百脉根结瘤信号通道蛋白NSP1和NSP2的相互作用

豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,对其根瘤菌共生信号转导途径和作用机制的研究,有助于揭示根瘤菌与豆科植物共生关系建立和共生体形成的奥秘.本研究利用酵母双杂交系统和体外蛋白质相互作用技术,证明百脉根GARS类家族转录因子结瘤信号通道蛋白NSPI和NSP2在体外体内均可以相互作用,并将相互作用的位点定位在NSPl的GRAS结构域的LHRⅡ区域和NSP2的LHRI区内.     

豆科植物结瘤固氮及其分子调控机制的研究进展

作为人类重要的蛋白质和脂肪来源,以花生、大豆为代表的豆科植物是世界范围内农业生态系统的重要组成部分,而氮肥的合理施用是保证其稳产增产的主要因素.豆科植物能够通过与根瘤菌形成共生关系结瘤固氮,从而可以减少氮肥使用量.豆科植物的结瘤过程受到信号传递系统的调控.其中,硝酸盐信号作为信号分子来调控包括豆科植物结瘤自主调控和氮代...     

百脉根小GTPase激活蛋白的鉴定及突变体分离

以豆科植物百脉根为材料,利用蛋白质相互作用技术、基因表达分析和突变体表型观察研究了小GTPase激活蛋白RacGAP1和RacGAP3在侧根及根瘤发育中的功能。结果表明:百脉根小GTPase激活蛋白RacGAP1和RacGAP3能与ROP6~(CA)相互作用,RacGAP1和RacGAP3基因主要在根微管组织中表达,在接种根瘤菌后呈下调表达趋势。RacGAP1在侧根及根瘤原基中无表达;RacGAP3则能在侧根及根瘤基部表达。RacGAP1和RacGAP3的LORE1插入突变体表型观察显示,纯合突变体与Gifu野生型共生表型无明显差异,但RacGAP1突变体植株开花后,花朵枯萎掉落不结荚,而杂合体与野生型无差异,表明RacGAP1可能参与调控花粉发育过程,而RacGAP3在早期共生过程中可能起负调控作用。     

CRISPR/Cas9在豆科植物毛根转化中的应用及共生基因的编辑

将CRISPR/Cas9系统与毛根转化相结合,在豆科植物百脉根和大豆中对结瘤因子受体激酶基因NFR1进行多靶点敲除,旨在快速、便捷获得目的基因突变体。结果表明:在百脉根和大豆中均获得了目的基因敲除的突变体;其中,百脉根LjNFR1基因中靶位点1处的敲除效率为58.3%,在靶位点2处的敲除效率为0;大豆GmNFR1靶位点1处的敲除效率为33.3%,靶位点2处的敲除效率为41.7%。进一步测序分析发现,CRISPR/Cas9系统可同时敲除大豆基因组上编码NFR1的2个同源基因(GmNFR1和GmNFR1b),为研究植物体内基因的功能冗余提供了技术支持。同时,CRISPR/Cas9系统在毛根转化中的运用进一步地缩短了获得突变体的周期。     

利用EMS筛选豆科模式植物百脉根的根瘤突变体及突变部位

豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,被根瘤菌感染后形成根瘤,根瘤菌固定氮素变换成铵态氮,植物利用铵态氮进行营养生长,而根瘤菌利用植物供给的碳酸同化产物为能源。为获得根瘤的成熟、维持的基因,本研究利用化学诱变试剂EMS处理百脉根MG-20得到多种突变体,筛选根瘤成熟、维持有异常的突变植株,利用SSR标记和dCAPS标记进行基因定位。结果表明:约10万M2百脉根植株中获得nup85突变体2株,nup133突变体4株,pollux突变体6株,ccamk、symrk、castor、nin、nfr1、nfr5突变体各1株等不结瘤突变体(Nod~-)18株;结无效根瘤突变体(Fix~-)6株并确定了突变体的突变部位。     

百脉根AD-cDNA文库的构建及与结瘤因子受体NFR1相互作用蛋白的鉴定

以豆科植物百脉根为材料,构建了AD-cDNA表达文库。其库容量达到每3μg DNA 2×106酵母转化子,空载率为12.5%,平均片段长度为1.5 kb。以百脉根结瘤因子受体激酶基因1(nod factor receptor kinase,NFR1)蛋白激酶结构域的DNA片段(NFR1-PK)为诱饵,利用酵母双杂技术,筛选与NFR1相互作用的基因。结果在含X-gal的四缺选择性培养基上筛选到120个克隆。经质粒抽取、PCR鉴定、回转酵母验证得到80个阳性克隆。对26个确定阳性克隆的外源片段进行测序和同源性分析,通过NCBI数据库比对分析鉴定含有JAB1、AT-RICH结构域等4个与NFR1-PK相互作用的不同基因。通过半定量RT-PCR观察在百脉根中这些基因的表达情况,其结果可为进一步研究NFR1基因的功能和调控机制提供材料。     

Bar基因转化豆科牧草百脉根的研究

以豆科植物百脉根子叶为转化受体,通过根癌农杆菌介导方法将外源目的基因Bar基因和Gus基因导入,经筛选分化、再生,得到具有Basta抗性的转基因植株。在Basta浓度的选择中,2mg/L是百脉根较为适宜的筛选浓度。试管苗叶片筛选剔除假转体和嵌合体植株,转基因植物移栽大田后生长良好。PCR检测证明外源目的基因已整合到百脉根基因组中。     

超慢型大豆根瘤菌的分离和初步鉴定

1982年从辽宁省铁岭地区的风沙干旱盐碱地区的野生大豆(Glycine soja) 根瘤中分离得到一个大豆根瘤菌的新类群——超慢型大豆根瘤菌。此类群与快生型和慢生型大豆根瘤菌一样,在栽培大豆上结瘤良好,并能固氮。但不在草木樨、豌豆、紫云英、百脉根等豆科植物上结瘤,可在绿豆上结瘤并能测出固氮酶活性。生理生化特性上有许多特性与另外两群有较大差异,已进行的初步鉴定表明,主要表现在:(1)菌落如针尖大小,直径≤1mm:(2)在根瘤菌标准培养基上产碱能力强。据对超慢型12个菌株液体培养,生长5天pH达7.72～8.09,而所测定的慢生型大     

百脉根根瘤内根瘤菌与假单胞菌的多样性分析

为了探索百脉根根瘤内生菌多样性,揭示百脉根根瘤内根瘤菌与假单胞菌的多样性及其互作关系并寻找能结瘤的根瘤菌,本研究采用免培养和可培养相结合的方法对百脉根根瘤内生菌的多样性进行分析,采用平板对峙法对根瘤菌与假单胞菌的互作关系进行初步研究.结果表明:免培养法从百脉根根瘤内检测到内生菌分属于17门31纲69目103科140属,...     

百脉根LjSERKs基因家族在根瘤共生中的功能鉴定

为探索百脉根中的体细胞胚胎发生受体类蛋白激酶基因(somatic embryogenesis receptor-like kinases,SERKs)家族在根瘤共生过程中的功能和作用机制,根据拟南芥AtSERKs基因序列,从百脉根基因组中鉴定到8个同源基因(LjSERKs)。利用CRISPR-Cas9基因组编辑和毛根转化技术,分别敲除LjSERKs家族不同基因,观察并分析其对共生结瘤表型的影响。结果显示:敲除LjSERK2、LjSERK3、LjSERK6和LjSERK7后,其植株结瘤数与对照植株相比均无明显差异;敲除LjSERK8后,植株结瘤数显著减少。这些结果表明LjSERK8参与根瘤共生过程,而该家族其他基因间可能存在功能冗余现象。     

微生物与植物共生结瘤固氮的分子遗传学研究进展

以根瘤菌 -豆科植物共生体系为主要代表 ,综述了近年来在结瘤固氮分子遗传学研究领域所取得的进展 ,特别是共生双方与结瘤、固氮有关的基因的定位、表达与调控     

豆科植物结瘤及其结瘤的分子基础

阐述了豆科植物与根瘤菌相互作用形成固氮根瘤 ,讨论了结瘤基因的组成、性质和功能及其翻译表达产物结瘤因子     

豆科植物根瘤茵结瘤因子的感知与信号转导

结瘤因子(脂壳寡糖,lipo-chito-oligosaccharides,LCOs)是根瘤菌在宿主植物根系分泌的类黄酮的作用下,合成并分泌的一类多糖信号分子,在根瘤菌与植物的共生结瘤过程中起重要作用。结瘤因子通过一定的机制感知,与某种特定受体(结瘤因子结合蛋白)结合,通过结瘤因子激活的信号转导途径如Ca2 介导的信号转导途径或磷酸类脂信号转导途径,诱导宿主植物的一系列反应,如根毛质膜去极化、皮层细胞分裂和结瘤素基因表达等。同时,结瘤因子的感知与信号转导也受一定基因和反馈机制调控。就豆科植物根瘤菌结瘤因子感知机制、信号转导途径及反馈调控等方面的研究进展进行了全面阐述。     

百脉根结瘤信号通道蛋白NSP1和NSP2的转录激活作用

共生结瘤过程是根瘤菌与宿主植物交换信号分子的相互作用过程,结瘤信号通道蛋白基因NSP1和NSP2是结瘤因子诱导的共生信号转导途径的必要元件。LjNSP1和LjNSP2蛋白都包含植物所特有的GRAS结构域,推测为转录调节子,但缺乏明确的生化证据。为验证这一推测,本研究采用酵母双杂交系统,将两者分别融合到酵母GAL4转录因子的DNA结合结构域上,根据是否能激活报告基因的表达来验证它们的转录激活能力。结果表明LjNSP1和LjNSP2在酵母体内均具有转录激活的能力。为进一步确定转录激活的区域,对LjNSP1和LjNSP2构建了一系列的缺失突变,鉴别出转录激活区段均位于两者的N-末端的可变区域。为验证作为转录因子的LjNSP1和LjNSP2是否具有结合某种特定基因的启动子的能力,进行了酵母单杂交实验。其结果表明,LjNSP1和LjNSP2蛋白均能够结合根瘤起始基因NIN的启动子,但不能结合钙离子结合蛋白基因CBP1的启动子。     

启动子Prd29A的克隆及在百脉根中的活性鉴定

利用PCR方法,从拟南芥中克隆了865bp的逆境诱导型启动子Prd29A.利用农杆菌介导的瞬时表达方法,结合GUS染色,在豆科植物百脉根的幼苗中进行活性鉴定.结果表明:启动子Prd29A在正常情况下不表现活性,而在逆境(高渗、高盐)和ABA诱导下活性很高,这为该启动子在百脉根等豆科植物中的应用提供了依据.     

百脉根中Lj5NG4与结瘤因子受体LjNFR1互作调控根瘤菌侵染

以百脉根结瘤因子受体激酶LjNFR1为诱饵,通过建立百脉根根瘤共生不同时期的酵母膜双杂文库筛选获得了一个与之互作的生长素相关转运蛋白Lj5NG4。通过酵母双杂交和烟草Split-Luc等试验进一步证实了Lj5NG4与LjNFR1的蛋白互作。利用CRISPR-Cas9基因敲除及超表达技术创建相关转基因材料,研究发现Lj5NG4可能在根瘤菌侵染前期起负调控作用,但对结瘤过程没有显著影响。同时启动子表达也证实了Lj5NG4在侵染前期根毛中强烈表达,成熟根瘤内部不表达。外源施加生长素试验发现低浓度的生长素会减弱Lj5NG4突变体的早期侵染表型,这表明生长素在共生结瘤发育中通过Lj5NG4发挥功能。     

NaCl对百脉根幼苗生长的影响

为探究百脉根幼苗对NaCl耐性阈值及其苗期盐害的敏感指标,采用温室盆栽法研究了不同浓度(0、10、20、30、40 mmol/L)NaCl对百脉根幼苗生长的影响。结果表明:百脉根幼苗的株高、干重、根长、根表面积、根体积及细根根长和表面积基本随NaCl浓度的升高呈下降趋势。显著降低百脉根幼苗地上部和地下部生物量的NaCl起始浓度分别为40 mmol/L和20 mmol/L,显著降低细根根长和根表面积的起始浓度为10 mmol/L,由各指标对NaCl浓度拟合回归直线方程得出的对应半致死浓度也是细根根长和根表面积的最低,地上部的最高。百脉根苗期地下部尤其是细根对NaCl胁迫更为敏感,细根根长和表面积可作为百脉根苗期对NaCl耐性的衡量指标。     

根瘤菌-豆科植物共生多样性与地理环境的关系

 根瘤菌与豆科植物形成的根瘤或茎瘤固氮共生体系在农、林、牧业的可持续发展中具有重要作用。 10 0多年前 ,在根瘤菌研究的起始阶段 ,人们提出的“宿主专一性”及“互接种族”2个概念一直流传至今。 2 0世纪 4 0年代 ,有学者根据实验室内豆科植物的交叉结瘤结果否定过“互接种族”的观念 ,70～ 80年代又发现某些根瘤菌在实验室条件下有广谱共生现象。但根瘤菌与豆科植物共生体与地理环境的关系却很少被涉及过。本文在对大量根瘤菌进行分类研究的基础上 ,结合宿主植物及其区域地理环境的综合分析 ,揭示出根瘤菌与豆科植物     

百脉根小GTPase ROPs 基因反转座子插入突变体的分离和鉴定

为研究ROP(Rho-related GTPase of plants,ROP)在豆科植物共生固氮过程中的功能和作用机制,从百脉根逆转录转座子LORE1插入突变体库(http://www.kazusa.or.jp/lotus)中搜索到6个ROP相关基因突变体,通过分离和鉴定,得到不同突变体的M1代和M2代纯合体种子,对M2代进行表型鉴定及统计分析。结果表明:在早期共生表型的鉴定中,突变体与野生型植株相比,rop-like1植株的根瘤原基数明显下降,rop-like4植株的侵入线数和侵入线密度也明显下降;但仅rop-like1植株在接种14d后的结瘤数明显减少。     

拟南芥中根瘤共生基因线路的搭建及其表达分析

为研究共生信号途径相关基因在非宿主植物中的表达情况,通过生物技术及合成生物学方法,将10个能在拟南芥根中表达的启动子和10个百脉根共生信号传递的关键基因分别构建2个多基因表达载体,即pUNS6(含6个基因)和pDNS4(含4个基因)。结果表明:利用毛根转化互补相应豆科植物的突变体,都能恢复突变体的结瘤功能,说明克隆的目的基因都具有生物学功能;通过根癌农杆菌介导的花序侵染,将pUNS6和pDNS4分别转入拟南芥中,对阳性植株分离和鉴定,在转基因T_0、T_1、T_2代植株中都鉴定到目的基因,表明多个共生基因稳定存在于拟南芥基因组上;利用RT-PCR在阳性转基因植株根中都能检测到mRNA水平的基因表达。