一个苹果山梨醇转运子基因家族新成员的克隆及其表达分析

【目的】克隆一个苹果山梨醇转运子基因(命名为ST)的全长cDNA,为进一步研究该基因的功能奠定基础。【方法】利用RT-PCR法从苹果叶片中克隆ST基因,应用相关软件对其进行生物信息学分析;并采用实时荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)法,分析ST在苹果不同组织中以及在果实发育过程中的表达情况。【结果】获得了1个包含全长开放阅读框的ST基因,该基因cDNA全长1 767 bp,包含长达1 617 bp的完整开放阅读框,该基因所编码的蛋白与GenBank中已登录的其他植物山梨醇转运子的同源性均在72%以上,其中与苹果山梨醇转运子MdSOT5的同源性较高,为81%。Real-time RT-PCR结果表明,在不同组织中,ST在韧皮部的相对表达量最高,其次在衰老叶、成熟叶、叶柄中较高,在库器官花、幼叶、果实、果柄、根中表达较低;在果实不同发育时期,ST基因表达量在果实发育早期很低,花后30 d快速升高并达到峰值,在发育中期保持一个较高的表达水平,在果实发育后期相对表达量又降低,之后略呈递增趋势。【结论】从苹果叶片中克隆了ST基因,生物信息学分析可知ST具有糖转运功能;ST在韧皮部的表达量最高,说明其负责长距离运输;ST在果实发育过程中的表达量与山梨醇的含量变化相一致。     

大叶补血草Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1核心片段的克隆及序列分析

根据GenBank中已登陆植物的Na+/H+逆向转运蛋白基因的保守序列设计简并引物,以盐生植物大叶补血草总RNA为模板,通过RT-PCR方法得到长为983 bp的片段,将其克隆到pGM-T载体上,经PCR和酶切鉴定筛选得到阳性克隆,并进行测序.通过DNAMAN软件对该序列进行同源性比对,结果表明,本研究所克隆的基因片段编码的氨基酸序列与拟南芥、小麦、滨藜、番杏、冰叶日中花的Na+/H+逆向转运蛋白同源性很高,其同源性分别为80.06%、72.00%、82.07%、82.37%和82.37%,表明该序列确属Na+/H+逆转运蛋白基因的部分片段,同时也说明Na+/H+逆向转运蛋白基因在植物中高度保守.     

法氏囊炎病毒VP2基因高变区片段的克隆与鉴定

[目的]研究法氏囊病毒VP2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点。[方法]以接种传染性法氏囊病毒(IBDV)的鸡胚尿囊液为模板,根据Genbank中登录的IBDV的VP2蛋白基因的全序列设计引物,通过RT-PCR扩增获得VP2高变区部分片段,将其克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1中,经酶切鉴定后,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)BL21,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增获得一个504bp的扩增片段,序列分析结果表明它与GenBank中登录的IBDV的VP2蛋白基因的核苷酸序列同源性达99.8%,其氨基酸序列的同源性为99.4%,说明各毒株间高变区基因序列保守性很高。[结论]法氏囊炎病毒毒株在两个大小亲水区内的氨基酸都非常保守。     

地衣芽孢杆菌BL03脂肪酶基因LIP的克隆及序列分析

[目的]克隆地衣芽孢杆菌BL03的脂肪酶基因LIP并对其序列进行分析。[方法]以地衣芽孢杆菌BL03基因组核酸为模板,PCR扩增得到地衣芽孢杆菌脂肪酶基因,用pMD19-T载体克隆后进行PCR鉴定及序列测定和生物信息学分析。[结果]测序结果表明该片段完整开放阅读框大小为615 bp,与已发表的地衣芽孢杆菌LTP基因(GeneID:3098655)相比,核酸序列相似为99.67%;推导编码氨基酸序列相似性为99.02%。[结论]该基因的获得为其异源表达及相关研究奠定了基础。     

新疆野生盘羊TLR9基因的克隆·序列分析及其编码氨基酸结构预测(英文)

[目的]克隆鉴定新疆天山亚种野生盘羊Toll样受体9(TLR9)基因,预测其结构与功能,并对序列进行分析。[方法]以外周血液的总DNA为模板,运用PCR方法分3段克隆了新疆野生盘羊TLR9基因,PCR产物经凝胶回收纯化后测序,并运用分子生物学软件将测序结果进行分析及结构预测。[结果]克隆得到的新疆野生盘羊TLR9基因大小是3192bp,含1个完整的开放阅读框(ORF),共编码1064个氨基酸,其氨基酸组成中亮氨酸的含量高达18.51%,含有30个氨基酸的信号肽序列;在野生盘羊TLR9蛋白455～475、740～760和780～800位氨基酸有3个跨膜区;新疆野生盘羊TLR9蛋白的3D结构是由胞外段富含亮氨酸的重复序列(LRR)和胞内段TIL(Toll/ILIR)结构域构成的。[结论]上述结构特征为TLR9发挥生物学功能奠定了基础,同时也为进一步研究新疆野生盘羊TLR9基因提供了理论依据。     

ETR1靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析

[目的]构建拟南芥乙烯受体(ETR1)特异性短发夹环RNA(shRNA)真核表达载体。[方法]从ETR1基因cDNA序列上选取目标序列,设计2对引物,经PCR扩增得到正反向2个DNA片段(S5I和AI),构建含有该正反向互补重复序列DNA片段的中间载体,测序分析正确后再克隆到植物表达载体pCAMBIA1301中的Gus位置并经双酶切证实。[结果]ETR1基因S5I和AI片段被成功克隆进质粒pCAM-BIA1301中,酶切鉴定及测序分析显示,重组质粒shRNA编码序列与设计片段的序列完全一致。[结论]ETR1靶向RNA干扰重组体的成功构建,为进一步获得拟南芥乙烯受体基因的功能缺失突变体奠定良好基础。     

元宝枫CHS基因片段的克隆及序列分析（英文）

[目的]对元宝枫叶片查尔酮合成酶(CHS)基因片段进行克隆及序列分析。[方法]以元宝枫的红叶新品系1~6号为试材,采用CTAB法提取其夏季与秋季叶片总RNA,搜索Gen Bank数据库中已报道的CHS基因序列,BLAST比对,然后用DNAMAN、Primerpremier5软件设计兼并引物来扩增其目的片段,采用RT-PCR方法扩增CHS基因片段并连接到p MD18-T载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。[结果]得到一段1 365 bp的序列,序列分析表明,该片段编码365个氨基酸,与鸡爪槭、毛果槭的查尔酮合成酶(CHS)基因核苷酸序列同源性在90%以上。[结论]该研究首次从元宝枫中克隆出了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

向日葵BADH基因部分序列的克隆与分析

[目的]为进一步利用向日葵BADH基因提供理论和实践依据。[方法]以电子克隆技术为基础,通过RT-PCR获取向日葵BADH基因的部分序列,并进行测序。[结果]通过RT-PCR获得了一段基因序列。该PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳呈现出一条长为1584bp左右的特异性条带,与预期设计的1581 bp的扩增片段相符;与电子克隆得到的相应序列比对结果表明,两者一致性高达99.22%。其编码蛋白含有与酶功能密切相关的保守氨基酸序列,与其他物种的BADH具有较高的一致性。[结论]成功克隆了向日葵BADH基因的部分序列。     

矮牵牛花特异表达启动子PchsA的克隆及蓝色基因F3′5′H表达载体的构建

[目的]克隆花特异表达启动子PchsA,将此启动子与蓝色基因“F3′5′H”构建新的表达载体,拟以该启动子驱动“F3′5′H”在其他花色中特异表达。[方法]根据GenBank报道的矮牵牛启动子的序列设计并合成一对特异引物,以蓝紫色矮牵牛总DNA为模板,用PCR仪扩增目的片段。[结果]PCR扩增出的启动子DNA片段长约550bp,回收后连接到PGM-T质粒载体上,经转化、筛选确定重组子,酶切鉴定后送上海生工生物工程公司测序,得到片段长度为553bp。经DNAMAN软件分析和GenBank上BLAST序列比对,显示序列与已报道序列同源性为98．55％。应用pcgene软件进行序列分析,结果表明试验克隆的启动子含有启动子所必须的所有调控元件,这与报道的序列基本一致。[结论]试验成功地克隆了CHSA启动子并将其与“F3′5′H”构建成能够在植物中进行道传转化的表达载体,为培育新型花色新品种奠定了基础。     

侧金盏花CBF转录激活因子基因片段的克隆

[目的]探索CBF转录激活因子基因在侧金盏花中是否存在。[方法]以侧金盏花基因组DNA为模板,根据拟南芥CBF基因序列的保守区设计1对特异性引物,通过PCR扩增获得1个DNA片段,将其克隆到pUCm-T载体中,转化大肠杆菌TG1,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]测序结果显示通过PCR扩增获得的基因片段长448 bp。在GenBank中检索,该序列与从拟南芥和其他作物中克隆的CBF同源基因序列同源性较低,说明是一个新的基因片段,初步认定该片段是侧金盏花CBF基因片段。[结论]该研究为进一步克隆侧金盏花CBF转录激活因子基因全长序列、鉴定其生物学意义奠定了基础。     

燕麦Actin基因片段的克隆及序列分析

【目的】克隆与分析燕麦肌动蛋白基因片段.【方法】根据其他植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以燕麦叶片总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到PUCm-T载体,进而转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞.阳性克隆经PCR鉴定后进行测序.【结果】扩增片段长678bp,共编码225个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的Actin基因序列的同源性均在85%以上,与其他肌动蛋白的氨基酸序列的同源性达93%以上.【结论】系统进化分析表明,扩增到的燕麦肌动蛋白基因与羊草、长穗偃麦草和黑麦草等植物的肌动蛋白基因亲缘关系最为密切.     

山西省马铃薯Y病毒cp基因的克隆

[目的]对山西省马铃薯Y病毒cp基因进行克隆与序列特征分析。[方法]依据马铃薯Y病毒基因组序列,设计合成了一对引物PVYP1和PVYP2,以从山西省获得的带毒马铃薯叶片总RNA为模板,对RT-PCR扩增得到的基因片段进行序列测定。[结果]该DNA片段1～798bp为马铃薯Y病毒印基因,799～1064bp为3’非编码区序列,可编码265个氨基酸。将RT—PCR产物与载体连接后转入大肠杆菌提取阳性克隆的质粒DNA,酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,重组质粒已转入大肠杆菌。BLAST软件分析表明,山西省马铃薯Y病毒分离物CP氨基酸序列与已公布的PVY CP氨基酸序列相似性最高可达100％,说明所得DNA片段确为PVY cp基因片段。[结论]该研究为对山西省马铃薯Y病毒的防治提供理论依据。     

甜菜夜蛾核多角体病毒Se62基因的克隆与结构分析

[目的]克隆并分析甜菜夜蛾核多角体病毒（却odoptera exigua muhicapsid nucleopolyhedrovirus,SeMNPV）ORF62全长基因（Se62）。[方法l采用PCR的方法扩增Se62基因,将其克隆至pMDl8．T载体上,获得了重组质粒T．5e62,进行序列测定和分析。[结果]获得大小为1128bp左右的序列,扩增序列与GenBank登录序列（No．NC_002169）核苷酸同源性100％。序列分析表明,Se62基因编码蛋白（SE62）存在明显的跨膜区域,有多个蛋白激酶c、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N．糖基化位点。蛋白序列比对结果表明,SE62属于杆状病毒P48蛋白超级家族成员,与苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa califorica muhicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）P48蛋白的同源性为52％,其在病毒复制中的作用值得关注。[结论]成功克隆出Se62基因,为研究其在病毒复制中的功能奠定了基础。     

编码L-苏氨酸-O-3-磷酸盐脱羧酶基因的克隆和解析

[目的]为探索维生素B12生物合成的限速步骤奠定基础。[方法]提取费氏丙酸杆菌染色体DNA,利用Cassette和Cassette Primer的LA PCR技术克隆cobD的上游基因。将扩增的目的基因片段克隆至pGEM-T Easy Vector上,经PstⅠ酶切鉴定后对阳性克隆质粒进行测序,并应用Blast对所得碱基序列进行解析。[结果]经LA PCR扩增获得全长为1 085 bp的目的基因。经PstⅠ酶切鉴定,cobD基因成功克隆到pGEM-T Easy Vector上。测序结果表明,所得的基因为编码L-苏氨酸-O-3-磷酸盐脱羧酶的基因,与GenBank中cobD基因编码的氨基酸序列同源性为100%。[结论]在厌氧条件下,费氏丙酸杆菌具有与鼠伤寒沙门氏菌相似的合成途径。     

大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体的构建

[目的]构建大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体。[方法]利用PCR方法从大豆疫霉菌cDNA中扩增多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因。用限制性内切酶EcoRI和Not1分别酶切此基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K,然后用T4连接酶将目的基因克隆到pPIC9K载体中构建此载体。[结果]扩增的大豆疫霉菌pspgl基因成熟肽片段大小为1250bp。用基因特异性g}物扩增阳性重组子,可得到大小为1200bp的片段。而用载体特异性引物扩增阳性重组子,可得到大小为1200和1700bp两条带,多出来的400bp恰好符合载体部分的大小。将此特异性片段PCR扩增回收,序列测定发现大豆疫霉pspg1基因已经成功地插入到表达载体中。[结论]该研究为进一步研究大豆疫霉菌pspg1基因在毕赤酵母中高效表达奠定了基础。     

编码结构域Tt APuX25基因片段的分离与克隆

[目的]将Tt apux25基因片段克隆到表达载体pET21a(t)中。[方法]以热产硫化氢高温厌氧杆菌菌液为模板,根据编码结构域Tt APuX25的基因片段Tt apux25设计1对特异引物进行PCR扩增。将Tt apux25克隆到表达载体pET21a(+)中,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增获得一个250～500bp的扩增片段。对获得的阳性克隆进行筛选和测序鉴定,发现所得阳性克隆为表达载体pET21a(+)中插入有序列正确的Tt apux25片段。阳性克隆中的重组质粒被命名为pEX25,并将其转化进表达宿主菌大肠杆菌Tuner感受态细胞中。[结论]该方法直接将Tt apux25基因片段克隆到表达载体pET21a(+)中,操作简便并取得了较好的效果。     

AtDREB2B基因的克隆及植物表达载体的构建

[目的]获得耐旱转录因子的植物表达载体,进而转化植物获得耐旱性提高的新植物株系。[方法]提取脱水处理的拟南芥总RNA,利用AtDREB2B特异引物通过RT-PCR扩增出1.2kb片段,并将其克隆至pBS-T上,测序。[结果]序列分析表明,该克隆序列与GenBank上登录AtDREB2B基因序列的一致性为100%。进一步通过片段的亚克隆,将其构建至植物表达载体pCAMBIA1301和pBin438上,分别由rd29A启动子和重复35S启动子调控基因表达。[结论]成功构建了2种AtDREB2B的植物表达载体,并通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101,为农杆菌介导的AtDREB2B基因对植物的遗传转化奠定基础。     

大豆查尔酮异构酶基因的克隆及乳酸菌表达载体的构建（摘要）

[目的]将特异存在于豆科植物的Ⅱ型查尔酮异构酶基因CHI1A构建到目前最有效的食品级乳酸乳球菌NICE诱导表达系统中。[方法]利用RT-PCR技术从大豆总RNA中克隆CHI1A基因,连入pMD18-T克隆载体中并进行测序,然后重组到乳酸乳球菌表达载体PNZ8149-CHI1A,利用电穿孔方法转入乳酸乳球菌NZ3900中。[结果]克隆得到CHI1A完整开放阅读框670bp,与已报逍的大豆查尔酮异构酶基因的核苷酸序列（GenBank AY595413）的同源性达到99%;通过PCR和酶切鉴定,成功地将CHI1A导入到NICE表达系统中。[结论]含有CHI1A基因的乳酸乳球菌高效诱导表达载体的构建为利用微生物发酵产生类黄酮奠定基础。     

鸡新城疫病毒HN基因片段的原核表达及其单抗制备

[目的]研究NDV-HN蛋白抗原表位在动物免疫应答中的作用特点。[方法]根据HN基因和载体pGEX-4T-1的多克隆位点自行设计1对引物,以该实验室保存的重组质粒为模板,进行PCR扩增,再将其所得片段定向插入pGEX-4T-1,构建重组质粒,并对该重组质粒进行鉴定;再将构建的重组质粒在大肠杆菌中表达;最后,鉴定了相应单克隆抗体。[结果]PCR结果表明,得到了与预期结果一致的长度为850 bp的片段;重组质粒鉴定结果表明,成功构建了包含目的基因片段的重组表达质粒pGEX-4T-HN23;重组质粒经原核表达获得大小为57 kD的融合蛋白,免疫Balb/c小鼠试验表明,用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经ELISA筛选和3次亚克隆获得2株稳定传代（可传20代以上）和分泌抗NDV-HN抗体的杂交瘤细胞株。[结论]获得的鸡新城疫病毒HN单克隆抗体,为进一步研究HN在致病过程的作用及特异性诊断提供了重要试验材料。