南药巴戟天毛状根诱导条件优化研究

为探索巴戟天毛状根的诱导条件,该研究选择不同发根农杆菌ATCC15834、AR10、Msu440菌株诱导巴戟天无菌苗的幼芽、叶片、叶柄、茎段等外植体形成毛状根,并研究了共培养时间和乙酰丁香酮(AS)浓度等因素对巴戟天毛状根转化率的影响。结果表明:巴戟天毛状根的最佳诱导条件为:以幼芽为外植体,ATCC15834为转化菌,侵染时间20 min,并在培养基中添加300μmol/L乙酰丁香酮条件下,巴戟天毛状根的诱导转化率最高,可达36.7%。     

几种因素对银杏毛状根诱导和黄酮含量的影响

考察了发根农杆菌菌种、侵染时间、外植体类型、培养基类型和乙酰丁香酮5个因素对银杏毛状根诱导的影响,以及比较了后二因素对毛状根黄酮积累的影响。结果表明：以银杏胚为外植体,A4活化菌液中加入乙酰丁香酮100μmol·L^-1侵染15 min,再在MS培养基上培养发根率最高。乙酰丁香酮对毛状根中黄酮的积累没有显著促进作用,浓度高于120μmol·L^-1还会严重抑制发根。     

花生毛状根诱导及其体外培养

[目的]优化花生毛状根诱导条件,为体外培养毛状根生产白藜芦醇以及培养花生根结线虫奠定基础。[方法]研究不同的发根农杆菌及其菌液浓度、外植体类型、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度对花生毛状根诱导的影响。[结果]发根农杆菌ACCC10060的毛状根诱导率高于ATCC11325;幼叶外植体的毛状根诱导率高于子叶;最佳侵染菌液浓度为0.2～0.4;最佳共培养时间为2 d;最佳侵染时间为10～15 min;菌液中添加75μmol/L乙酰丁香酮(AS)可以提高毛状根诱导率。通过毛状根能在无激素的MS培养上自主生长以及毛状根冠瘿碱检测,确定发根农杆菌中Ri质粒中已整合到花生基因组中。毛状根体外培养的研究表明,液体培养效果好于固体培养,最佳液体培养基为无激素的MS培养基。[结论]该研究建立的花生毛状根培养体系,将为花生转基因技术的完善及利用毛状根生产白藜芦醇和无菌的花生根结线虫提供试验基础。     

发根农杆菌诱导苦参毛状根的研究

[目的]为苦参有用成分的大量生产提供新的途径。[方法]利用发根农杆菌R1601分别对药用植物苦参的根段、茎段、叶片、子叶进行侵染。[结果]在相同条件下,叶片、茎段和根段成功诱导出毛状根,但诱导频率不同,茎段作为外植体诱导率最高,达到26.7%,更适合作为外植体选用。毛状根除菌后,能在MS培养基上自主生长。[结论]发根农杆菌的RiT-DNA基因已经整合到苦参基因组中。该研究为采用生物技术生产苦参活性成分奠定了基础。     

发根农杆菌介导的花生遗传转化体系的建立

[目的]为花生的转基因研究和白芦藜醇的生物技术生产奠定基础。[方法]利用发根农杆菌R1601分别侵染花生的子叶、叶片和茎段,诱导毛状根;利用PCR技术检测毛状根。[结果]叶片和茎段在发根农杆菌R1601侵染后产生毛状根,但叶片诱导率较高,其诱导率达65.6%,更适合作为转化外植体。毛状根除菌后,能在MS培养基上自主生长。PCR扩增表明,T-DNA序列整合进花生的基因组中。[结论]建立了发根农杆菌介导的花生遗传转化体系。     

农杆菌介导大豆萌动种子遗传转化的影响因素研究

[目的]提高农杆菌介导大豆遗传转化效率。[方法]以萌发1 d的半片大豆种子为目标组织,通过GUS瞬时表达检测,研究乙酰丁香酮、菌液的浓度及侵染时间对转化效率的影响。[结果]在共培养基中添加200μmol/L的乙酰丁香酮时,GUS瞬时表达效率最高。当农杆菌生长到对数生长期(D600 nm=0.5)时,转化效率最高,平均每个外植体上出现9.4个蓝色斑点。农杆菌侵染时间不宜过长,以30~60 min较好。[结论]乙酰丁香酮浓度、农杆菌菌液浓度和侵染时间均影响农杆菌介导大豆遗传转化效率。     

罗勒毛状根的诱导及培养

[目的]利用4种发根农杆菌R1,R1601,1025,1000诱导药用植物罗勒产生毛状根,建立毛状根培养体系。[方法]利用共培养法研究不同外植体、菌株、预培养时间、感染时间以及外源激素等对罗勒毛状根诱导率的影响。[结果]利用发根农杆菌1025,预培养2d的叶片为转化材料,感染6～8min,加入0.1mg/LNAA的诱导率最高。经过基本培养基的筛选和毛状根生长动力学的考察,确立罗勒毛状根在1/2MS培养基中的最佳继代时间为21d。[结论]罗勒毛状根离体培养的建立,为进一步进行药用活性成分的工业化生产奠定了基础。     

乌拉尔甘草毛状根的诱导及培养体系的建立

采用针刺幼茎法和外植体共培养法,以发根农杆菌ATCC15834和A4侵染乌拉尔甘草子叶、下胚轴和活体幼苗,诱导毛状根生成,建立毛状根诱导及培养技术体系。试验结果表明,OD₆₀₀为0.5～0.6的ATCC15834菌液（含乙酰丁香酮100 μmol/L）经针刺幼茎法侵染株龄14 d的乌拉尔甘草活体幼苗后,在含500 mg/L头孢霉素的1/2MS培养基上毛状根诱导率达79.2%。毛状根在不含激素及蔗糖质量浓度为40.0 g/L的1/2MS液体培养基中生长迅速,25 d毛状根增殖率达到19.3倍。     

农杆菌Ri诱导丹参毛状根培养体系的优化

采用发根农杆菌R1601菌株浸染丹参叶片、茎段、叶柄、带节茎段等外植体.结果表明,相比茎和叶柄,丹参叶片更适宜诱导毛状根;带节茎段经发根农杆菌R1601侵染后,幼苗根系较为发达,粗壮.而由其他3种丹参外植体诱导产生的毛状根生长相对较慢,形成的根较细而弱.     

乌克兰龙葵毛状根诱导条件优化

[目的]利用3种发根农杆菌A4、C58C1、A1476诱导乌克兰龙葵产生毛状根,探究乌克兰龙葵毛状根诱导的最佳条件。[方法]利用植物组织培养技术,研究不同外植体、菌株、侵染时间、预培养天数、菌液浓度和共培养天数等对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影响。[结果]叶片为最佳外植体材料;3种菌株均能诱导出毛状根,但A4诱导率最高;最佳菌液浓度为OD600=0.6;最佳侵染时间为5 min;预培养和共培养均为2 d时诱导率最高。[结论]乌克兰龙葵毛状根诱导条件的优化,为其他植物毛状根诱导提供参考,同时为进一步利用植物毛状根生产药用成分提供试验基础。     

HPLC法测定苦参碱类生物碱传递体包封率

高速离心分离游离的苦参碱(MAT)和氧化苦参碱(OMT),应用HPLC法测定MAT和OMT的浓度并计算包封率,建立苦参碱类生物碱传递体包封率的HPLC测定方法。结果显示,MAT进样量在0.074~0.370μg/mL、OMT进样量在0.263~1.315μg/mL时,两者峰面积与进样量具有良好的线性关系。在高加样量0.148μg/mL和低加样量0.111μg/mL下,MAT的平均加样回收率分别为100.2%和98.2%,RSD分别为1.07%和2.38%;OMT的平均加样回收率分别为98.3%和100.2%,RSD分别为0.75%和0.66%。制剂中MAT和OMT的包封率分别为80.43%和74.70%,RSD分别为1.03%和1.11%。建立的方法适用于苦参碱类生物碱传递体包封率的测定。     

发根农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系的建立

[目的]建立新的橡胶树遗传转化体系,为利用基因工程技术研究橡胶树提供基础。[方法]利用发根农杆菌R1601、15834和1.2556 3个株系分别侵染橡胶树热研7-33-97的叶片和茎段,诱导毛状根,并利用PCR技术检测诱导得到的毛状根。[结果]在相同的条件下,仅橡胶树茎段在发根农杆菌R1601侵染后产生毛状根,其诱导率达36.6%;PCR结果表明,T-DNA序列已整合进橡胶树的基因组中。[结论]初步建立了发根农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系。     

乙酰丁香酮对组培芦竹不定芽诱导和生长的影响

[目的]研究组培条件下乙酰丁香酮(AS)对芦竹不定芽诱导和生长的影响,为芦竹农杆菌介导转基因过程中AS的使用提供依据。[方法]将芦竹外植体预培养3 d后接种到添加100、250、500、1 000、2 500、5 000μmol/L AS的培养基中培养,以不添加AS为对照,观察芦竹的不定芽诱导数及不定芽的高度。[结果]AS在一定的浓度下对芦竹外植体不定芽的诱导和生长都有影响。培养基中添加1 000～2 500μmol/L AS,对芦竹的生长有显著的促进作用;添加AS对芦竹不定芽的诱导有抑制作用,浓度范围1 000～5 000μmol/L与100～500μmol/L相比,对芦竹不定芽诱导的抑制作用显著增强。[结论]AS浓度为100～500μmol/L为芦竹转基因过程中可以使用的合适浓度。     

猕猴桃胚乳培养研究

[目的]建立猕猴桃胚乳培养体系。[方法]将猕猴桃种子消毒后取胚乳作为外植体,接种于含有NAA和6-BA不同组合的1/2MS培养基上进行培养,调查不同NAA和6-BA组合对猕猴桃不同器官形成的影响。[结果]6-BA对不定芽的形成有促进作用,其中植物生长调节剂组合NAA 0.1μmol/L+6-BA 5μmol/L对不定芽的形成最有效,而植物生长调节剂组合NAA 0.5μmol/L+6-BA1μmol/L对不定根的形成最有效。[结论]该研究为猕猴桃的胚乳培养提供了技术支持。     

曼陀罗毛状根的诱导及其悬浮培养合成天麻素初探

利用A4和R1601两种发根农杆菌菌株分别感染曼陀罗的嫩叶及嫩茎诱导产生毛状根。探讨了不同菌株、不同外植体、蔗糖预处理、外植体预培养与染菌时间以及外植体二次染菌等条件对转化频率的影响,并建立毛状根悬浮培养体系及转化外源底物对羟基苯甲醇合成天麻素。结果表明:A4转化频率高于R1601;嫩叶转化频率最高;嫩叶最佳预培养时间为4 d;最佳染菌时间为5 min。HPLC法分析表明,悬浮培养毛状根能转化外源底物对羟基苯甲醇合成天麻素。