紫花苜蓿MsSAG113基因的克隆及对拟南芥的转化

以紫花苜蓿为试材,采用RT-PCR技术克隆出一个与拟南芥SAG113同源的基因,利用无缝连接酶将其与3302Y连接构建过量表达的植物表达载体,通过花序浸泡法转化拟南芥获得具有草铵膦抗性的植株,以期为研究MsSAG113的功能提供参考依据。结果表明:MsSAG113基因编码区长849bp,编码283个氨基酸,PCR和RT-PCR检测显示成功获得了转MsSAG113基因拟南芥植株,初步证明在转基因拟南芥中外源SAG113基因能够转录表达。     

苹果蔗糖转运蛋白MdSUT2调控花青苷积累的研究

从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆蔗糖转运蛋白基因MdSUT2(序列号:MDP0000277235),该基因包含1 704 bp开放阅读框,编码566个氨基酸,蛋白大小为56 kD。构建MdSUT2表达载体并利用农杆菌介导法侵染拟南芥,半定量RT-PCR证明Md SUT2在拟南芥中异源表达。构建瞬时表达载体,‘红星’苹果进行Md SUT2瞬时表达,其花青苷含量增多,而沉默该基因花青苷含量明显降低。     

豆梨NAC转录因子基因PcNAC1的克隆、亚细胞定位及功能初探

根据豆梨(Pyrus calleryana Dence)接种黑斑病菌后的转录组测序结果,筛选出一个上调表达的NAC转录因子基因。从豆梨中获得了该基因的全长片段,并将其命名为PcNAC1。该基因的开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。将PcNAC1蛋白序列与其他物种蛋白序列进行对比,并构建系统进化树后发现,其与小麦TaNAC4及拟南芥ATAF1具有较高同源性。通过实时荧光定量分析PcNAC1在豆梨不同组中的表达发现,PcNAC1在茎、叶和根中表达量较高,在花和果中表达量较低。构建了亚细胞定位载体,瞬时侵染本氏烟,通过激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内的分布情况,发现该基因行使功能的主要区域定位在细胞核。进一步在本氏烟中瞬时表达PcNAC1,接种烟草疫霉病菌后发现PcNAC1可以通过调控植物激素通路防卫反应基因的表达来增强植物的抗病性。     

桃PpIDD11调控花发育的功能研究

从‘秋蜜红’桃中克隆到1个IDD转录因子基因PpIDD11。结果显示：PpIDD11编码区全长1 575 bp,编码524个氨基酸,具有保守的ID域。烟草亚细胞定位显示PpIDD11蛋白定位于细胞核,酵母转化试验表明其具有酵母转录自激活活性。荧光定量PCR分析显示PpIDD11主要在花器官中表达,特别在雌蕊中转录水平最高。过表达PpIDD11拟南芥株系出现了柱头高于野生型、荚果变短且结实率下降的表型,同时也出现了莲座叶叶片卷曲、植株变矮的现象。转录组测序分析显示,PpIDD11转基因拟南芥株系共有上调基因3 378个,下调基因3 156个,其中包含LOX4、LOX3、GLC、E6L1等花器官发育调控基因。     

枳橙CPMAX2基因的克隆、载体构建及其表达研究

转rolABC基因枳橙莲座状分枝、矮化性状突出。为探索其侧枝生长的植物激素调控机制,通过RT-PCR法从枳橙中克隆到独脚金内酯信号转导关键元件CPMAX2基因,分析了该基因在转rolABC基因枳橙腋生嫩叶中的转录表达,构建了CPMAX2植物过表达载体。研究表明：CPMAX2与甜橙中同源基因一致性为99.66%,编码694个氨基酸,具有一个典型的F-box蛋白结构域和两个LRR重复区,与甜橙MAX2氨基酸序列一致性为99.14%。CPMAX2在转rolABC基因枳橙3个株系腋生嫩叶中的转录表达均比野生型显著下调。试验表明CPMAX2在转rolABC基因枳橙莲座型分枝生长中扮演重要角色。     

森林草莓FvbHLH130转录因子调控植株提前开花

分析草莓碱性螺旋—环—螺旋（basichelix-loop-helix,bHLH）转录因子家族,鉴定到森林草莓（Fragaria vesca）花特异表达的转录因子基因FvbHLH130。FvbHLH130编码区序列长度为960 bp,编码319个氨基酸,保守结构域预测结果显示第247～297 aa是bHLH结合域,其属于bHLH家族成员。FvbHLH130启动子含有生长素等激素响应、逆境胁迫和低温响应元件,推测基因表达可能受到生物和非生物胁迫诱导。FvbHLH130蛋白氨基酸序列与月季（Rosa chinensis）的相似性高达93.70%,与其他蔷薇科bHLH蛋白聚在一个分支上,与拟南芥AtFBH4是同源蛋白。农杆菌介导的FvbHLH130拟南芥转基因株系提前7 d开花,且促进开花相关基因AtAP1、AtFT、AtFUL和AtCO的表达。酵母双杂交实验结果表明FvbHLH130与FvARF4和FvARF6互作,可能作为蛋白复合体共同参与开花调控。     

拟南芥RNA 加工因子的开花调控机制

开花调控是植物生长发育中很重要的过程。拟南芥分子遗传学分析表明，MADS-box 转录因
子FLC、RNA 结合蛋白（FCA、FPA 和FLK）和mRNA 3′ 端加工因子（FY）都参与了这一过程。开花因
子通过抑制FLC 表达来促使植物开花；RNA 结合蛋白通过转录后调控来调节FLC 的表达以调控拟南芥开
花。此外，microRNAs 也参与这一过程。本文通过综述上述几个相关因子的调控过程，来阐述RNA 加工
因子参与的拟南芥开花调控机理。     

甘蓝型油菜DOF蛋白基因的克隆与生物信息学分析

Dof转录因子是植物特有的一类转录因子,含有一个独特的单锌指结构域,在植物的生长发育中起重要的调控作用。以甘蓝型油菜为试材,采用电子克隆和RT-PCR技术,以期克隆一个具有Zf-Dof结构域的蛋白基因cDNA序列。结果表明:该基因含有1284bp的开放阅读框,编码427个氨基酸,蛋白分子量为46.9kDa,等电点为8.86,为亲水性蛋白。经序列比对分析表明其与拟南芥CDF3基因有较高同源性,可能具有相似的功能。     

MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因(序列号:MDP0000894463)。该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框,编码243个氨基酸,预测其蛋白质分子量为26.34 kD,等电点为9.29。系统进化树分析表明,这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高,因此将其命名为MdMYB73。功能域分析表明,MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-typeMYB绑定域。荧光定量PCR分析表明,MdMYB73在苹果的各个组织均有表达,在叶片和花中表达相对较高;MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定,结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性;同时,AtSOS1,AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低,表明MdMYB73可能负调控SOS反应,影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织,抗盐表型分析表明,MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。     

梨果实钾转运体基因PbKT12的克隆与功能验证

PbKT12是基于梨果实转录组分析筛选出的对施钾有强烈响应的钾转运体基因，本研究中进一步验证其功能。以‘黄冠’(PyruspyrifoliaNakai)梨果实为材料克隆得到PbKT12全长序列，分析表明该基因序列共2 730 bp，编码909个氨基酸；序列对比表明PbKT12与苹果中同源蛋白氨基酸序列相似性高达97%。亚细胞定位结果显示，PbKT12定位于细胞质膜上。PbKT12转化钾吸收缺陷型酵母R5421在低于5 mmol·L^-1 K⁺的培养基上能够恢复生长。qRT-PCR结果表明，PbKT12在梨果实和叶片中的相对表达量随盆栽土壤施钾水平增加而升高。使用农杆菌侵染花序法将PbKT12导入拟南芥，与野生型拟南芥相比，过表达PbKT12拟南芥植株的生长速度比野生型更快，抽薹、开花时间更早，植株葡萄糖积累量更高。采用X射线荧光光谱仪无损检测K+在拟南芥植株中的分布发现，在缺钾胁迫下过表达PbKT12拟南芥中K+向花序运输的量增加。因此推断，PbKT12在梨果实中具有促进K+转运和葡萄糖积累的作用。     

芍药PlSVP基因的克隆及其花期调控功能分析

从芍药（Paeonia lactiflora）中克隆SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)基因,研究其对花期的调控功能,为芍药分子育种储备重要基因资源。采用RT-PCR方法从‘大富贵’芍药中克隆了PlSVP基因,其开放阅读框包含687bp碱基,编码228个氨基酸。系统进化树分析发现,PlSVP编码的蛋白与同属的牡丹PsSVP蛋白亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果表明,PlSVP主要在营养器官中表达,在根中表达量最高,其次是叶片;在生殖器官花瓣中表达量极低。将PlSVP转化入哥伦比亚型野生型拟南芥,发现转PlSVP基因的株系较野生型的抽薹、开花时间分别延迟7和15d;在拟南芥svp-41突变体中过表达PlSVP发现,其不再呈现早抽薹、早开花表型,即PlSVP基因回补了svp-41突变体的功能缺失。进一步比较研究表明,拟南芥转PlSVP基因植株中FT、SOC1、LFY、AP1等SVP下游开花促进基因的表达量均显著下调。以上结果表明,芍药PlSVP基因负调控植物开花时间,并且可能通过抑制FT、SOC1、LFY、AP1等基因表达而发挥其负调控功能。     

苋菜中甜菜红素代谢相关基因AmMYB2的表达与功能分析

为了研究AmMYB2基因在苋菜(Amaranthus tricolor)甜菜红素合成中的作用,对红色苋菜品种‘大红’AmMYB2(登录号为KY814751.1)进行生物信息、基因表达及功能分析。结果表明:AmMYB2的开放阅读框(ORF)全长为678 bp,编码蛋白分子质量为25.96 kD,该蛋白具有R2R3型MYB结构域,属于R2R3型MYB转录因子。核酸序列分析结果显示,AmMYB2与甜菜红素合成相关的甜菜BvMYB1和苋菜AmMYB1的相似度分别达到62.11%和49.93%。亚细胞观察显示,AmMYB2蛋白定位于细胞核。实时荧光定量(qPCR)分析发现,AmMYB2在红色苋菜品种的表达量高于绿色苋菜品种;在‘大红’苋菜中,不同组织以及叶片不同部位中AmMYB2的表达量与甜菜红素含量成正比。构建AmMYB2过表达载体,将其转入烟草和拟南芥中,发现该基因能够在这两种植物中高水平表达,但不会引起颜色变化,揭示AmMYB2可能是苋菜中甜菜红素合成的正调控因子,可能不参与花青素的合成。     

菜薹BrNAP克隆及其在采后叶片衰老中的功能分析

在菜薹(Brassica rapa var. parachinensis)中克隆Br NAP1并分析其功能。Br NAP1编码区全长813 bp,编码270个氨基酸,具有NAP转录因子特有的保守结构域,属于NAP亚家族成员。Br NAP1表达量与叶片衰老程度呈正相关且受ABA诱导表达上调。亚细胞定位试验表明Br NAP1定位于细胞核。互补试验显示Br NAP1能使拟南芥atnap滞绿表型回复至野生型,过表达则能引起采后叶片早衰。双荧光素酶试验表明Br NAP1能够激活Br SAG113表达。这些说明Br NAP1是菜薹采后叶片衰老的正调控基因。     

菠萝锌指蛋白基因AcRCHYI的克隆与表达分析

根据植物C3HCA型兼CHY型锌指蛋白的功能保守区设计简并引物,通过RT-PCR结合RACE方法从菠萝(Ananas comosus L.Merr)幼苗中克隆获得了一个新的菠萝锌指蛋白基因cDNA全长,将其命名为AcRCHY1.该基因cDNA全长1 261 bp,开放阅读框ORF为918 bp,推测其编码一个含有306个氨基酸残基的多肽.AcRCHY1蛋白具有保守的C3HC4(RING finger)和CHY两个锌指结构域,与其它植物锌指蛋白的同源性高达81%-91%.半定量RT-PCR分析表明,AcRCHY1在菠萝中呈组成性表达,在子房、花瓣和小花中的表达量明显高于根和叶;低温、高盐、干旱和ABA等非生物胁迫处理后,AcRCHY1在叶片中的表达明显增强.因此,AcRCHY1蛋白可能与花器官生长发育的调控有关,而且可能作为一个转录调控因子在菠萝响应低温、高盐和渗透胁迫过程中参与了依赖ABA的信号转导途径.     

苹果MdAFS叶绿体定位表达对拟南芥萜类挥发物的影响

以‘青香蕉’苹果(Malus×domestica‘White Winter Pearmain’)α–法尼烯合酶基因(MdAFS)为目标基因,构建叶绿体定位的植物过表达载体,并通过农杆菌介导遗传转化拟南芥,获得使MdAFS在叶绿体中过表达的拟南芥转基因株系。将pBI122-rbcS1-pla-MdAFS-GFP表达载体瞬时表达本氏烟,分析表明叶绿体定位肽能成功将MdAFS蛋白定位到叶绿体中。定量测定莲座期和盛花期拟南芥光合色素,结果显示,转基因拟南芥叶绿素和类胡萝卜素含量较野生型显著增加。qRT-PCR分析萜类代谢相关基因转录表达水平表明,尤其在盛花期,过表达MdAFS能显著影响萜类代谢基因表达上调。应用静态顶空固相微萃取法收集拟南芥挥发物并结合GC–MS分析鉴定萜类挥发物成分,转基因拟南芥中萜类挥发物含量和种类明显增加。这些结果表明,过表达MdAFS能显著影响萜类代谢流的重新定向,增加萜类代谢挥发物。叶绿体是萜类代谢工程一个理想的亚细胞空间。     

番木瓜CpWRI3参与调控果实成熟过程中脂肪酸合成

以番木瓜（Carica papaya L.）果实为研究材料，通过前期构建的果实成熟数字基因表达谱，克隆得到1个编码WRI家族调控因子的基因，命名为CpWRI3。氨基酸序列比对和进化分析发现CpWRI3与拟南芥AtWRI3/4同源性较高。转录因子活性分析表明，CpWRI3具有一定的转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明，CpWRI3的表达水平随着果实成熟不断升高，采后8 d达到峰值，表明其在果实成熟的后期发挥重要作用。在果实中瞬时过量表达CpWRI3促进了月桂酸、棕榈油酸和亚油酸含量的提升。体外凝胶阻滞试验（EMSA）证实CpWRI3能与下游靶基因Cp KAS1和Cp ACC1启动子上AW-box元件的序列特异结合。利用荧光素酶系统进一步证明CpWRI3可以在植物体内诱导CpKAS1和CpACC1启动子的表达。上述结果表明CpWRI3能参与调控月桂酸、棕榈油酸和亚油酸等脂肪酸合成。     

芹菜AgERF4转录因子基因的克隆与表达分析

以‘六合黄心芹’芹菜为材料,克隆出编码乙烯反应元件结合蛋白基因AgERF4。序列分析表明,AgERF4含有1个长度为597 bp的开放阅读框,编码198个氨基酸,预测其蛋白质相对分子质量为21.43 kD,等电点为8.51。进化分析表明,ERF4转录因子在植物中高度保守。AgERF4属于亲水性蛋白。酵母单杂交和β–半乳糖苷酶活性测定结果确定AgERF4转录因子和乙烯应答元件GCC Box具有较高的结合活性。RT-qPCR分析表明,AgERF4在芹菜叶片中的表达水平较高,在根和叶柄中表达水平较低;高温和干旱条件下AgERF4的表达呈先上升后下降的趋势,在盐处理的24 h内AgERF4的表达始终高于对照。AgERF4转录因子在芹菜非生物逆境胁迫调控过程中起着重要作用。     

牡丹PobZIP1在种子发育中的表达及其与ABA含量的关系

 采用RT-PCR方法从‘凤丹’牡丹（Paeonia ostii‘Fengdan’）种子中克隆得到1个与ABA信号途径相关的转录因子基因PobZIP1,并利用超高效液相色谱—串联质谱（UPLC–MS/MS）的方法测定了不同发育时期种子的ABA含量。PobZIP1 cDNA全长957 bp,编码318个氨基酸,其编码的蛋白C末端含有bZIP转录因子的典型结构域,GenBank登录号为KJ009392。PobZIP1蛋白与拟南芥bZIP转录因子聚类分析显示,PobZIP1转录因子属于拟南芥bZIP转录因子的A亚族,与AtbZIP39/ABI5聚在一起。与其他物种bZIP蛋白的系统进化分析表明,牡丹PobZIP1与蔷薇科的苹果bZIP亲缘关系最近。SqRT-PCR结果表明：PobZIP1在‘凤丹’牡丹根、茎、叶和花芽中均有表达,其中花芽中的表达量最低,根、茎、叶中的表达量相近。在种子发育过程中,PobZIP1的表达呈现出先增加后降低的趋势。ABA含量测定结果显示,随着种子的发育ABA含量迅速上升,达到最大值后缓慢下降并保持在较高水平。推测种子发育后期,较高含量的ABA和表达相对较高的PobZIP1可能是诱导种子休眠形成的原因。     

花青苷生物合成转录调控研究进展

 花青苷生物合成由一系列结构基因编码的酶催化完成,而结构基因的表达受MYB、bHLH 和WD40 这3 类转录因子组成的MBW（MYB-bHLH-WD40）转录复合体的协同调控。花青苷合成的转 录调控研究最先在30 多年前见于玉米、拟南芥和矮牵牛等模式植物,近年来在肉质果实上也取得了重要 进展。在介绍果实花青苷的种类、分布与功能的基础上,回顾了MYB、bHLH、WD40 这3 类转录因子 的基本特性及其在花青苷合成调控中的作用,进而就MBW 转录复合体协同调控果实花青苷生物合成的 机制研究的近年进展进行了综述。     

冷诱导转录因子CBF3 转化茄子的初步研究

成功构建了含冷诱导转录因子CBF3（ CRT binding factor）的植物表达载体,通过农杆菌介
导法转入三月茄,采用PCR 检测DNA 和卡那霉素涂抹叶片法进行田间抗性鉴定,证实获得含抗寒基因
CBF3 的茄子转基因植株2 株,建立了抗寒的茄子再生与转化技术体系。