苹果属植物种质多样性的SLAF-seq分析

利用简化基因组测序技术—特异性位点扩增片段测序技术（Specific-locus amplified fragment sequencing,SLAF-seq）对509份苹果属植物种质进行测序,获得586 454个SLAF标签,其中多态性SLAF标签463 612个;经过序列比对,根据完整度 > 0.94、次要等位基因频率（MAF）> 0.05,过滤筛选得到46 460个多态性单核苷酸（SNP）位点;基于这些SNP位点构建苹果属植物不同种的系统发生树并分析主成分。结果表明,通过SLAF-seq技术能够在全基因组范围内快速开发高通量的SNP标记,并直接用于苹果属植物种质资源遗传多样性研究中。34种509份苹果属植物的多样性水平较高（He = 0.318,I = 0.488,Ae = 1.520）,在多于1份试材的种群中,变叶海棠的遗传多样性水平最高,中国苹果的遗传多样性水平最低。综合聚类分析和主成分分析结果表明,供试苹果属植物分为5个基本的类群,Ⅰ山荆子类群,Ⅱ苹果属植物野生种类群,Ⅲ苹果栽培品种类群,Ⅳ以中国苹果、八棱海棠、花红、楸子和海棠花为主的类群,Ⅴ新疆野苹果类群。野生种丽江山荆子、山楂海棠、陇东海棠、变叶海棠、花叶海棠、滇池海棠和沧江海棠聚类比较紧密,栽培种之间的亲缘关系相对较近,栽培品种与东方苹果和森林苹果等野生种聚在一起,新疆野苹果与中国原产苹果属栽培种的亲缘与起源演化关系有待于进一步考究。     

葡萄果粒形状简化基因组关联分析

为了寻找控制葡萄果粒形状的基因位点,本研究中对304个葡萄种质的果形性状了进行简化基因组关联分析。对葡萄种质材料的基因组DNA进行测序,平均测序深度为8.13×,共开发466 618个SLAF标签,其中多态性SLAF标签有392 374个。比对测序分析获得了4 241 729个SNP标记,进一步根据完整度大于0.8以及次要基因型频率大于0.05的标准进行过滤,共得到481 192个SNP。本次检测到的控制葡萄果粒形状的相关位点为首次报道,除基于一般线性模型的SNP rs26137624外,其余检测表型遗传变异贡献率均大于11%。基于一般线性模型和混合线性模型分别关联到7个和3个显著性SNP标记,且均位于2号染色体上。通过筛选每个显著性SNP标记上下游区域,对关联区域进行功能基因挖掘,共得到10个有预测功能注释的基因和7个未知功能的基因。     

基于SLAF-seq技术的不同类型越橘遗传变异和群体结构研究

【目的】利用越橘属栽培品种及野生资源在全基因组范围内筛选差异SNP分子标记，分析其遗传变异，了解不同类型群体间的遗传变异、基因交流、群体结构，为越橘种质创新提供遗传背景依据。【方法】以越橘属9个种的62份种质资源为材料，利用特异性位点扩增片段测序技术(SLAF-seq)获得的基因组SNP标记比对到品种Draper参考基因组上，进行供试材料遗传研究。【结果】测序获得169.87 Mb reads数据，平均Q₃₀值94.99%，包含172 513个多态性SLAF标签，筛选到高质量SNP标记4 133 595个，均匀分布在越橘12条染色体上。基于SNP标记的系统进化树准确反映了供试野生、北高丛和南高丛类群遗传差异以及品种间系谱遗传关系，反映出野生类型与栽培品种遗传差异显著，供试野生种具有独立的遗传背景且种间无基因交流发生，但野生种到栽培种存在单向的基因流；栽培品种类群存在明显的亚群结构，亚群间存在普遍的基因交流；半高丛品种北陆和南高丛品种军号与北高丛类型紧密聚类，矮丛品种美登、半高丛品种北村、黑珍珠遗传背景倾向于野生种。【结论】栽培品种近亲杂交和骨干亲本高频率使用导致品...     

基于表型性状及SNP标记的豆瓣菜种质资源遗传多样性分析

对保存在国家种质武汉水生蔬菜资源圃内来自国内外不同地区的19份豆瓣菜种质资源的8个农艺性状进行调查分析,并利用SLAF-seq技术对豆瓣菜种质资源进行简化基因组测序,研究其遗传多样性。结果表明:质量性状(叶色、茎色、顶端小叶形状)变异不明显;数量性状(顶端小叶长、顶端小叶宽、株高、茎粗、叶柄长)变异系数较低(7.69%～16.45%),说明数量性状的变异范围较窄,但仍存在具有优良性状的资源,如仰光-2豆瓣菜、大庙场野生豆瓣菜和玉龙雪山豆瓣菜,可用于品种选育。利用SLAF-seq测序技术进行测序,共获得49.21 Mb的读长数据,355?141个高质量的SLAF标签,33?386个多态性SLAF标签,从33?386个多态性SLAF标签上共开发获得102?704个高质量SNP标记。基于豆瓣菜资源8个表型性状的聚类分析,将19份豆瓣菜种质资源划分为2类,与基于SNP的聚类分析结果相类似,群体结构分析以及PCA分析均将19份资源全部分为一组,说明19份资源虽然表型上存在变异,但遗传基础狭窄,遗传多样性不高。地方品种和野生资源的遗传多样性指数π值分别为0.012?1和0.012?2,且地方品种和野生资源之间的遗传分化指数Fst为0.030?2,群体间遗传分化较小,表明豆瓣菜地方品种与野生资源属于同一组。结果说明在我国野外地区发现的大面积疑似野生豆瓣菜可能不是野生资源,而是由栽培品种逃逸形成,所有资源很可能来源于同一个栽培类型。     

基于SLAF-seq技术开发芋肉纤维颜色性状的分子标记

紫色的芋肉纤维因其潜在的保健功能而深受市场欢迎,被认为是重要的品质性状。本试验以芋肉纤维紫色的荔浦芋为母本,以芋肉纤维黄色的乐平野芋为父本构建F_2分离群体,利用特异长度扩增片段测序(specific length amplified fragment sequencing,SLAF-seq)技术结合集群分离分析法(bulked segregant analysis,BSA),开发与芋肉纤维颜色连锁的分子标记。结果表明:通过SLAF-seq技术共获得有效reads为37.65 Mb,开发出293?363个高质量的SLAF标签,获得SNP位点57?710个。利用SNP-index进行关联区域内2个亲本之间的SNP分析,获得了27个与芋肉纤维颜色性状紧密关联的SNP位点。设计特异引物进行等位特异性PCR(allele specific PCR,AS-PCR)验证SNP位点的多态性,其中Marker44764能对芋肉纤维颜色进行有效的基因分型。本试验建立了一套快捷简便的芋的基因分型方法,可用来对材料进行苗期的分子标记辅助选择,进而提高芋育种效率。     

基于SSR标记的100份葡萄资源亲缘关系和群体遗传结构分析

【目的】通过表型性状鉴定分析,从山西太谷国家葡萄种质资源圃内保存的资源中,筛选出不同葡萄种质资源进行SSR分析,揭示这些不同来源的葡萄种质资源之间的亲缘关系和群体遗传结构,为葡萄种质资源的科学管理和分子标记辅助育种提供参考。【方法】以100份葡萄种质为材料,依据基因组DNA测序挖掘出的SSR引物数据,筛选出33对多态性核心引物,根据标准分子质量记录扩增DNA多态性条带,获得数据矩阵。利用每对SSR引物在100份葡萄种质资源中的等位基因组成,计算33对SSR引物的位点多态性信息含量(PIC)、100份葡萄种质资源个体间的Nei’s遗传距离,并利用MEGA 7.0软件构建NJ邻接聚类树,推断葡萄原始集合与核心集合的遗传结构。【结果】100个样本中的33对SSR标记共检测到423个等位基因,每对引物扩增条带数4～26条,平均扩增条带数为12.82条。葡萄种质资源之间的Nei’s遗传距离为0.4～0.8,占资源总量的97.80%。通过遗传结构分析并预测其最佳分组数K为2,即葡萄核心集合主要分为2个亚群,分别为欧亚种群的鲜食葡萄和杂种群,其中杂种群涵盖了欧美杂种、美洲种、中国野生种及欧亚种的酿酒品种。来自国外的美洲种的砧木和来自山西的野葡萄聚在一起,同时与欧美杂种和酿酒品种也聚为一类。可能是由于人为选种和选用目的的不同造成各品种之间遗传背景的混杂。这一结论还需进一步研究证明。【结论】33对引物将100份葡萄分为两个集群,第一集群主要为葡萄亚种鲜食葡萄品种,第二集群主要包含了欧亚种酿酒品种、欧美杂种、美洲种、中国野生种4个亚种群。     

基于SNP和InDel标记的余甘子群体遗传分析

【目的】采用高通量测序技术解析余甘子种质资源的群体遗传结构和遗传多样性，为余甘子系统分类、遗传资源创新利用提供理论基础。【方法】利用ddRADseq技术对112份余甘子种质资源进行高通量简化基因组测序，利用Cutadapt和Trimmomatic软件对原始数据进行过滤，筛选得到高质量测序数据；使用MUNEAK软件进行多态性标记发掘，基于获得的SNP和InDel标记，进行群体结构分析、主成分分析、系统发育分析及遗传多样性分析。【结果】余甘子测序样品共获得8934个SNP和InDel标记，群体结构分析将余甘子种质分为2个类群，类群划分与种质来源地相关，该结果与主成分分析和系统发育分析相一致。余甘子各种质间遗传距离为0.027～0.459，平均遗传距离为0.248；云南地区的余甘子种质的期望杂合度、观测杂合度及多态性信息含量值最高，依次为0.267、0.184及0.218；余甘子群体间的Fst在0.080～0.266之间，群体遗传分化程度中等偏高。【结论】该测序技术可有效地解析余甘子种质的群体结构和遗传多样性，为余甘子种质资源的鉴定评价、系统分类及遗传多样性研究提供参考。     

利用PCR产物混池重测序检测梨褐皮关联SLAF标签多态性

在已知梨褐皮关联的SLAF标签（Marker286117）序列上存在4个SNP位点,共有4个基因型（a～d）的基础上,使用PCR加混池重测序技术鉴定该SLAF标签在64个梨品种中的多态性。共获得7.1 Gb原始数据,通过编译的SNP-rseq和Calculate程序对数据进行处理,64个梨样品获得的平均read数量为117 642条,满足分析需求。在该SLAF标签上新发现2个基因型（e和f）。6个基因型中c为原始类型,在栽培种砂梨和白梨中鉴定到b、d和e基因型;a和f基因型则出现在拥有西方梨血统的样品中。对基因型和表型统计后发现,c基因型存在时,梨果皮为褐色,不含c基因型时为绿色。该规律不仅适用于东方梨,在西方梨的一些样品中也适用。混池重测序技术降低了测序成本,相关技术手段能够应用于简化重测序后续的验证和标记辅助育种。     

基于super-BSA技术开发甜瓜含糖量和酸度性状的功能性分子标记

为达到选育甜酸味品系、缩短育种周期、提高选择准确率的目的,本研究基于简化基因组测序(SLAF-seq)的选择性基因型鉴定和集群分离分析(Super-BAS),结合生物信息学方法,以‘风味4号’甜瓜F2群体甜味、酸味、不甜不酸3个极端表型群体为试验材料,精细定位甜瓜含糖量、酸度性状相关基因并开发功能性标记。结果显示:(1)将甜瓜含糖量、酸度性状定位在双亲基因组;(2)获得1个含糖量性状相关候选基因,3个酸度性状相关候选基因;(3)针对候选基因开发出1个含糖量性状相关基因功能性分子标记SLAF18745-S01和3个酸度性状相关基因功能性分子标记SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和SLAF31212-S04。本研究开发的功能性分子标记为甜瓜品质性状基因的分子标记辅助选择提供了重要的标记基础。     

中国葡萄属野生种抗旱基因的分子标记及遗传分析

以葡萄属种间杂交组合燕山葡萄×河岸葡萄的F_1代群体为试材,采用BSA法构建抗旱植株DNA混合样,从300个随机引物中初步筛选出7个可以扩增出多态性DNA的随机引物,用于对供试材料扩增分析,获得了与中国葡萄属野生种抗旱基因连锁的RAPD标记S226-1100、S271-550、S1165-1500、S264- 1300、S195-1000、S1345-1400和S513-1700。并将7个RAPD标记在中国葡萄属野生种、欧洲葡萄、美洲种的冬葡萄和沙地葡萄等18个株系或品种中做了进一步分析。对与目标性状连锁较紧密的RAPD标记S226- 1100进行了克隆测序,转化成专一性的SCAR标记DR-760。经JoinMap 3.0软件分析表明,RAPD标记S226-1100、S271-550、S1165-1500与目标基因位点处于同一个连锁群上,其中以S226-1100与目标基因位点距离较近,为21.8cM。     

利用胚挽救与分子标记选育葡萄无核抗寒新种质

以种子败育型无核葡萄为母本,中国抗寒野生种或者欧山杂交的品种为父本,通过人工大田杂交后利用胚挽救技术和分子标记选育无核抗寒葡萄新种质.在配置的14个杂交组合中,共获得杂种1021株,其中'红宝石无核'×'北冰红'成苗率最高(18.13％),获得634株.以'左优红'为父本时,'火焰无核'适宜作母本;'北冰红'和'雪兰红...     

基于基因组结构变异构建萝卜种质资源分子身份证

萝卜种质资源类型多样,难以通过表型评价判定其亲缘关系.本试验整合4份萝卜全基因组重测序数据和520份萝卜简化基因组测序数据进行生物信息学分析,鉴定了萝卜群体基因组水平的结构变异,开发了24个通用性的分子标记.使用上述标记对255份萝卜种质进行基因分型,构建了相应的萝卜分子身份证.聚类分析结果表明,在相关系数0.55处可...     

我国新育成葡萄品种SSR指纹图谱的建立

【目的】建立我国近年来新育成葡萄品种的指纹图谱,明确他们之间的亲缘关系。【方法】收集了国内新育成的24个葡萄品种,采用6对国际通用的SSR荧光标记引物对其进行扩增,通过毛细管电泳进行基因分型。【结果】这6个标记不仅可以明确的区分每一个供试品种,而且能很好鉴定葡萄品种的倍性,同时这些标记也可以用于品种间亲缘关系的鉴定,区分不同亲本、不同种群及不同亚属的葡萄品种。【结论】该SSR指纹图谱的建立可以完善我国葡萄品种数据库,为品种鉴定、植物品种权保护及亲缘关系分析提供很好的参考依据。     

分子标记在葡萄遗传育种研究中的应用

分子标记是随着分子生物学技术的发展出现的一类重要的遗传标记,近年来发展迅速。分子标记技术是研究葡萄起源和新品种选育的重要工具,目前已在葡萄遗传育种等方面的研究中得到广泛应用。该文综述了近年来分子标记在葡萄种质资源鉴定、分子遗传图谱构建以及分子标记辅助育种等方面的应用,评述了分子标记在葡萄遗传育种等方面的应用前景以及目前存在的问题,以期为优质葡萄种质资源的挖掘和分子标记辅助育种提供一定的理论依据。     

西瓜果实形状的分子精准鉴定

为了实现西瓜果实形状的分子精准鉴定,利用"国家西瓜甜瓜中期库"的资源和高通量测序平台,利用两个不同的杂交分离群体(F_2和BC_1P_1)分别鉴定到1个159 bp插入缺失和1个非同义SNP导致的果形突变(由圆果形变为长果形),且SNP突变在159 bp插入缺失的基因组区域内。利用这个SNP开发CAPS标记Markersun在两个群体和128份西瓜种质中进行分析,发现标记Markersun在两个群体中与果形表型共分离;在西瓜种质中可同时区分插入缺失和SNP的变异,且与果形表型共分离。同时这两个变异与果形的共分离在196份西瓜核心种质的基因型分型中也得到验证。此外,通过对不同类型西瓜种质的基因型分析发现,SNP变异导致的长果形出现的时间更早且独立遗传,而159 bp插入缺失引起的长果形是栽培西瓜驯化过程中产生的。本研究中首次利用不同类型的西瓜核心种质实现了西瓜果形的分子精准鉴定,还挖掘到两个西瓜果形的功能变异并开发标记,为西瓜果形的分子精准鉴定提供技术支撑,同时为果形性状基因功能验证提供靶标,加速了西瓜果形性状基因的调控机理研究。     

番茄粉红色果实相关基因的dCAPS和InDel标记开发与应用

采用SuperBSA方法分别构建100份粉红色番茄材料和100份红色番茄材料的DNA混合池,对测序结果的SNP位点进行分析。结果表明:在1号染色体上的127个SNP位点中,有6个与番茄果实颜色高度相关,其中1个位点与粉红色果实高度相关。利用该SNP位点开发了1个共显性d CAPS标记,在红色、粉红色和杂合F_13种基因型之间的多态性较好。同时,利用番茄重测序数据分析番茄起源时发现,在粉红色番茄中SIMYB12基因的上游存在1个603bp的缺失,利用该缺失突变位点开发了1个共显性In Del标记,在红色、粉红色和杂合F_13种基因型之间也表现出较好的多态性。利用新开发的2个标记对F_2群体进行遗传分析,鉴定结果与田间表型观察结果符合度均达到95%以上,表明这2个标记可以用于番茄苗期分子标记辅助选择。     

基于SSR技术对七十五份栽培葡萄品种的鉴定研究

以75份葡萄栽培品种为试材,采用SSR分子标记技术,研究建立一套适合于葡萄DNA指纹图库构建的技术体系,为葡萄种质资源的鉴定和亲缘关系分析提供依据。结果表明:选用19对核心引物,共扩增出89个多态性位点,利用DPS软件,对其进行聚类分析,75份葡萄种质的遗传相似系数在0.028 3~0.887 3,平均遗传相似系数为0.475 39。依据用途,初步分为鲜食葡萄和酿酒葡萄两大类,并根据品种来源,大致分为了欧美杂种、美洲杂种和欧亚种。     

刺葡萄ISSR分子标记体系的建立及种质资源聚类分析

【目的】建立刺葡萄(Vitis davidii Fo?x.)的ISSR分子标记体系以及分析刺葡萄种质资源的亲缘关系,为刺葡萄的保护和利用提供依据。【方法】以8份外缘葡萄品种或类型为对照,52份刺葡萄类型为材料,采用改良CTAB法提取植物基因组DNA,以基因组DNA为模板,用同一试验考察多个因素及水平的筛选方式对ISSR-PCR扩增反应体系中的Mg2+、d NTPs、引物、模板DNA的浓度及循环数进行优化,建立适用于刺葡萄的最佳ISSR-PCR反应体系;在优化的反应体系中进行多态性引物的筛选并进行分析,同时根据Jaccard遗传相似系数进行UPGMA聚类分析。【结果】采取改良CTAB法提取的刺葡萄DNA质量优于常规的CTAB法,在优化的ISSR-PCR反应体系中,从100条ISSR引物筛选出了13个具有多态性的引物,共检测到139个位点,其中多态性位点116个,多态位点百分率为83.45%。聚类结果显示,对照组8份外缘资源均在刺葡萄种群外,刺葡萄与华东葡萄的遗传距离较腺枝葡萄近;52份刺葡萄类型分为三大组群,两大江西刺葡萄组群及湖南与福建刺葡萄组群,而在湖南与福建刺葡萄种群中又分为4个群组。【结论】刺葡萄种质资源具有丰富的遗传多样性,ISSR分子标记可有效揭示刺葡萄种质资源的遗传多样性和亲缘关系,对刺葡萄种质资源的保护和利用有重要的意义。     

葡萄砧木品种的SSR分析

【目的】分析葡萄砧木品种遗传多样性。【方法】利用17对SSR引物对21个葡萄砧木品种、3个欧亚种酿酒葡萄品种进行扩增。【结果】共获得195个等位基因,片段大小为87 bp(VVIV52)~265 bp(Vrzag79),观测杂合度(Ho)为0.46~0.96,期望杂合度(He)为0.57~0.94,Shannon多样性指数(I)为1.10~2.62,多态性百分率为100%,所选引物的遗传多态性高,适宜用作葡萄砧木品种的遗传多样性分析。在单个引物鉴定品种方面,VVMD5效率最高,可鉴定19个品种;VVS3和UDV-058效率最低,仅能鉴别2个品种。选择2对引物组合可以大大提高鉴定效率,选择VVMD5&VVS4等组合可将全部供试种质资源鉴定出来,鉴定效率达100%,体现了SSR标记在品种鉴定上的高效性。对扩增结果进行聚类分析,在遗传相似系数0.74处,欧亚种酿酒葡萄与砧木品种各自聚为一类,且亲缘关系较近的砧木品种聚在一起,聚类结果符合砧木品种选育时的亲缘关系。【结论】利用SSR分子标记能有效地鉴定葡萄砧木品种和进行遗传多样性分析。     

基于SRAP分子标记的桂花品种亲缘关系研究

 利用相关序列扩增多态性( SRAP) 分子标记, 以柊树[Osmanthus heterophyllus ( G. Don. )P. S. Green ] 和华东木犀(Osmanthus cooperi Hemsl. ) 为对照种, 研究了桂花(Osmanthus fragrans Lour. )88个品种、1个野生种的亲缘关系, 18对SRAP引物共获得296个位点, 其中248个为多态性位点, 多态性比率达83.78%。平均每对引物组合产生16.4个位点和13.8个多态性位点。其中, 银桂品种群的Shanon信息指数( 0.3412) 和遗传多样性指数( 0.2191) 最高。遗传变异估算表明: 桂花遗传分化系数为52.95% , 大部分变异存在于品种群之间, 说明品种群体间遗传分化高。聚类分析结果表明, 以遗传相似系数0.762为截值, 可将91份种质分成6类; 各品种群的品种往往聚在一起; 四季桂品种群与其他品种群遗传距离较远; 色质较深的金桂往往与丹桂品种群的多个品种聚在一起。基于SRAP分子标记的聚类结果与基于形态的传统分类学的结果基本相符。