水稻细菌性条斑病菌中一个调控致病性的DNA结合蛋白负调控胞外酶活性

 原核革兰氏阴性菌稻黄单胞菌稻生致病变种 (又称水稻细菌性条斑病菌,Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)是引起水稻细菌性条斑病的病原物,该病是水稻粮食生产中的严重病害之一。我们的前期工作对广西农科院分离到的Xoc菌株GX01进行基因组序列分析,发现一个编号为gx01_0566的基因可能编码一个Fis家族的DNA结合蛋白。本工作采用自杀质粒pK18mobsacB介导的方法来构建该基因的缺失突变体,并对突变体进行反式互补。表型分析发现,gx01_0566基因的突变体在寄主水稻日本晴上的致病力显著下降,但其胞外多糖产量与野生型基本一致,胞外酶尤其是胞外纤维素酶活性却大幅度提高。为进一步研究gx01_0566基因在Xoc中调控胞外纤维素酶的机理,我们对该基因的产物进行过量表达和纯化,并通过凝胶阻滞实验和实时定量PCR实验分析,发现gx01_0566编码产物能够结合在一些编码纤维素酶的基因的启动子上,负调控这些纤维素酶基因的表达。     

灰葡萄孢BcPDR1基因与PKA编码基因的关系研究

 为明确灰葡萄孢BcPDR1基因与病菌cAMP信号途径中PKA编码基因BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR之间的关系,利用Real-time PCR技术分析了BcPDR1基因突变对PKA编码基因BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR表达的影响,以及PKA编码基因突变对BcPDR1基因表达的影响。结果发现,BcPDR1基因突变体中BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR的表达水平均显著高于野生型和回复菌株,BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR基因的RNAi突变体中BcPDR1基因表达水平显著低于野生型。我们分别构建了PKA编码基因BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR在敲除突变体ΔBcpdr1中过表达的菌株ΔBcpdr1/BcPKA1-OE、ΔBcpdr1/BcPKA2-OE、ΔBcpdr1/BcPKAR-OE;对过表达菌株的表型和致病力进行分析发现,过表达菌株的菌落形态、菌核形成、菌丝形态、生长速率、产孢量和致病力均与突变体ΔBcpdr1表现显著的差异,而更接近野生型BC22的表型和致病力。结果表明,灰葡萄孢BcPDR1基因与PKA亚基基因BcPKA1、BcPKA2和BcPKAR的表达水平密切相关,BcPDR1基因负调控这3个基因的表达,而这3个基因对BcPDR1基因表达有正调控作用。本研究为进一步阐明灰葡萄孢BcPDR1基因调控病菌生长发育和致病力的分子机制奠定了基础。     

水稻白叶枯病菌鞭毛基体基因fliExoo缺失突变分析

 为了阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)鞭毛基体组分蛋白基因fliExoo的生物学功能,本研究用Gm^R抗性基因标记交换法成功构建了基因缺失突变体△fliExoo。与野生型菌株PXO99^A相比,△fliExoo鞭毛缺失,菌体易沉降,在0.3%半固体培养基上运动能力明显降低;尽管生长速率和胞外纤维素酶活性无明显变化,但胞外多糖产生和生物膜形成能力明显下降;对水稻品种日本晴的致病性和对非寄主烟草的致敏性反应明显减弱。基因互补可以使上述突变表型恢复。因此,鞭毛基因fliExoo突变不仅影响了细菌鞭毛依赖的运动性,而且对病原菌毒性相关的表型也产生了影响。     

水稻白叶枯病菌Zur和HrpG平行调控hrcC基因表达

 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)的III型分泌系统(Type III secretion system, T3SS)由hrp基因簇编码,其决定在寄主水稻上的致病性。hrcC是hrp基因簇中hrpA转录单元仅有的一个基因,推测编码T3SS的核心组分蛋白。在Xoo中,hrcC在致病性中的功能以及受调控的机制仍未明确。本研究构建了hrcC的缺失突变体及其功能互补子,发现hrcC缺失使Xoo丧失了在寄主水稻上的致病性以及在非寄主烟草上激发过敏反应(Hypersensitive response, HR)的能力,功能互补子能够恢复这些表型至野生型水平。启动子GUS活性的定量测定和蛋白免疫杂交试验,证明hrcC的转录表达依赖于主要的hrp调控子HrpG,而不受HrpX调控;HrpG和铁转运家族类调控子(Ferric uptake regulator family)Zur以平行独立的方式正调控hrcC基因的转录表达。异源功能互补、启动子活性和蛋白表达试验发现Xoo和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)的hrcC基因在致病性上的功能具有互置性,以及受HrpG、HrpX和Zur的调控模式也具有相似性。这些研究为进一步解析黄单胞菌的hrp调控网络与全毒性调控网络之间的交叉提供了新的线索。     

青枯菌GMI1000效应蛋白RipQ对致病力的作用研究

 青枯菌通过Ⅲ型分泌系统向寄主植物细胞分泌100多种效应蛋白,对寄主植物的抗感病性产生影响。青枯菌效应蛋白RipQ启动子区存在典型的HrpB识别序列PIP box (5′-TTCGG-N15-TTCGC-3′),但其功能尚未明确。本研究分析了RipQ在青枯菌4种演化型菌株中的分布情况。以青枯菌GMI1000为出发菌,构建ripQ缺失突变体和过表达菌株,研究效应蛋白RipQ在青枯菌-番茄植物互作中的功能。结果显示,ripQ广泛分布于除演化型IV的不同青枯菌类群中。与野生型菌株相比,ripQ突变体在番茄上的致病力有一定程度的增强,而ripQ过表达菌株的致病力显著降低。突变体和过表达菌株在培养基中的生长与野生型没有区别,但过表达菌株在番茄体内的繁殖能力下降。RipQ过表达菌株侵染番茄后hrpB、hrpG和epsA基因表达量显著下调,且能够诱导番茄叶片H₂O₂的大量累积,过敏性坏死反应标志基因hin1和水杨酸信号通路标志基因PR1a的诱导表达。另外,在番茄上瞬时表达ripQ也可以观察到H₂O₂积累及叶片细胞坏死,伴随着hin1和PR1a的上调表达。这些结果表明效应蛋白RipQ具有诱导番茄抗性的作用,从而影响青枯菌在番茄植物上的致病力。     

番茄枯萎病菌转录因子FolMsn2的生物学功能

为探究转录因子FolMsn2在番茄枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici生长发育及致病过程中的作用,以番茄枯萎病菌野生型菌株4287为材料,利用基因敲除方法获得FolMSN2基因缺失突变体△Folmsn2及回补体菌株△Folmsn2-C,通过测定菌株的生长速率、孢子产量及致病力等表型初步分析番茄枯萎病菌中FolMSN2的生物学功能。结果显示,与野生型菌株4287相比,FolMSN2基因敲除突变体△Folmsn2生长速率显著减慢,菌株产孢量显著下降,仅为野生型菌株4287产孢量的6.7%;外界环境压力胁迫试验结果显示,FolMSN2基因缺失突变体△Folmsn2对渗透压、盐胁迫的敏感性显著提高,而对细胞壁、氧化压力胁迫变得更加耐受。此外,FolMSN2基因缺失突变体△Folmsn2对番茄苗及果实的致病力显著下降,进一步分析发现FolMSN2基因缺失影响其对玻璃纸的穿透能力;亚细胞定位结果表明,FolMsn2蛋白定位于细胞核内。表明FolMsn2参与调控番茄枯萎病菌的营养生长、无性繁殖以及对不同环境胁迫的应答过程,其可能通过影响菌丝对寄主的穿透能...     

水稻白叶枯病菌Zur和HrpG平行调控hrcC基因表达

 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)的III型分泌系统(Type III secretion system, T3SS)由hrp基因簇编码,其决定在寄主水稻上的致病性。hrcC是hrp基因簇中hrpA转录单元仅有的一个基因,推测编码T3SS的核心组分蛋白。在Xoo中,hrcC在致病性中的功能以及受调控的机制仍未明确。本研究构建了hrcC的缺失突变体及其功能互补子,发现hrcC缺失使Xoo丧失了在寄主水稻上的致病性以及在非寄主烟草上激发过敏反应(Hypersensitive response, HR)的能力,功能互补子能够恢复这些表型至野生型水平。启动子GUS活性的定量测定和蛋白免疫杂交试验,证明hrcC的转录表达依赖于主要的hrp调控子HrpG,而不受HrpX调控;HrpG和铁转运家族类调控子(Ferric uptake regulator family)Zur以平行独立的方式正调控hrcC基因的转录表达。异源功能互补、启动子活性和蛋白表达试验发现Xoo和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)的hrcC基因在致病性上的功能具有互置性,以及受HrpG、HrpX和Zur的调控模式也具有相似性。这些研究为进一步解析黄单胞菌的hrp调控网络与全毒性调控网络之间的交叉提供了新的线索。     

MoRAD26参与稻瘟病菌的胁迫应答和致病过程

 稻瘟病菌引起的稻瘟病是水稻三大病害之一。DNA修复对维持基因组的完整性具有重要作用,为了解析DNA修复基因在稻瘟病菌致病过程中的功能,本试验对稻瘟病菌DNA损伤检控点蛋白MoRad26进行了功能分析。首先我们利用同源重组的方法获得了MoRAD26基因的稻瘟病菌敲除突变体。表型观察发现MoRAD26缺失突变体的致病力下降,对DNA损伤胁迫和H₂O₂胁迫更加敏感,但是对稻瘟病菌的生长、产孢以及分生孢子萌发和附着胞的形成没有明显影响。进一步分析表明,敲除MoRAD26基因降低了稻瘟病菌侵染菌丝的扩展能力进而影响稻瘟病菌的致病力,但其具体机制还有待深入研究。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

水稻白叶枯病菌HD-GYP结构域蛋白PXO_03945的功能鉴定

为了揭示水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)环二鸟苷酸(c-di-GMP)信号相关蛋白PXO_03945的生物学功能,本研究通过基因同源重组和无标记交换,对PXO_03945基因进行了缺失突变,对野生型、突变体和互补菌株进行表型测定,分析该基因缺失突变对病菌胞内c-di-GMP水平、致病性、运动性、胞外多糖产生和生物膜形成的影响。结果表明,PXO_03945蛋白具有参与c-di-GMP降解的磷酸二酯酶(PDE)的HD-GYP结构域和功能未知的DUF3391结构域。全长基因缺失可导致体内c-di-GMP浓度明显上升。与野生型相比,ΔPXO_03945对水稻品种日本晴的致病性显著下降,而游动性增强,胞外多糖产生和生物膜形成增加。基因互补可以使之恢复。因此,HD-GYP结构域蛋白PXO_03945可能通过降解胞内c-di-GMP,正向调控了致病性,负向调控了运动性、EPS产生和生物膜形成能力。     

利用gusA基因在水稻组织中示踪和定量水稻白叶枯病菌的方法

 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)从自然孔口水孔或者伤口处侵入水稻叶片,在维管束中定殖、繁殖和扩展,引起典型的叶枯症状。可视化这个动态的病程过程和快速定量水稻组织中细菌的群体是Xoo-水稻互作研究中亟待突破的技术难点。本研究在PXO99^A菌株中表达gusA基因,将其置于lacZ启动子、hrpX启动子和不含有(T₁)₄终止子的hrpX启动子下,构建了3个示踪菌株PXO99^A_GUSRBS、PXO99^A_GUSX和PXO99^A_GUSX-。水稻上毒性测定结果显示,这3个示踪菌株与野生型PXO99^A展现相同的毒性。利用示踪菌株,通过注射接种法,能够观察到Xoo在水稻维管束中定殖和扩展的动态变化;通过喷雾接种法,能够观察到Xoo从叶尖或者叶缘侵入水稻叶片引起发病的特性;发现PXO99^A_GUSX和PXO99^A_GUSX-比PXO99^A_GUSRBS能够更加灵敏地反映这些病程。同时发现,PXO99^A_GUSRBS的细菌数量与受其侵染的水稻组织的GUS活性显著正相关。本研究也评价了利用GUS活性测定法精确和快速地定量水稻组织中细菌群体的可行性。以上结果表明这套GUS系统是非常有效的,能够示踪病原菌的侵染过程和监测细菌在水稻组织中的群体数量,这将为Xoo-水稻互作研究提供有力的技术支持。     

水稻白叶枯病菌双组分调控系统应答调节子基因gacAxoo的功能鉴定

为了阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)双组分系统(TCS)的调控作用,本研究通过基因克隆、序列分析、缺失突变和互补、表型测定,对TCS应答调节子基因gacAxoo的功能进行了鉴定。克隆的gacAxoo基因编码蛋白GacAxoo与其它病原黄单胞菌的同源序列高度保守。GacAxoo是LuxR蛋白家族成员之一,具有磷酸受体结构域(REC)和DNA结合保守结构域(HTH)。用基因标记交换法,构建了△gacAxoo基因缺失突变体。与PXO99A相比,△gac-Axoo的致病性、致敏性、胞外降解酶类活性和嗜铁素产生能力无显著变化,但运动性明显减弱,基因互补可以使之恢复。因此,gacAxoo基因可能参与了Xoo运动性的调控。     

水稻白叶枯病菌毒性基因调控hrp基因表达的分析

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)侵染寄主水稻,引起水稻白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)。病原菌主要依赖hrp基因簇编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)将效应蛋白(T3SS effectors,T3SEs)注入水稻细胞中,激发水稻的抗(感)病性。同源性搜索结果显示,植物病原黄单胞菌中已鉴定的一些毒性基因在Xoo的代表菌株PXO99A中保守存在。为了明确这些毒性基因对hrp基因表达调控的影响,本研究利用pK18mob-W介导的定点突变方法,成功获得了14个毒性基因的突变体;在突变体中,利用hrp∶∶gusA融合表达体系,通过GUS活性定量测定检测了hrpG、hrpX和hrpB1的启动子活性;通过荧光定量PCR技术,检测了这3个基因的mRNA水平。结果显示,双组分调控系统ColR/ColS、RpfC/RpfG和转录调控子Clp负调控hrpG和hrpB1的表达;Trh和Xrv A通过HrpG-HrpX途径正调控hrpB1的表达;HpaR1和Fur不依赖于HrpG仅通过HrpX正调控hrpB1的表达。这些调控关系的鉴定为解析水稻黄单胞菌hrp调控网络提供了新的线索。     

katExoo基因缺失突变对水稻白叶枯病菌H2O2抗性和致病性的影响

 为了揭示过氧化氢酶基因katExoo在水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)过氧化氢(H₂O₂)抗性和致病性中的功能,本研究构建了基因缺失突变体ΔkatExoo,测定了突变体的H₂O₂抗性、过氧化氢酶(CAT)活性、在离体培养条件下的生长速率以及对水稻的致病性。用标记基因置换法获得了ΔkatExoo突变体,其保守的CAT结构域(GATase1_catalase和catalase_clade_2)被Gm^R片段所替换。katExoo基因缺失突变并不导致病菌的H₂O₂抗性和CAT活性降低或丧失,反而在一定程度上使之增强和升高。ΔkatExoo离体生长量显著降低,水稻接种叶片病斑明显缩短、在叶组织内的种群量下降。表明基因缺失突变显著地影响了病菌的生长、定殖和致病性。本研究结果为“KatExoo可能是Xoo的一个毒性因子”的假设提供了遗传学证据。     

水稻条斑病菌rsmA基因在致病性中的功能分析

RsmA属于CrsA/RsmA蛋白家族成员,是一类RNA结合蛋白,作为一类全局性的转录后调控因子,调控碳代谢、生物膜形成、游动性以及致病性相关基因的表达等。同源性搜索结果显示,水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)RS105中存在rsmA基因,其与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)PXO99A的rsmAXoo同源性为100%。但是,r smAXoc基因在致病性中的功能未知。本研究构建了Xoc的rsmA缺失突变体RΔrsmA。寄主水稻和非寄主烟草接种结果显示,RΔrsmA在水稻上仍具有致病性,在非寄主烟草上也能够激发HR反应,这些结果与已鉴定的Xoo rsmA突变体表型不一致。但是,与野生型菌株相比,RΔrsmA在感病水稻上的毒性显著降低;在丰富和贫乏的培养基中,RΔrsmA的生长能力也明显减弱。其他毒性相关表型的测定结果显示,与野生型菌株相比,RΔrsmA在半固体培养基上的游动能力减弱,生物膜形成能力增强,胞外多糖产量明显降低,胞外蛋白酶的活性增加。这些结果暗示在Xoc中rsmA为重要的毒性相关基因,在Xoo和Xoc中RsmA在致病性中的功能存在一定的差异,RsmA下游调控基因的鉴定可能为解析其在2个水稻致病变种中功能的差异提供线索。     

水稻白叶枯病菌转录调控因子基因fleQxoo和σ54因子基因rpoNxoo的分子鉴定

 为了阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)鞭毛生物合成及运动性的调控机理,本研究首先通过基因克隆、序列分析、缺失突变及表型测定,对转录调控因子fleQxoo和编码σ⁵⁴因子的基因rpoNxoo进行了分子鉴定。通过基因特异性扩增,成功地从Xoo菌株PXO99^A中克隆了fleQxoo和rpoNxoo。其基因序列与其它黄单胞病原菌中的同源序列高度保守。FleQxoo是NtrC家族激活蛋白成员之一,具有与σ⁵⁴作用的结构域和DNA结合保守结构域(HTH)。用标记交换法构建了△fleQxoo和△rpoNxoo基因缺失突变体。与PXO99^A相比,△fleQxoo和△rpoNxoo鞭毛产生能力丧失,运动性减弱,基因互补可以使之恢复;但其胞外纤维素酶和木聚糖酶活性以及对烟草叶片组织的致敏性无明显改变。因此,FleQxoo和σ⁵⁴主要参与了鞭毛生物合成及其运动性的调控。