"索蚌"百合原生质体分离及培养的研究

用纤维素酶、离析酶、果胶酶、山梨醇的混合酶液提取"索蚌"百合的幼叶和愈伤组织的原生质体.对影响原生质体提取得率因素进行分析,用液体浅层培养法在MS、改良MS和NLN培养基附加不同浓度6-BA,2,4-D等进行培养.结果表明:纤维素酶和酶解时间对原生质体提取得率有极显著影响,最适合百合幼叶原生质体提取的酶液组合为:2?llulase R-10,0.5% Macerozyme R-10,酶解4 h.百合愈伤组织的原生质体提取的酶液混合液组合为:2% Cellulase R-10 0.5% MacerozymeR-10 0.05%Pectolyase Y23 147 mg/L CaCl2·2H2O 976 mg/L MES 0.6 M Sorbitol.进行原生质体的培养仅愈伤组织为来源的观察到细胞的分裂,幼叶为来源的原生质体几乎没有分裂,但两者最终都没有形成愈伤组织.     

多花蔷薇胚性细胞悬浮系原生质体分离及再生植株

利用多花蔷薇‘无刺3号’假珠芽诱导的胚性愈伤细胞悬浮系分离得到原生质体,并培养获得再生植株。酶种类和浓度, 酶解时间及悬浮细胞继代时间对原生质体分离有重要影响,最佳酶液组成是2.0%纤维素酶,0.5%离析酶,5.0 mmol·L^-1 MES, 0.5 mol·L^-1甘露醇,0.5% CaCl₂·2H₂O。采用继代3 d的悬浮细胞系,酶解10 h,原生质体产量达到26.67×10⁶g^-1,原生质体活力为92.21%。采用液体浅层培养,肌醇比蔗糖更有利于纯化后的原生质体分裂和生长。愈伤组织形成增殖培养基为1/2MS + 2,4-D 1.0 mg·L^-1+ EBR 0.2 mg·L^-1 + 10 g·L^-1 Ficoll + 500 mg·L^-1谷氨酰胺 + 20 mg·L^-1甘氨酸 + 20 mg·L^-1天冬氨酸,分化培养基为1/2MS + 10 mg·L^-1 TDZ + 500 mg·L^-1谷氨酰胺+ 20 mg·L^-1甘氨酸+ 20 mg·L^-1天冬氨酸,后转入1/2MS培养基上获得完整植株。     

苹果体细胞悬浮培养及植株再生研究

以苹果试管苗叶片的再生不定芽嫩叶为试材,对苹果体细胞悬浮系的建立及植株再生的影响因素进行了研究.结果表明:在MS+NAA 0.5 mg/L+BA 2.0 mg/L培养基上可诱导获得高活力的愈伤组织.将该愈伤组织转入MS+2,4-D 2.0 mg/L+BA 1.0 mg/L液体培养基中培养,采用无菌筛网分离获得含单个细胞和少于8～10个细胞的小细胞团进行继代培养,建立体悬浮细胞培养系.将悬浮细胞转到MS+2,4-D 2.0 mg/L+BA 1.0 mg/L的固体增殖培养基上暗培养25 d后,可形成微型愈伤组织,将该愈伤组织转到MS+BA 5.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L的植株再生培养基上暗培养30 d后转入光下,光照培养30 d后53％的愈伤组织可再生植株.该研究建立的苹果体细胞悬浮培养技术,不仅可用于细胞融合及遗传转化过程中杂种细胞和转化细胞的分离及植株再生研究,而且对于利用组织培养技术筛选变异株系也具有重要意义.     

红姜花胚性细胞悬浮体系的建立和原生质体培养

以红姜花(Hedychium coccineum)未成熟花丝和花药为试材,研究了红姜花胚性愈伤组织的诱导、细胞悬浮体系的建立以及原生质体的培养。结果表明:在MS+4mg/L 2,4-D+4mg/L NAA+1mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂上经过120d培养诱导出了愈伤组织,愈伤组织在增殖培养基上经过继代筛选获得浅黄色、松散易碎的胚性愈伤组织。胚性愈伤组织通过3个月的悬浮培养,得到均质稳定的胚性细胞悬浮系。以胚性悬浮细胞(ECS)为起始材料分离原生质体,酶解试验表明,在原生质体分离过程中,用于原生质体分离的酶液需要保持一定的渗透压以保护原生质体不被破坏。当甘露醇的浓度为0.14mol/L时,原生质体产量最高,达到2.25×105个/mL PCV ECS(packed cell volume,PCV)。在看护培养系统中,原生质体经过7d的培养,细胞第一次分裂,经过14d培养,细胞分裂频率达到12.3%,28d时,细胞团形成频率达到4.2%。所形成的细胞团具有典型的胚性细胞特征。     

芹菜胚性细胞悬浮系原生质体分离及再生植株

利用芹菜胚性细胞悬浮系成功分离得到大量原生质体, 获得芹菜大量原生质体的最佳反应体系为: 酶液组成为3.0%纤维素酶Onozuka R210、1.0%离析酶R210、11%甘露醇、0.5% CaCl₂ ·2H₂O和0.1% MES; 摇床转速为80 r/min, 温度(25 ±2) ℃, 酶解时间5～6 h; 原生质体产量为25.00 ×10⁶ /g, 原生质体活力83.41%。原生质体浅层培养, 培养基为1 /2 MS + 1 mg/L 2, 4-D + 0.5 mg/L KT + 11%甘露醇+ 500 mg/L水解络蛋白, 两天后, 重新再生细胞壁之后进行第1次分裂, 逐步降低渗透压至甘露醇3% ,大约30 d形成小细胞团。小愈伤组织经增殖培养后在1 /2MS + 500 mg/L CH + 0.25 mg/L KT固体分化培养基诱导出不定芽, 30 d后再转入MS基本培养基, 获得完整的再生植株。     

新疆雪莲胚性愈伤组织的诱导及原生质体分离

以新疆雪莲无菌叶片为材料,诱导其产生胚性愈伤组织,再以胚性愈伤组织为分离原生质体的起始材料,研究质壁分离时间、渗透压浓度、酶液组合、酶解时间等因素对其原生质体分离效果的影响。结果表明:对诱导胚性愈伤组织有较好效果的培养基组合为:MS+2,4-D 0.1mg/L+BA 0.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L+葡萄糖30 g/L;原生质体分离最佳体系为:含纤维素酶2.5%、离析酶0.2%、果胶酶1%、MES 0.1%和甘露醇10%的酶解液,在温度(26±1)℃,pH 5.8条件下酶解14~16 h,游离原生质体的产量和活性均较高。     

夏堇悬浮细胞培养与植株再生研究

以夏堇品种“小丑”的组培苗幼嫩叶片为试材,进行愈伤组织诱导、细胞悬浮培养及植株再生诱导的研究.结果表明:MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L2,4-D的培养基能够使叶片诱导为生长迅速、质地疏松的愈伤组织.愈伤组织最适宜的悬浮培养条件为:MS+ 1.0 mg/L6-BA+0.1 mg/L 2,4-D液体培养基,20 g/L的起始接种量以及100 r/min的震荡培养.将继代3～4次的细胞悬浮颗粒转到1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的固体再生培养基上培养,3周后可以诱导分化出芽,进而获得完整植株.悬浮培养有利于夏堇愈伤组织的再生,悬浮培养对提高以夏堇作为模式植物进行的相关研究具有重要的应用价值.     

橙色大白菜原生质体的游离和纯化

以橙色大白菜金冠2号为试材,就其子叶及下胚轴原生质体游离、纯化方法及影响因素等进行了研究.结果表明:适宜金冠2号子叶原生质体游离的条件为CPW+DPD培养基+0.8%纤维素酶R-10+0.1%离析酶R-10+0.5 mol/L甘露醇+10 mM CaCl2·2H2O+0.7 mMKH2PO4+0.1% MES,酶解温度27℃,酶解时间2 h,产量达3.52×106个/g·FW,活力60.3%;适宜金冠2号下胚轴原生质体游离的条件为CPW+DPD培养基+1.5%纤雏素酶R-10+0.3%离析酶R.10+0.5 mol/L甘露醇+10 mM CaCl2·2 H2O+0.7 mM KH2PO4+0.1% MES,酶解时间18 h,产量达2.20×106个/(g·FW),活力63.7%.而且以21%蔗糖,800 rpm等密度梯度法离心5min纯化原生质体效果最佳.     

罗田甜柿原生质体分离、培养及植株再生

 以‘罗田甜柿’休眠芽茎尖诱导的愈伤组织为试材, 对原生质体分离培养技术进行了研究。结果表明: ( 1) 继代10 d 的愈伤组织最适于分离原生质体; ( 2) 优化的酶解体系为CPW+ 0. 5% Cellulase Onoruka R-10+ 0. 03% Pectinase from Aspergillus Niger+ 0. 7 mol/ L Mannitol+ 1% PVP-10; ( 3) 原生质纯化方式以上浮法为好, 100×g 离心6 min; ( 4) 琼脂糖念珠培养5~ 6 d 观测到第1 次分裂, 多为不均等分裂, 60~70 d 形成肉眼可见的小愈伤组织, 愈伤组织增殖到5 mm 以上, 分化成苗, 转至生根培养基生根。     

怀地黄愈伤组织诱导及细胞悬浮培养体系的建立

研究了植物生长调节剂和接种方式对怀地黄叶片愈伤组织诱导的影响和细胞悬浮培养体系的建立。结果表明:将叶片正接在MS+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.4mg/L培养基上,愈伤组织生长良好,诱导率达100%;在该培养基上多次继代,可形成3种类型的愈伤组织,其中Ⅰ型愈伤组织淡黄色、颗粒透亮、分散性好且疏松易脆,适合进行细胞悬浮培养;在MS+2,4-D 3mg/L+6-BA 0.5mg/L培养基中,悬浮培养细胞生长曲线呈"S"型,培养15d时细胞干重达最大值,为4.94g/L。     

葡萄愈伤组织制备原生质体的影响因素研究

【目的】为了获得高质量的葡萄原生质体,【方法】以"鄞红"葡萄茎段愈伤组织为材料,对葡萄原生质体制备过程中的若干影响因子,如酶解液成分、甘露醇浓度、酶解时间、离心条件等方面进行了研究。【结果】0.5 mol.L-1的甘露醇+1%纤维素酶+0.025%～0.05%果胶酶为最佳的酶解液组成;酶解14 h、120×g离心3 min条件下原生质体数量和质量最佳。【结论】研究获得的高质量葡萄原生质体,为下一步的植株再生及葡萄品种遗传改良提供了良好的材料。     

碘乙酰胺和罗丹明对不结球白菜子叶原生质体线粒体失活效果的影响

以 91H秋 - 2 1(矮脚黄 )不结球白菜为试材 ,研究了碘乙酰胺 (IOA)和罗丹明 (R 6G)对子叶原生质体线粒体失活效果的影响。结果表明 ,0 .5mmol·L-1的IOA ,在 2 5℃条件下处理 2 0min(分 ) ,就能将植板率从 15 .0 %降到 6 .6 % ;1.0mmol·L-1的IOA ,在 2 5℃条件下处理 10min(分 )可使不结球白菜子叶原生质体失活。 40 μg·mL-1的R 6G ,在 2 5℃条件下处理 30min(分 ) ,可有效地抑制不结球白菜子叶原生质体的分裂和愈伤组织的形成。利用R 6G使原生质体线粒体失活 ,更有利于非对称细胞融合的进行     

Isolation and culture of mesophyll protoplast from apricot

Summary

Yields of 10⁶–10⁷ apricot mesophyll protoplasts g fw^–1 were obtained depending on factors such as plasmolysing pretreatment, digesting enzymes and digestion time. Onozuka R-10 (1%) in combination with Pectolyase Y-23 (0.1%) and Hemicellulase (1%) was found best for protoplast isolation among several enzyme combinations tested. Viability was 83% with this enzyme combination. Plasmolysis of leaves for 90 min in a 13% sorbitol solution greatly increased the number of protoplasts obtained. Optimum incubation time of 13–16 h produced the best combination of yield and viability. During the purification of protoplasts a critical step was the centrifugation of the sucrose gradient at 75 g with a dramatic decrease in the recovery of protoplasts at lower and higher centrifugation speeds. Protoplasts were cultured under different media composition and growth regulator combinations. Limited growth and division of protoplasts embedded in agarose drops were obtained.     

‘过山香’香蕉原生质体培养及植株再生

 以'过山香'香蕉的胚性悬浮细胞（Embryogenic cell suspensions,ECS）为起始材料分离原生质体,酶解液的组成为：3.5%纤维素酶R-10、1%离析酶R-10、0.15%果胶酶Y-23、204 mmol/L KCl、67 mmol/L CaCl2和0.41 mol/L甘露醇,原生质体产量为3.1×107个/mL PCV ECS （PCV：packed cell volume,细胞密实体积）。分别以培养基‘A’和‘B’为培养成分在液体浅层培养和看护培养两种培养系统中进行原生质体培养。结果表明：在液体浅层培养系统中,采用培养基‘B’比采用培养基‘A’效果好,原生质体的细胞分裂频率和细胞团形成频率分别约是采用培养基‘A'的3倍和10倍;所获得的培养物为只能增殖而不能进一步分化的非胚性细胞团。在看护培养系统中,采用培养基‘A’与采用培养基‘B’时,细胞分裂频率和细胞团形成频率没有显著地差异;所获得的细胞团具有典型的胚性细胞特征。将从看护培养中获得的细胞团转移到体胚诱导培养基上,培养45 d后,从105个原生质体获得1550个体胚。继续在体胚诱导培养基上培养30 d,7.8%的体胚能萌发。萌发的体胚在MS+0.1%活性炭的培养基中发育成健壮植株,移栽后成活良好。     

莴苣原生质体的分离方法

以莴苣无菌苗的幼叶为试材,研究了不同的分离材料、质壁分离时间、苗龄、酶液组合、酶解时间及酶液渗透压等对原生质体分离效果的影响。结果表明:幼叶在含有13%甘露醇的CPW溶液里质壁分离2h,获得的原生质体产量存活率均高于其它质壁分离时间;苗龄为20d的幼叶分离得到的原生质体质量高,原生质体呈圆形、内含物多、活力强;酶液组合为1.0%纤维素酶+0.2%离析酶,25℃黑暗条件下酶解12h可获得大量有较高活力的原生质体;酶解液中添加浓度为9%的甘露醇较适合原生质体分离。     

微型结球白菜原生质体游离与纯化研究

以微型结球白菜无菌苗子叶为材料,探讨酶液浓度、酶解时间、酶液渗透压、离心转数对其原生质体分离效果的影响以及蔗糖浓度对纯化结果的影响。结果表明:以1.0%CellulaseR-10,0.08%Pectinase,0.4 mol/L甘露醇,酶解6 h,第1次离心转速1 200 r/min,24%蔗糖的条件组合最佳,原生质体产量为2.10×107个/g(FW),活力达91.20%。     

柑桔抗盐突变体的原生质体培养与分离纯化研究

锦橙、桃叶橙抗盐胚性愈伤组织酶解后可得到大量的原生质体,FDA检查活性分别是92.5％和89.2％。抗盐原生质体在培养过程中首先逐渐再生细胞壁,覆盖整个细胞膜表面,然后恢复分裂。锦橙、桃叶橙抗盐原生质体经2个月培养,单个原生质体已分裂形成肉眼可见的细胞团,锦橙的细胞团平均达550×391μm,其中很多已分化形成球形胚状体,部分即将形成原生质体植株,桃叶橙原生质体的细胞团达389.2×280.0μm。     

酿酒葡萄原生质体再生植株

将酿酒葡萄品种白诗南、梅郁的花丝接种在含６ＢＡ２．０ｍｇ·１－１、２，４－Ｄ０．５ｍｇ·１－１的Ｂ５诱导培养基上，诱导产生胚性愈伤组织。胚性愈伤组织经液体悬浮培养形成含大量胚性细胞团的悬浮培养物。用Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　　Ｒｓ２％、Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ　Ｙ２３０．３％，５ｍｍｏｌ·１－１ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ、０．６ｍｏｌ·１－１甘露醇、０．３％葡聚糖硫酸钾、ｐＨ５．６～５．８的酶混合液从胚性细胞团分离得到原生质体。原生质体培养到第５天出现第一次分裂，４０ｄ形成上百个细胞的大细胞团，５０ｄ形成０．５～１．０ｍｍ大小的小愈伤组织。这些小愈伤组织在含６ＢＡ０．５ｍｇ·１－１的Ｂ５分化培养基上分化出胚状体进而形成幼苗，在生根培养基上生根形成再生植株。     

野生茄子原生质体制备及电融合条件研究

以野生茄子蒜芥茄（Solanum sisymbriifolium）和水茄（S. torvum）叶片为原生质体融合材料，对原生质体制备中酶解液浓度、酶解时间和电融合参数进行研究。结果显示：在0.3%（m/V）纤维素酶+0.1%（m/V）离析酶浓度条件下镜检观测到的单细胞数量最多；蒜芥茄酶解最适时间为14 h，原生质体产量达最大值15.06×10⁶个 · g^-1，水茄酶解最适时间为13 h，原生质体产量达最大值15.92×10⁶个 · g^-1；最适电融合参数为交流电场强度80 V · cm^-1，作用时间10 s，直流脉冲强度1 250 V ·cm-¹，作用时间 45 μs，次数1 次时，显微镜观测到融合效果最佳。