猪肺炎支原体PCR检测方法的建立及初步临床应用

根据GenBank中猪肺炎支原体（Mhp）J株P36蛋白基因（登录号X67286）的核苷酸序列设计1对引物,建立了快速检测Mhp的PCR方法。该方法能扩增出948bp的Mhp特异性条带,其敏感性达到可检测出0．735ng的MhpDNA,但对鸡毒支原体、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒均未检测出相应目的条带;将克隆获得的目的片段与GenBank已发表的MhpJ株的P36基因进行比较,同源性达到99．9％。采用所建立的PCR方法对42份疑似猪支原体肺炎（MPS）病料进行临床诊断,发现有13份呈阳性（31．0％）。可见,该PCR方法适合于MPS的临床诊断,可为其防控提供可靠依据。     

猪肺炎支原体竞争定量 PCR检测方法的建立及初步应用

[目的]本试验旨在探索一种对猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）培养物中的支原体进行快速检测的竞争定量 PCR方法。[方法]设计一对Mhp特异性引物,检测Mhp培养物;又根据支原体种属保守基因序列设计一对引物,通过酶切缺失法构建竞争模板,其携带与目的片段相同的引物结合区。[结果]以一系列稀释的竞争模板的对数值为横坐标（X轴）,竞争模板和目标模板扩增产物的光密度比值的校正值的对数值为纵坐标（Y轴）绘制标准曲线,根据 Y=0所对应的竞争模板的量推算求得支原体的拷贝数。以变色单位的对数值为 X轴,支原体的拷贝数为 Y轴,绘制出标准曲线,两者之间高度相关。[结论]成功建立了一种快速测定 Mhp培养物中支原体量的竞争PCR方法。     

牛结核杆菌病PCR检测方法的建立及初步应用

根据PCR技术原理.建立了牛结核病PCR诊断方法,并测定出该方法的敏感性为1.025 Pg,茵细胞的灵敏度为200个茵左右.特异性试验表明,除牛结核分枝杆菌的特异扩增带(317 bp)外,其他的细茵均未出现特异性扩增带.采用PCR检测方法,通过对94份奶牛奶样的检测.得到牛结核分枝杆茵的阳性率为11.7%(11/94),PCR和胶体金方法检出率有明显的差异.PCR方法敏感性强,特异性高,是一种提高牛结核病临床诊断的好方法.     

牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌和牛结核分枝杆菌三重PCR快速检测方法的建立

为建立快速、准确的检测牛呼吸道主要病原菌牛支原体(Mycoplasma bovis)、牛多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)及牛结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的方法,对牛支原体oppD基因序列、牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因序列、牛结核分枝杆菌IS6110基因序列分别设计特异性引物,对单一PCR检测方法进行优化后建立三重PCR检测方法。结果表明:三重PCR的最佳扩增条件为94℃预变性10min;94℃1min,60℃50s,72℃1min,循环30次;72℃延伸10min。建立的三重PCR方法能对同一样本中的3种病原菌进行扩增,特异性强。牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌和牛结核分枝杆菌的最低检测DNA浓度分别为5.306×10~(-3)ng/μL、3.075×10~(-2)ng/μL和1.605×10~(-4)ng/μL。建立的三重PCR方法临床检测牛支原体肺炎鼻拭子、牛结核分枝杆菌、结核菌素与单一PCR检测方法的阳性符合率为100%。三重PCR检测方法可用于牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌的单一和混合感染鉴别诊断,具有快速、准确、简便的特点。     

牛支原体检测方法初探

为了解广西某肉牛场外购牛感染牛支原体情况,采集鼻拭子60份,进行了牛支原体的分离培养和PCR检测。支原体分离结果显示,从60份鼻拭子中分离出2株支原体,分离率为3.33%(2/60),PCR鉴定为牛支原体。PCR检测结果显示,在60份鼻拭子中共检测出19份牛支原体,检出率为31.67%(19/60)。结果表明,该场外购肉牛的牛支原体具有较高的感染率。     

猪肺炎支原体套式PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的猪肺炎支原体P36(L-乳酸脱氢酶)全基因序列,设计合成了2对引物,建立套式PCR方法。运用该方法对猪肺炎支原体不同菌株培养物进行了扩增,并对经肺内免疫猪支原体肺炎活疫苗后支气管肺泡灌洗液进行了检测。结果表明,不同菌种均能扩增出427 bp的目的条带,而其他病原菌未出现特异性扩增条带。建立的套式PCR方法检测猪肺炎支原体的最低检测限度为10个CCU(颜色变化单位)。支气管肺泡灌洗液检测结果表明,经肺内免疫的猪支气管肺泡灌洗液扩增结果均为阳性。     

牛肠道病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中登录的牛肠道病毒(BEV)全基因组序列,针对其3D基因设计合成了1对特异性引物,提取病毒RNA,逆转录为cDNA,进行PCR扩增,经条件优化,建立了BEV的RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行验证。结果显示,该方法从分离的牛肠道病毒中扩增出了732 bp的特异性目的片段;且对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)等相关病毒均无交叉反应;其检出敏感度达10-1TCID50。应用该方法对山东地区84份临床疑似发病牛样品进行检测,21份为阳性,阳性检出率为25%。     

猪肺炎支原体PCR检测方法的建立研究

猪呼吸道病综合征是一种多因子性疾病。通过设计1对针对16s rDNA的引物,建立了该病原的PCR检测方法,该方法能从标准株和分离株中获得阳性扩增,但不会与其他种类支原体或者是猪呼吸道中的常见微生物发生交叉反应。为证实扩增产物的特异性,对2个PCR产物进行纯化、测序和序列分析,证实为肺炎支原体。     

绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法的建立与应用

[目的]建立一种诊断绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR方法,确定肺炎支原体感染的靶器官。[方法]根据GenBank网站上登录的绵羊支原体16S rRNA基因序列,设计并合成2对引物,以肺炎支原体菌株基因组DNA为模板,经过PCR反应条件的优化,通过测序验证扩增产物的正确性,建立了绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR检测方法,进而应用建立的方法完成临床阳性病料肺脏、肺淋巴、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤、小肠和外周血检测以及疑似样本肺脏组织的检测。[结果]建立的巢式PCR方法可扩增出864 bp的特异性目的片段,肺脏和肺淋巴为绵羊肺炎支原体感染的靶器官,临床样本巢式PCR检出率与支原体培养鉴定结果的符合率为100%。[结论]建立的绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法可用于临床样本的实验室诊断。     

猪鼻支原体套式PCR诊断方法的建立及应用

为建立猪鼻支原体快速诊断方法,根据猪鼻支原体P69基因序列设计2对引物,建立了猪鼻支原体套式PCR诊断方法,对建立的方法进行特异性、敏感性检测,同时进行临床检测。结果表明,应用建立的套式PCR方法对猪鼻支原体DNA的检出限为1.4×10~(-5)ng/μL,与常见感染猪的细菌、病毒均无交叉反应。利用建立的套式PCR方法对23份临床样品进行检测,阳性检出率为73.9%。本研究建立的猪鼻支原体套式PCR具有特异性强、敏感性高等优点,可用于猪鼻支原体的临床诊断。     

新疆阿拉尔垦区猪嗜血支原体PCR检测方法的建立

[目的]掌握阿拉尔垦区猪嗜血支原体的流行现状。[方法]根据GenBank上发表的猪嗜血支原体16S rRNA基因组序列（U88565）设计1对特异性引物,对采自新疆阿拉尔垦区的样品进行PCR扩增,并将其产物克隆到pBR322载体后测序。[结果]扩增出的片段为0.836 kb。同源性分析结果表明,该序列与猪嗜血支原体参考基因组序列同源性为99.47%,反映出我国分离株与国外株基因同源性较高。[结论]建立了一种猪嗜血支原体PCR检测方法,该方法为猪嗜血支原体病的快速诊断及流行病学调查提供了新的手段,并为相关基因的表达及功能研究奠定了基础。     

牛布鲁菌与牛分枝杆菌双重PCR方法的建立及应用

根据GenBank中已发表的流产布鲁菌种特异的omp25基因序列及牛分枝杆菌特异保守的16S rRNA加工蛋白rimM基因序列设计了2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布鲁菌Brucella abortus和牛分枝杆菌Mycobacterium bovis的双重PCR方法.对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果显示,在牛布鲁菌和牛分枝杆菌中分别扩增出448、269 bp的特异性目的条带,作为对照的大肠杆菌Escherichia coli、沙门菌Salmo-nella typhimurium、八叠球菌Sarcina lutea、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、巴氏杆菌Pasteurella multocida、军团菌Legionella pneumophila、枯草杆菌Bacillus subtilis及溶血性链球菌Streptococcus pneumonia均未扩增出任何条带.牛布鲁菌和牛分枝杆菌的DNA最低检出量均为10 pg;牛奶样品中人工污染的牛布鲁菌和牛分枝杆菌的检测敏感性分别为7.9×103CFU/mL、3 ng/mL.     

牛支原体病诊断方法的研究进展

牛支原体是主要引起牛呼吸系统疾病、乳腺炎、关节炎的病原体。该病分布广泛,在欧洲和北美等地区不断蔓延,引起巨大的经济损失。牛支原体因缺乏细胞壁而难以治疗,建立可靠实用的牛支原体诊断技术,有效控制和预防牛支原体病爆发,对于我国牛养殖业至关重要。文章就国内外牛支原体诊断方法作以简述。     

牛轮状病毒二温式PCR检测方法的建立

根据牛轮状病毒（Bovine rotavrius,BRV）的群特异性基因VP6设计了1对特异引物,建立并优化了能够快速检测BRV的二温式PCR方法。特异性和敏感性试验结果表明,该二温式PCR只对BRV敏感,可扩增获得大小为385 bp的特异性条带,其敏感性为最低能检测到1 pg的BRV RNA;而对其他病毒不敏感。说明所建立的BRV二温式PCR方法是一种快速、特异、敏感的检测方法。     

猪肺炎支原体PCR鉴定方法的建立

根据猪肺炎支原体的P36基因序列设计一对引物,建立猪肺炎支原体PCR检测方法,并对该方法进行了特异性和敏感性试验。成功建立了猪肺炎支原体特异且敏感的PCR检测方法,可区别猪鼻支原体、絮状支原体和鸡毒支原体,最低检出量为4.26 ng。     

牛支原体病研究进展

近些年来大规模养牛业发展迅速,牛支原体病已经成为对养牛业造成巨大威胁的一种重要致病性支原体,可以使牛产生牛肺炎、乳腺炎、关节炎等,给养牛业带来了巨大经济损失。本论文通过分析归纳牛支原体病的国内外研究进展,从病原学、流行病学、临床症状与病理变化、诊断、毒力因子、免疫与疫苗、防治措施等方面进行了系统综述。研究牛支原体病的发展历程与诊疗方法。     

猪支原体肺炎可疑肺组织PCR检测方法的建立

建立了病猪肺脏组织的处理方法和DNA提取方法,根据猪肺炎支原体的P36基因设计一对引物,建立猪肺炎支原体PCR检测方法,并对该方法进行了特异性和敏感性试验,使用建立的方法检测了临床样品。结果表明,建立的检测方法能成功从猪支原体肺炎可疑肺组织中扩增出目的条带,成功建立了猪支原体肺炎可疑肺组织PCR检测方法,为该病的诊断提供了条件。     

牛环形泰勒虫病PCR诊断方法的建立及其应用研究

[目的]建立快速检测牛环形泰勒病的PCR诊断方法.[方法]根据牛环形泰勒虫裂殖子的表面抗原(Tams1)基因,设计一对特异性引物,以地方阳性病例提取的DNA为模板,用PCR扩增出目的条带,经克隆、测序分析后,通过优化反应体系,建立牛环形泰勒虫病的PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行验证试验.[结果]测序结果表明,扩增的目的片段与已知基因序列相似性为99;;该方法检测与牛的其他血液原虫无交叉反应,其最低检出限量为1.6×102 copies/μL.应用所建立的PCR检测方法对新疆吐鲁番市周边疑似地区419份牛全血进行了检测,结果阳性率为52.3; (219/419),而血液涂片检出率为43.7;(183/419).[结论]建立的牛环形泰勒虫PCR快速诊断方法具有有一定的特异性和敏感性,可用于牛环形泰勒虫病的分子诊断和流行病学调查.     

牛病毒性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种灵敏度高、特异性强、重复性好,能快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法。根据BVDV的E2基因保守序列,设计合成一对特异性引物,建立了检测BVDV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。将标准阳性样品10倍梯度稀释检测灵敏度,用能感染奶牛的其它病毒做对照检测特异性,用临床样本检测重复性。结果表明,该方法与能感染奶牛的其它几种病毒均无交叉反应,检出敏感度达4.87×10~1 copies/μL,比常规PCR检测方法高10倍。同时检测了5个规模化奶牛场送检的67份奶牛腹泻样本,其BVDV检出率为46.27%(31/67)。本研究成功建立了BVDV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为BVDV的快速诊断和定量分析提供了技术支撑,具有很好的应用前景。