研究重要的基因来源。     

紫花苜蓿几丁质酶基因MsChiⅣ克隆及序列分析

本研究根据截形苜蓿(Medicago truncatula)根部的几丁质酶基因保守序列(GenBank登录号:AF167328)设计引物,通过RT-PCR直接扩增的方法得到了紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)根部几丁质酶基因保守序列.根据得到的保守序列设计3'端和5'端特异引物,分别从3'端和5'端扩增延长该片段,最后通过序列拼接获得紫花苜蓿根部一种几丁质酶基因的全长cDNA序列,命名为MsChiⅣ(GenBank登录号:FJ487629).MsChiⅣ基因全长为1 025 bp,开放性阅读框全长为849 bp,编码282个氨基酸,分子量为30.5 kD,预测等电点为4.66,其结构包括信号肽、几丁质结合区、糖苷水解酶区,为Ⅳ类几丁质酶,属于几丁质酶第19家族,在氨基酸水平上与截形苜蓿几丁质酶蛋白同源性最高,达到98%.蛋白结构分析表明该基因编码蛋白为非跨膜蛋白,存在于细胞质中.     

几丁质酶基因克隆及其野生蕉转化

本研究根据GenBank公布的木霉几丁质酶基因(chitinase)序列设计一对引物,采用RT-PCR方法从木霉(Trichoderma spp.)中克隆获得了几丁质酶基因全序列,编码区共1275bp,推测其编码424个氨基酸,该基因与哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的内切几丁质酶基因chit42(GenBank accession No.L14614)具有99%的同源性。在此基础上,将获得的几丁质酶基因从pGEM-T载体中用XbaⅠ和BamHⅠ切下,克隆到pBI121植物表达载体的XbaⅠ和BamHⅠ位点,构建了植物表达载体pBI-chit并将其转入根癌农杆菌菌株EHA105。该菌株转化野生蕉(Musa itinerans Cheesm.)胚性细胞悬浮系,经过抗性筛选、胚的诱导和萌发,获得成熟体细胞胚和再生苗。通过GUS组织化学法检测和PCR方法鉴定,结果表明外源基因已经成功转入到野生蕉中。本研究为下一阶段转化香蕉栽培品种和筛选抗香蕉枯萎病新种质奠定一定的基础。     

卵寄生真菌虫草棒束孢几丁质酶基因IFCHI1的克隆与分析

为研究卵寄生真菌在寄生并破坏卵的过程中几丁质酶的作用,本研究从烟草南方根结线虫卵上分离得到虫草棒束孢HNE3,采用RT-PCR及RACE技术,首次克隆得到一个几丁质酶基因IFCHI1。该基因DNA序列全长1 417 bp,具有1个内含子,长度为61 bp,包含1个1 185 bp的开放阅读框(ORF),编码1个由394个氨基酸组成的蛋白。通过在线软件分析,该蛋白理论分子量为44.1 k Da,等电点为4.88。通过Gen Bank比对,几丁质酶IFCHI1属于第18家族糖基水解酶,比对分析不同来源真菌几丁质酶,发现该几丁质酶具有典型的催化区保守序列SIGGW和FDGIDIDWE及结合区保守序列GTWEQGVYDY和GLGGAMWWESS。同源性比对发现,该几丁质酶同昆虫寄生真菌几丁质酶同源关系近。结果表明,从虫草棒束孢HNE3克隆得到几丁质酶基因IFCHI1,为进一步明确该菌产生的几丁质酶对南方根结线虫卵壳降解及降低孵化率的作用机理提供理论依据。     

一个杨树第V类几丁质酶基因的克隆及表达分析

几丁质酶是一种重要的糖苷酶,在植物抗生物及非生物胁迫的过程中发挥了重要的作用。根据序列差异及所含结构域的不同,杨树中的几丁质酶可以分为5类。其中关于第Ⅴ类几丁质酶的研究最少。本研究在加拿大杨中克隆到了一个第Ⅴ类几丁质酶基因PcCHI3。序列分析的结果显示,该基因cDNA全长1303bp,含完整的开放阅读框,可编码366个氨基酸。预测蛋白质分子质量为39.53kD。理论等电点(pI)为5.49。PcCHI3与苦瓜、烟草、梨的第Ⅴ类几丁质酶在系统进化树上同属一个分支。对PcCHI3在逆境胁迫及病原真菌诱导下的表达模式进行分析后发现,该基因可以被杨树病原真菌杨生褐盘二孢菌强烈诱导(可达对照的83倍),在干旱胁迫及盐胁迫的条件下表达量也出现了较大的上调(为对照的4~5倍)。研究结果为杨树几丁质酶功能的系统进化及林木抗性育种研究建立了一定基础。     

球孢白僵菌HFW-05几丁质酶基因的克隆与序列分析

通过对粉虱、小菜蛾高效的球孢白僵菌HFW-05几丁质酶基因的克隆及序列分析,旨在从分子水平上了解HFW-05菌株的几丁质酶特性。根据已发表的几丁质酶基因序列(EU828354)设计几丁质酶基因全长引物,扩增HF-WBbchit1全长基因,与大肠杆菌(Escherichia coli)克隆载体pMD19-T连接获得含有HFWBbchit1全长基因的重组质粒pMDchit1并测序。该基因的编码区包括1 047 bp,编码了348个氨基酸,分子量约为36.795 kDa,进行同源性比较分析结果表明:其基因序列与球孢白僵菌菌株NCIM1216几丁质酶基因(EU828354)和球孢白僵菌菌株Bb0062几丁质酶基因(AY145440)的核苷酸同源性最高,同源性达到98%。氨基酸序列与球孢白僵菌菌株Bb0062几丁质酶(AAN41259)同源性达到99%。     

几丁质酶基因chiB 的克隆及表达分析

几丁质酶能够通过破坏昆虫组织中的几丁质起到抗虫作用。为获得高表达的植物几丁质酶基因载体,通过同源克隆的手段,从粘质沙雷氏菌中分离到了chiB基因,长度为992 bp,构建了pET28表达载体,并用IPTG诱导了该基因的表达。经分析发现该基因表达产物属于糖基水解酶（glycosyl hydrolases）18家族,并利用pCAMBIA2300构建了植物表达质粒pCAM-35S-chiB。     

农杆菌介导法将β—1，3-葡聚糖酶基因导入油菜

菌核病是油菜生产中的主要病害，目前通过常规育种的方式还未寻找到合适的抗源，因此利用生物技术手段将外源抗病基因导入油菜已成为必然趋势。Grison等人将几丁质酶基因导入油菜中，表现出对菌核病的明显抗性。目前利用葡聚糖酶基因已对烟草进行了转化，表达此基因的转基因植株对黑胫病、赤星病及根腐病均有一定抗性，但将此基因导入油菜还未见报道。     

梨几丁质酶基因克隆及其生物信息学分析

对克隆获得的梨几丁质酶基因Lchi1进行生物信息学分析,从而为该基因的功能鉴定提供理论基础,以期为梨的抗病育种提供基因来源。根据Genbank中已克隆得到的几丁质酶基因保守区,在梨基因组数据库中进行Blast比对,调取DNA序列,从而设计引物,以高抗腐烂病品种‘小香水’(Pyrus ussuriensis cv. Xiaoxiangshui)为研究材料,克隆获得梨几丁质酶Lchi1基因cDNA全长,并对其进行初步的生物信息学分析。梨基因组数据库中调取的DNA序列2535 bp,含有3个外显子区、2个内含子区。Lchi1基因全长1300 bp,编码322个氨基酸,其蛋白的分子式为C1607H2407N415O468S17,分子量为35573.3 Da,理论等电点为7.10。二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,三级结构具有高度保守性。Lchi1编码蛋白为可溶性胞外蛋白,存在少量的潜在磷酸化位点,属于糖苷水解酶19家族,含有N-端信号肽,但是缺乏几丁质结合区。Lchi1基因属于CLASSⅡ几丁质酶基因,与其它科属植物的几丁质酶基因相似性均较高。     

紫花苜蓿几丁质酶ClassⅢ基因克隆及生物信息学分析

本文根据截叶苜蓿(Medicago truc atula)几丁质酶ClassⅢ基因(GenBank:AY294484.1)的全长序列设计引物,通过RT-PCR的方法得到紫花苜蓿(Medicago sative)几丁质酶ClassⅢ的核酸序列,命名为MsChiⅢ,在NCBI中的登录号为FJ872918。利用生物信息学软件分析MsChiⅢ,预测氨基酸序列的等电点、二级结构和三级结构,并构建系统发育树。结果显示该核酸序列全长为953bp,包括完整的开放阅读框,编码301个氨基酸,等电点为8.212。该序列所编码的蛋白属于几丁质酶18家族的内切酶,分布于细胞间隙,并含有几丁质酶18家族的特征序列——LGDVDFDIE,并预测MschiⅢ可能是一种具有几丁质酶和溶菌酶的双功能酶。     

几丁质酶及β-1,3-葡聚糖基因转化橡胶树的研究

旨在通过基因工程的方法提高橡胶树白粉病抗性。以高产、综合性状优良的大规模推广级品种‘热研7-33-97’15090块花药愈伤组织为受体,通过农杆菌介导将菜豆几丁质酶和烟草β-1,3-葡聚糖酶基因转入橡胶树,获得1386个抗性胚状体,其中277个通过次生体胚发生成功增殖。PCR结果表明有49个胚状体为阳性,转化效率为0.33%。本研究通过农杆菌介导将菜豆几丁质酶和烟草β-1,3-葡聚糖酶基因转入橡胶树,PCR阳性率为0.33%,为通过基因工程手段提高橡胶树白粉病抗性奠定了良好的基础。     

苋菜AmPCS基因的克隆及表达载体构建

合成植物络合素(PCs)是高等植物减轻重金属毒害的重要机制。通过对镉超积累苋菜品种天星米植物络合素合成酶基因(PCS)的克隆及表达载体构建,旨在为植物修复镉污染土壤奠定基础。依据同源克隆原理,通过RT-PCR和RACE方法克隆苋菜PCS基因。序列分析表明:苋菜PCS基因cDNA全长1 770 bp,包含完整的阅读框,编码485个氨基酸;苋菜PCs合成酶与拟南芥、遏蓝菜、芥菜及油菜PCs合成酶相似性为91.96%～95.67%,其氨基酸序列N端有1个Pfam:Phytochelatin结构域(功能为催化合成植物络合素)、C端有1个Pfam:Phytochelatin_C结构域(功能为重金属离子感应器)。因此,推断苋菜PCS基因编码蛋白是PCS-like家族的新成员,具有催化合成植物络合素的功能,将它在GenBank注册,序列号为:JN979370,命名为AmPCS。在AmPCS基因的编码区加入BamH I和Sac I酶切位点,双酶切植物表达载体pBI-121和带有酶切位点的PCR产物,成功获得苋菜PCS基因正义表达载体pBI-PCS。     

陆地棉一个丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白基因的克隆与表达分析

通过RT-PCR获得一个编码棉花丝氨酸/苏氨酸激酶类似蛋白全长的cDNA片段,其编码的氨基酸序列与拟南芥ATPK3的相似度达到82%,这个基因暂被命名为GhPK1。基因全编码区包括1038个核苷酸,编码346个氨基酸的蛋白。GhPK1的编码产物在265~270个氨基酸处有一个跨膜区并可能结合在内质网膜上。GhPK1在种子和纤维中的表达水平较其它组织高。另外,GhPK1的表达量在受到盐胁迫后上升,说明GhPK1可能参与了盐胁迫反应。     

冬凌草HMGS基因的克隆与表达分析

羟甲基戊二酰辅酶A合酶（3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase,HMGS）是甲羟戊酸途径（MVA）中的第一个催化酶。根据冬凌草转录组数据库中HMGS基因序列设计特异引物,采用RT-PCR技术克隆冬凌草IrHMGS基因cDNA全长,并对其序列进行生物信息学分析,通过荧光定量PCR的方法分析其组织表达特性。IrHMGS基因cDNA全长1 382bp,编码460个氨基酸,序列分析结果表明该基因编码的氨基酸序列含有羟甲基戊二酰辅酶A合成酶N末端、C末端等保守结构域。荧光定量PCR表明,IrHMGS在冬凌草组培苗叶和根中的表达量显著高于在组培苗花、茎和愈伤组织中的表达量。本研究为后续深入研究IrHMGS在冬凌草二萜类物质合成途径中的功能奠定了基础。     

两个棉花几丁质酶基因的克隆与表达分析

 从棉花黄萎病缩减杂交库中得到了分属Ⅲ型和Ⅳ型几丁质酶的两个片段,它们都具有完整的3’末端。通过RACE与RT-PCR结合获得了这2个基因完整的读码框序列。其中Ⅳ型几丁质酶的开放读码框为678 bp,编码长为226个氨基酸的蛋白,命名为Ghachi4;Ⅲ型几丁质酶的全长为1390 bp,编码长为298个氨基酸的蛋白,命名为Ghachi3。它们与拟南芥同源基因的相似性分别达到65%和71%。利用网上分析软件发现这2个基因都有信号肽序列,并预测编码的蛋白位于胞质体外。半定量RT PCR发现Ghachi3在花、蕾和韧皮部中的表达量较高,而Ghachi4在韧皮部表达量最高。Ghachi4仅在抗病品种受黄萎病和枯萎病的诱导后表达上调,而Ghachi3还在感病品种中受黄萎病的诱导表达。同时,在常抗棉中2个基因的表达都受到ABA的强烈诱导。推测这2个基因可能参与生物胁迫或非生物胁迫的防御反应。     

甜樱桃(Prunus avium)PaGAST基因的电子克隆及生物信息学分析

为获得甜樱桃PaGAST 基因的cDNA 序列,并预测该基因编码蛋白的结构与功能,以草莓FaGAST1 基因序列为探针,通过基于NCBI数据库中表达序列标签的电子克隆技术对甜樱桃PaGAST 基 因进行克隆。利用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、疏水性和亲水性、信号肽序列、跨膜结构域、亚细胞定位及功能等方面进行分析。结果表明：甜樱桃PaGAST 基因长度为750 bp,开放阅读框长度为324 bp,编码107 个氨基酸,N末端存在信号肽序列,C末端含有保守的GASA结构域。由于PaGAST蛋白中含有的疏水性氨基酸残基较多,该蛋白具有跨膜螺旋区,是一种跨膜蛋白,且有10 个预测的蛋白激酶磷酸化位点。亚细胞定位分析表明,PaGAST蛋白分布在细胞膜外的可能性很大。功能预测显示,PaGAST 基因可能具有响应胁迫应答、信号转导和免疫应答方面的功能。进化分析显示甜樱桃PaGAST蛋白与桃的亲缘关系最近。在一定程度上为甜樱桃PaGAST 基因的克隆及功能鉴定奠定理论基础。     

绿竹咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆与分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（CCoAOMT）是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。采用RT-PCR及RACE方法从绿竹中分离了CCoAOMT家族的一个基因,命名为BoCCoAOMT1（GenBank注册号为EF028662）。BoCCoAOMT1的cDNA全长873bp,含有一个780bp的读码框,编码一个259aa的蛋白,分子量约为29kD。序列分析结果表明,BoCCoAOMT1的编码肽链含有CCoAOMT类基因所有的保守序列元件,与禾本科植物水稻的CCoAOMT类基因有着很高的一致性,达到90.0%。系统进化树分析表明,BoC-CoAOMT1与水稻的CCoAOMT亲缘关系较近。     

橡胶树一个胶乳高表达MDR型ABC转运蛋白的克隆与表达研究

ABC转运蛋白（ATP-Binding Cassette）是目前已知最大、功能最广泛的蛋白家族之一,与植物次生代谢物的排泌、积累及跨膜运转密切相关。本研究筛选已构建的乙烯刺激橡胶树胶乳消减文库,克隆了1个ABC转运蛋白基因EST,通过RACE技术获得其全长cDNA序列,该基因开放阅读框（ORF）共3753 bp,编码1251个氨基酸残基。研究表明其在橡胶树基因组中存在多个拷贝,主要在胶乳中表达,且在乙烯或茉莉酸刺激（刺激产胶）条件下上调表达。推测其可能与橡胶生物合成过程中的物质运输密切相关。