Bt基因转入烟草叶绿体获得转化植株的研究

构建了苏云金杆菌晶体毒蛋白基因Cry1Ab的烟草叶绿体表达载体pCTBt,该载体以烟草叶绿体基因组trnI-trnA为同源重组片段,含有壮观霉素抗性筛选标记基因aadA、质体特异性启动子Prrn和终止子TpsbA.利用基因枪转化法,将pCTBt导入栽培烟草红花大金元叶绿体,经过4次继代筛选,获得9个抗壮观霉素的转化株系,转化频率为0.3～0.6株/枪,其中有5个株系PCR检测结果为阳性,初步确定Cry1Ab基因已整合到烟草叶绿体中.转基因烟草抗斜纹夜蛾试验表明,幼虫死亡率为10%～75%,转基因烟草植株具有较好的杀虫活性.     

转叶绿体超氧化物歧化酶基因水稻的获得

[目的]研究转叶绿体超氧化物歧化酶（SOD）基因水稻的获得。[方法]在构建叶绿体超氧化物歧化酶基因转化载体的基础上,采用农杆菌侵染法,使用C418作为筛选剂,经筛选和分化获得转基因植株,并对其进行PCR检测。[结果]确定G418的最佳浓度为200mg／L,采用尽可能短的筛选时间获得了好的转化效果,最终获得237株再生苗;经PCR检测,65株呈阳性,转化率为27％。[结论]确定了G418的筛选效果,为其进一步应用提供科学依据。     

叶绿体基因组的转化研究

叶绿体基因组的转化研究日益为人们认识并重视,成为细胞遗传工程研究的新方向.转化的筛选标记基因主要有四种:突变型16S rRNA基因、NPT II基因、荧光标记基因、aadA基因.本文着重介绍了叶绿体转化中载体导入的方法、转化后的同质化和叶绿体转化的优点.     

不同耐盐性水稻幼苗叶绿体光能转化特性对盐胁迫的反应

[目的]探讨盐逆境下光合器官的光合潜力,为提高全株光合能力提供理论依据。[方法]以耐盐性不同的水稻品种Pokkali(耐盐)、Peta(盐敏感)幼苗为材料,研究叶绿体光能转化对盐胁迫的响应。[结果]结果表明:随着NaCl胁迫浓度和时间的增加,2个水稻品种净光合速率、叶绿体放氧活性、ATP含量下降;100 mmol/L NaCl胁迫下,叶绿体ATP酶活性先上升后基本不变,叶绿体光合磷酸化活力先上升后下降;200 mmol/L NaCl作用下,叶绿体ATP酶、叶绿体光合磷酸化活性一直下降;且耐盐品种Pokkali下降的程度明显小于盐敏感品种Peta。[结论]盐胁迫下耐盐品种叶绿体光能转化能力强于盐敏感品种。     

用于叶绿体基因组转化的马铃薯高效再生体系的建立

云南马铃薯不同品种、不同外植体类型的植株再生能力差异极大.阿诗洋芋、K-18、287、丽薯3号、丽薯4号和紫依的分化率较低,在0～27.8%.多数品种带叶柄的叶片再生能力大于叶盘,茎段分化率最低.会-2是最易诱导植株再生的品种,不同外植体的分化率在20.8%～92.2%,叶盘分化率最高,达92.9%,且平均分化芽数达8.2个,适合于会-2的壮观霉素浓度为100 mg/L.筛选出了用于叶绿体转化的马铃薯会-2的高效再生体系和壮观霉素浓度,为Bt基因导入马铃薯叶绿体基因组奠定了基础.     

基因枪法获得GNA转基因小麦植株的研究

 以小麦品种京 411作为基因枪转化的靶材料 ,取其未成熟胚诱导愈伤组织 ,经过 10 d左右培养后 ,用含有雪花莲凝集素 (Galanthus nivalis agglutinin ,GNA)和 bar基因的质粒 p BI12 1- 2轰击 80 0个胚性愈伤组织 ,在含有4mg/ L Basta溶液的培养基上进行筛选 ,分化及生根培养 ,获得 6 7棵再生植株。田间涂抹 Basta溶液 (5 0、75 m g/ L)检测和接麦蚜实验 ,提取转基因植株基因组 DNA,用扩增 GNA基因的引物经 PCR扩增 Southern杂交 ,结果表明利用基因枪转化已从 T2 代获得了 8株含有编码 bar/ GNA基因的转基因植株。     

胡萝卜遗传转化体系的建立

以新黑田五寸胡萝卜下胚轴为外植体,研究对胡萝卜抗性植株的影响因素及目的基因的整合情况,建立了较为完善的转化体系。实验结果表明:以胡萝卜下胚轴为材料,用苗龄7d,共培养2d,浸染15min的体系,Kan抗性芽的分化频率可达52%。获得抗性愈伤培养基:B5+0.1mg/L2,4-D+0.2mg/LKT+75mg/LKan+500mg/LCef,抗性芽诱导培养基:B5+100mg/LKan+500mg/LCef;抗性植株生根培养基:B5+0.1mg/LIBA+75mg/LKan+300mg/L:Cef;对转基因植株进行了PCR分子学检测,初步证明外源基因已整合到胡萝卜基因组中。     

农杆菌介导的水稻转化及bar基因稳定遗传

以秀水11、072和ZH9905的胚性愈伤组织为受体，通过农杆菌介导法将抗除草剂基因bar导入水稻基因组，经PCR、Southern杂交分析获得大量转基因植株。除草剂喷洒试验表明，转基因水稻对除草剂Basta具有高度的抗性。对R1代植株分析表明外源基因已遗传给后代，部分株系的分离比率符合3：1。对部分转基因水稻植株考察结果表明，部分转基因植株的农艺性状与亲本相似，但育性下降。     

用花粉管通道法将bar基因导入水稻获得可遗传的转基因植株

利用花粉管通道法将抗Basta除草剂的bar基因导入水稻品系“E32” ,获得转基因植株。抗性鉴定表明 ,转基因植株能充分表达对Basta除草剂的抗性 ;通过对转基因植株后代进行PCR分析 ,证实bar基因已整合到受体植株的基因组中。遗传分析表明 ,bar基因能在有性生殖过程中传递给后代 ,并在T3 代开始分离出抗性一致的稳定株系     

基因枪介导转化水稻花药愈伤获得抗白叶枯病转基因植株

以质粒pBI121作外源DNA，对基因枪介导转化水稻花药愈伤的有关参数进行了优化，优化值分别为射程9cm，枪膛氦气压力1100psi，真空度3600－3733Pa，轰击次数2次。轰击前后愈伤经0.4mol/L甘露醇处理可提高转化效率。在优化条件下将Xα21基因导入籼型光敏核不育水稻W9451S，获得了单倍体植株，经人工染色体加倍得倒二倍体转基因植株。白叶枯病菌接种鉴定结果表明其抗性有明显提高。     

Establishment of a Gene Expression System in Rice Chloroplast and Obtainment of PPT-Resistant Rice Plants

In contrast to the situation of random integration of foreign genes in nuclear transformation, the introduction of genes via chloroplast genetic engineering is characterized by site-specific pattern via homologous recombination. To establish an expression system for alien genes in rice chloroplast, the intergenic region of ndhF and trnL was selected as target for sitespecific integration of PPT-resistant bar gene in this study. Two DNA fragments suitable for homologous recombination were cloned from rice chloroplast genome DNA using PCR technique, and the chloroplast-specific expression vector pRB was constructed by fusing a modified 16S rRNA gene promoter to bar gene together with terminator ofpsbA gene 3 sequence. Chloroplast transformation was carried out by biolistic bombardment of sterile rice calli with the pRB construct. Subsequently, the regenerated plantlets and seeds of progeny arising from reciprocal cross to the wild-type lines were obtained. Molecular analysis suggested that the bar gene has been integrated into rice chloroplast genome. Genetic analysis revealed that bar gene could be transmitted and expressed normally in chloroplast genome. Thus, the bar gene conferred not only selection pressure for the transformation of rice chloroplast genome, but PPT-resistant trait for rice plants as well. It is suggested that an efficient gene expression system in the rice chloroplast has been established by chloroplast transformation technique.     

水稻多逆境响应新基因OsMsr9的表达与克隆

为发掘水稻新的耐逆基因,研究植物在应答逆境胁迫时的分子机制,我们采用Affymetrix水稻表达芯片分析了超级稻两优培九母本培矮64S全基因组在多种逆境胁迫下的表达水平,筛选出一批表达水平显著改变的基因。其中基因OsMsr9(Oryza sativa L.Multiple Stresses Responsive Gene9,GenBank登录号为EU276058)的表达量在高温、低温、干旱处理后在多个组织器官、发育时期均有显著提高。实时定量PCR分析其特定时空表达量的结果与基因芯片的结果基本吻合。通过RT-PCR法,得到包含OsMsr9完整ORF(open reading frame)的cDNA克隆。根据生物信息学分析,该ORF编码一个包含168个氨基酸残基的蛋白质,与玉米(Zea mays)中含F-box结构域的全长蛋白有大约58%的相似性,而F-box蛋白可能与植物抗逆性有关。基于上述实验及分析结果,OsMsr9可能是一新的水稻耐逆功能基因。     

低温对水稻幼苗叶绿体自发荧光及抗氧化系统的影响

以高产杂交稻两优培九和常规杂交稻汕优63为材料,研究10℃夜间低温处理对水稻幼苗叶绿体自发荧光强度及抗氧化系统的影响。与同时期的常温对照相比,两优培九的SOD、GR、CAT、POD酶活性的上升幅度要强于汕优63,而汕优63的GSH、ASA含量的上升幅度要强于两优培九。两优培九的O2-和MDA的积累少,叶绿体自发荧光强度降低程度小于汕优63。表明两优培九幼苗的抗冷性优于汕优63。胁迫后期,两优培九中一些保护酶类活性低于对照,O2-产生速率和MDA含量高于对照,表明此时活性氧清除系统的平衡已被破坏。     

水稻TWH1基因启动子的克隆及表达分析

启动子是基因表达的重要调控元件。利用PCR方法克隆了控制水稻颖壳发育的候选基因TWH1的启动子,并将启动子片段与GUS报告基因融合构建了重组表达载体。通过农杆菌介导的方法将其导入水稻愈伤组织,转基因植株经GUS染色分析显示,各个发育时期的茎秆、叶片、叶鞘、雌雄蕊和孕穗期的颖壳中都有GUS活性表达,但在根和抽穗后的颖壳中未检测到GUS活性。该结果对进一步研究TWH1基因的功能奠定了基础。     

外源基因异常分离的抗除草剂水稻9311HR bar基因的遗传传递

在以基因枪转化获得的抗除草剂转bar基因材料HR为供体亲本,9311为受体亲本的回交转育过程中,发现回交转育后代9311HR抗性单株自交后代中bar基因始终表现1∶1的异常分离。以9311HR抗性单株作母本,与常规非转化品种杂交获得的F1,除草剂抗性植株和非抗性植株比例为1∶1;以9311HR抗性单株作父本,与常规非转化不育系的杂交后代均不抗除草剂。PCR分析结果显示,F1抗性植株PCR扩增呈阳性,非抗性单株PCR扩增呈阴性。上述结果表明,9311HR中外源基因bar仅能通过雌配子传递给后代,而不能通过雄配子即花粉传递给后代。推测HR中bar基因的插入位点可能与某一育性相关基因紧密连锁。     

外源基因异常分离水稻9311HR的雌雄配子育性

在以基因枪转化获得的抗除草剂转bar基因材料HR为供体亲本;以9311为受体亲本的回交转育过程中,发现回交转育后代9311HR的抗性单株自交后代中bar基因始终表现1∶1的异常分离.以外源基因异常分离水稻9311HR为材料,探讨bar基因的导入对其主要农艺性状、花粉育性、花粉萌发率的影响.结果表明:抗除草剂bar基因的导入对目标亲本的主要农艺性状无明显影响,9311HR抗性植株正常染色花粉率及花粉离体萌发率均在90%左右,其结实率正常,与轮回亲本9311均无显著差异.花粉DNA的PCR分析结果显示,9311HR抗性植株形成了携带外源基因bar的成熟花粉.说明9311HR抗性植株不存在雌雄配子败育.     

Identification and Gene Mapping of Completely Dominant Earliness in Rice

The completely dominant earliness was identified in a genic male-sterile and early maturing indica line 6442S-7. F1 progenies from 6442S-7 crossed with thirteen various types of medium- or latematuring varieties, shared the same heading date as 6442S-7. The segregation of heading date in the F2 and B1F1 populations showed that the earliness of 6442S-7 is mainly controlled by two dominant major genes. The local linkage map of one dominant earliness gene harbored in 6442S-7 was constructed with F2 population and four kinds of molecular marker techniques. The results showed that the gene was located between a RFLPmarker C515 and a RAPD marker OPI 11. 557 on the terminal region of short arm of rice chromosome 3,10.9cM and 1.5 cM from C515 and OPI11. 557, respectively. The genetic distances from the target gene to twoSSR markers, RM22 and RM231, and one AFLP marker, PT671, were 3.0, 6.7 and 12.4 cM, respectively. This gene, being identified and mapped first, is designated tentatively as Ef-cd (t). As a new genetic resource of completely dominant earliness, 6442S-7 has splendid future in rice improvement.     

Advances in Insect-resistant Transgenic Rice and Its Developing Tendency

Focusing on several commonly used insect resistance genes,we reviewed the advances in insect-resistant transgenic rice,and analyzed the problems and developing tendency in transgenic rice research in this paper.     

大豆铁结合蛋白基因在旱稻中的表达及铁含量分析

【目的】尝试利用转基因方法提高旱稻铁含量。【方法】采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启动子GluB-1驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2个优良旱稻品种“旱稻297”和“旱稻277”。利用PCR、Southern杂交分析方法验证转化结果。【结果】转基因植株T1代RT-PCR证明，外源基因在种子中特异表达。T1～T3代的PCR检测证明铁结合蛋白基因已经稳定遗传。多数转基因植株T0～T3代种子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2倍以上。【结论】利用基因枪和农杆菌转化法可将大豆铁结合蛋白基因导入旱稻基因组中，并使转基因稻米铁含量增高。