七叶一枝花糖基转移酶基因的克隆及表达分析

糖基转移酶处于重楼皂苷生物合成途径的最后一步,催化薯蓣皂苷元或偏诺皂苷元的糖基化形成各种重楼皂苷,具有重要的研究价值。本研究通过对七叶一枝花进行转录组高通量测序、表达谱结合含量关联分析,筛选得到1条可能参与重楼皂苷生物合成的糖基转移酶(glycosyltransferase, GT)候选基因。通过克隆,获得Pp-GT全长基因(GenBank登录号:MW208819),长度为1 443 bp,就Pp-GT的蛋白质序列及进化等进行了生物信息学分析,并对其基因表达模式进行了研究。该研究为下一步重楼皂苷合成途径的阐明和Pp-GT基因的功能验证提供了科学依据。     

亚麻糖基转移酶基因LuUGT72E1的克隆与表达分析

以亚麻茎部组织总RNA为模版,通过反转录PCR获得糖基转移酶Lu UGT72E1基因的全长开放读码框序列。序列分析结果表明:开放读码框全长1 476bp,共编码491个氨基酸。通过多氨基酸比对发现,该蛋白与亚麻UGT72N2蛋白亲缘关系最近,相似度达99%,与毛果杨、巨桉、木薯、雷蒙德氏棉及拟南芥UGT72E1蛋白的氨基酸序列相似性在58%~51%。分子进化分析表明,该蛋白与拟南芥UGT72E1~3聚为一类,推测该蛋白参与木质素单体的糖基化修饰过程。基因表达谱结果表明,该基因被BR、Brz诱导下调表达。本研究为亚麻的纤维品质改良提供了候选基因。     

金银花糖基转移酶基因LjUGT71E1的克隆及原核表达

糖基化广泛存在于生物体中,具有非常重要的作用,而糖基转移酶则是催化糖基化反应的关键酶。本研究根据转录组数据库,设计引物从金银花(Lonicera japonica Thunb.)中克隆得到一个糖基转移酶编码基因LjUGT71E1,序列分析表明该基因的CDS为1 503 bp,理论可编码氨基酸数目为501,等电点(p I)预测为5.09,理论分子量为55 579.71 Da。多重序列比对表明LjUGT71E1与其它植物UGT71家族成员在序列上保守性很高,并且其C端具有催化植物次生代谢产物糖基化的糖基转移酶所具有的保守的PSPG-box基序。系统发生分析表明LjUGT71E1与人参(Panax ginseng)和甜叶菊(Stevia rebaudiana)的UGT71E亚家族成员聚为一支。荧光定量PCR分析表明,该基因在金银花的五个花期均有表达,在幼蕾时期相对表达量达到峰值。进一步构建了LjUGT71E1基因的原核表达载体并且在大肠杆菌中诱导表达得到重组蛋白,为后续的功能研究提供了基础。     

小麦糖基转移酶家族候选基因干旱胁迫表达模式分析

糖基化是植物中重要的一种蛋白质翻译后修饰,参与多种生物学功能的调控。在糖基化酶类中糖基转移酶(glycosyltransferase, GT)是最重要的酶类之一。采用生物信息学方法对小麦中的GT家族211个基因进行系统进化、基因结构、motif保守结构域、染色体分布、等电点等方面系统分析。进一步通过与抗旱转录组数据库中的基因进行比对,共筛选获得了18个糖基转移酶基因(TaGT186, TaGT204, TaGT157, TaGT138, TaGT195, TaGT169, TaGT32, TaGT145, TaGT66, TaGT77, TaGT92, TaGT140, TaGT155, TaGT167, TaGT175, TaGT-178, TaGT130, TaGT187)。以干旱处理的小麦杂交种JM179及其父母本为试材,通过荧光定量PCR验证,发现TaGT157基因在干旱处理的JM179材料中的表达量显著高于其父母本,该基因可能参与了杂交种的抗旱分子调控。综上所述,本研究从小麦GT家族中筛选参与抗旱杂种优势调控的糖基转移酶基因TaGT157,为接下来的小麦GT家族在抗旱杂种优势...     

小麦谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及原核表达

为了进一步研究小麦谷胱甘肽-S-转移酶基因(TaGST)的功能,采用RT-PCR方法分离了小麦谷胱甘肽-S-转移酶基因(TaGST)的ORF全长c DNA,并进行了生物信息学分析。结果表明:小麦TaGST基因的ORF全长690 bp,编码229个氨基酸;TaGST蛋白分子质量为25.81 k Da,p I为5.29。系统进化分析表明,该基因编码蛋白与水稻OsGST蛋白的氨基酸同源性最高,与已知植物GST家族成员的氨基酸序列聚类分析将TaGST聚为Phi类GST。构建原核表达载体p ET32-TaGST,对TaGST基因进行原核表达,SDS-PAGE结果表明,其所表达蛋白与预期蛋白大小一致。为进一步研究该基因的特性和功能奠定了理论基础。     

小麦TaSPP基因的克隆及表达分析

为明确磷酸蔗糖磷酸酶基因(SPP)的表达特征和生物学功能,进一步了解SPP参与蔗糖生物合成的调控机制。以小麦抗旱品种晋麦47的cDNA为模板克隆出3个位于第5同源群上的TaSPP同源基因,分别命名为TaSPP-5A、TaSPP-5B和TaSPP-5D。并利用生物信息学对小麦TaSPP的理化性质、基因结构、顺式作用元件、系统进化树和蛋白保守结构域等进行分析,通过qRT-PCR分析基因TaSPP的表达模式。结果表明,TaSPP-5A、TaSPP-5B、TaSPP-5D都包含8个外显子和7个内含子,TaSPP-5A和TaSPP-5D编码422个氨基酸,TaSPP-5B编码413个氨基酸。系统进化分析显示,小麦TaSPP基因与小麦的近缘物种在进化上处于同一分支,相似度较高。qRT-PCR表达分析结果显示,TaSPP基因在根、茎秆、旗叶、叶鞘、颖花、种子中均表达,其中在旗叶和茎秆中表达量较高;ABA、PEG-6000、NaCl和IAA胁迫均能诱导TaSPP基因的表达,表明小麦TaSPP基因可能在逆境胁迫过程中发挥重要作用。     

黑莓RuCYP73A基因的克隆及表达分析

黑莓果实富含黄酮类化合物,具有清除自由基、抗氧化和抗肿瘤等功效。本研究基于黑莓未成熟和成熟果实的转录组数据,克隆了黄酮合成通路中显著差异的CYP基因(与蔷薇科植物CYP73A同源,命名为RuCYP73A),利用RT-qPCR分析RuCYP73A基因在黑莓不同组织和果实不同发育时期的相对表达量,结果表明RuCYP73A在果实中的表达量最高,在果实发育过程中呈先升高后逐渐降低的规律,其中15 d果龄时表达量最高。基因结构分析显示,RuCYP73A含1 497 bp开放阅读框,编码499个氨基酸,终止密码子为TAA。生物信息学分析表明,RuCYP73A编码蛋白的分子量为56.80 kD,理论等电点为8.53,具有跨膜结构域,为疏水碱性蛋白,属于细胞色素P450超家族。系统进化分析表明,RuCYP73A与蔷薇科月季和野草莓的亲缘关系较近,与梧桐科可可树和桃金娘科尾叶桉亲缘关系较远,符合植物分类学特征。研究结果为黑莓黄酮类物质生物合成关键基因CYP73A的深入研究奠定了基础。     

毛竹中黄酮-C-糖基转移酶基因的克隆和生物信息学分析

糖基转移酶是催化黄酮糖苷形成的关键酶。黄酮糖苷类化合物具有抗氧化、清除自由基、调节血脂和血糖等生理作用。基于毛竹基因库测序的完成,本研究通过RT-PCR技术首次获得一条完整的毛竹黄酮-C-糖基转移酶基因开放阅读框,将其命名为PeCGT,其基因的序列长度是1342 bp。对其编码蛋白的理化性质、保守结构域以及二级结构和空间结构等进行了生物信息学分析。结果表明:PeCGT基因编码的蛋白含有447个氨基酸,分子量是47.76 kD,理论等电点为4.91,酸性氨基酸(Asp+Glu)个数为54,碱性氨基酸(Arg+Lys)个数为35。PeCGT蛋白是疏水型蛋白,不存在信号肽,存在于线粒体中。结构域预测分析结果表明,PeCGT编码的氨基酸序列具有明显的糖基转移酶特征的保守域结构PSPG。通过同源性分析,其与乌拉图小麦(Triticum urartu)、节节麦(Aegilops tauschii subsp.Tauschii)和二穗短柄草(Brachypodium distachyonhiihii)具有较高的同源性。实时荧光定量PCR结果表明:PeCGT基因在叶中的表达量最高,在根中几乎不表达,在茎中有部分表达。此研究结果为以后毛竹黄酮-C-糖基转移酶的表达和功能鉴定提供了一定的帮助。     

扁蓿豆DNA甲基转移酶基因MrMET1的克隆及表达分析

DNA甲基化是一类重要的表观遗传修饰,在植物对非生物胁迫的响应中发挥重要作用。DNA的甲基化需要DNA甲基转移酶催化。为挖掘扁蓿豆中DNA甲基转移酶基因,解析其是否参与扁蓿豆抗逆性应答,本研究利用RT-PCR技术从扁蓿豆中克隆到1个胞嘧啶5-甲基DNA转移酶基因,该基因含1 071 bp的开放阅读框,编码357个氨基酸。生物信息学分析确定该基因为DNA甲基转移酶1 MrMET1基因。实时荧光定量PCR显示,MrMET1基因在不同非生物胁迫(低温,干旱, NaCl)及ABA处理下,不同时间表达量呈现不同的变化趋势,推测该基因参与了扁蓿豆对非生物胁迫的响应。本研究结果对深入解析METs基因的功能,理解牧草对非生物逆境胁迫响应机制具有一定的参考意义。     

马铃薯甲基转移酶基因StDRM2的克隆及表达分析

DNA甲基化对植物的生长发育至关重要,DNA甲基转移酶建立和维持着DNA甲基化,其中结构域重排甲基转移酶DRM2催化非对称位点的从头甲基化.为了初步探究马铃薯StDRM2基因的功能,本研究利用同源克隆基因技术从马铃薯'青薯9号'中克隆了StDRM2基因,利用Gateway技术构建过表达载体,农杆菌遗传转化马铃薯'大西洋...     

紫苏酪氨酸氨基转移酶基因片段的克隆及表达分析

为获得紫苏迷迭香酸合成途径中的酪氨酸氨基转移酶基因,本研究采用同源克隆的方法,根据已报道的其他物种的TAT基因序列设计并合成简并引物,成功克隆得到了紫苏TAT基因片段（GenBank登录号：JN032113.1）,该片段长为579 bp,共编码193个氨基酸残基,并命名为PfTAT。氨基酸序列比对分析发现其与彩叶草、丹参、拟南芥和罂粟的一致性分别为97%、94%、69%和58%,系统进化树分析表明PfTAT与唇形科植物的亲缘关系最近。采用半定量RT-PCR法分析PfTAT在紫苏的根、茎、叶中均有表达,且叶中的表达量较高,内源性植物激素信号分子对PfTAT表达量影响的实验表明,脱落酸、水杨酸处理均能够不同程度得上调PfTAT转录水平的表达。     

滇牡丹类黄酮2'-O-萄糖基转移酶基因的鉴定及表达分析

在被子植物中,2'-O-葡萄糖基转移酶能够影响花色色素分子的生物合成,在类黄酮上添加葡萄糖基配体,是形成黄色色素的关键酶。本研究采用RT-PCR技术首次从滇牡丹中克隆得到一个具完整开放阅读框的类黄酮-2'-O-葡萄糖基转移酶(Pd2'GT)基因,对其进行生物信息学分析和转录模式分析。研究发现该基因全长1 428 bp,可编码的蛋白氨基酸475个,该蛋白无信号肽和跨膜结构,是一种在细胞质基质中发挥功能的不稳定蛋白;核酸序列与葡萄(Vitis vinifera)糖基转移酶的核酸序列具78%的一致性,说明该基因可能编码一个新蛋白,其蛋白序列含糖基转移酶超家族结构域PSPG,其氨基酸残基序列为WAPQVAILSHRATGG FVSHCGWNSILESLWFGVPIAALPMYAEQQ,含典型的糖基转移酶识别区和UDP糖基配体绑定位点;该蛋白与苹果(Malus domestica,NP_001315903)、西洋梨(Pyrus communis,D3UAG1)、仙客来(Cyclamen persicum,BAF75895)和长春花(Catharanthus roseus,BAF75901)的2'GT聚为一类,该组的糖基受体均为查尔酮;转录模式分析表明:Pd2'GT基因在黄色花瓣中表达量最高,在花蕾期该基因的积累水平最高。本研究通过对滇牡丹转录组数据的分析,分离并克隆得到Pd2'GT基因,为通过基因工程手段培育具新性状的观赏牡丹提供研究依据。     

马铃薯块茎糖基转移酶基因的克隆及其RNAi载体的构建

为探讨鼠李糖基转移酶(rhamnosyltransferase, sgt3)基因与类固醇糖苷生物碱(steroidal glycoalkaloid, SGAs)合成关系, 揭示sgt3基因在SGAs合成中的作用, 本研究根据GenBanK No：DQ266437保守区设计特异引物, 通过RT-PCR技术获得马铃薯块茎sgt3相似基因;采用生物信息学相关软件分析, 预测sgt3相似基因cDNA序列编码的蛋白质结构和功能, 构建基于sgt3基因的植物干扰表达载体。结果表明, 克隆的sgt3相似基因与报道的sgt3基因序列相似性达到99.54%, 其ORF长1 500 bp, 编码505个氨基酸残基, 具有UDPG糖基转移酶保守结构域及许多重要功能位点;三级结构预测表明, 该氨基酸同糖基转移酶单体结构模型相似, 为糖基转移酶家族成员, 表明可能具有合成类固醇糖苷生物碱功能, 基因序列已注册到GenBank, 序列登录号为HM188447。以此为靶序列, 构建由Actin启动子和CIPP启动子驱动的与sgt1和sgt2基因相似度高的含有sgt3基因序列的干扰表达载体, 将为糖苷生物碱的合成、代谢的进一步研究及低糖苷生物碱转基因马铃薯品种的培育奠定基础。     

甘蔗谷胱甘肽硫转移酶基因SoGST-1a的克隆与表达分析

克隆甘蔗谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferase,GST)基因,并分析其序列特征和表达谱,为甘蔗抗旱育种提供基因来源。本研究采用电子克隆和RT-PCR技术从甘蔗品种‘新台糖22号’中克隆到一个甘蔗GST基因,命名为SoGST-1a。通过生物信息学软件分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR检测其表达谱。序列分析表明该基因cDNA全长702 bp,编码224个氨基酸,预测的蛋白分子式为C₁₁₁₇H₁₇₅₀N₃₀₀O₃₂₈S₆,蛋白分子量为24.82 kDa,等电点为5.96。蛋白疏水性分析推测其为亲水性蛋白。保守结构域预测表明SoGST-1a蛋白具有2个GST结构域。系统进化树分析表明该基因与玉米Zeta类GST蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,干旱胁迫下SoGST-1a基因下调表达。研究结果表明,SoGST-1a基因可能在甘蔗干旱胁迫中并不发挥一定作用。这些结果为深入了解SoGST-1a基因的生物学功能奠定了基础。     

小麦TaPHYA基因亚家族的克隆及表达分析

光敏色素是一类与作物农艺性状密切相关的基因家族。本研究克隆了中国春小麦光敏色素TaPHYA1、TaPHYA2和TaPHYA3基因完整的编码序列,并对它们进行了生物信息学以及转录分析。在NCBI数据库中对其推测的氨基酸序列进行BLAST分析,发现TaPHYA1和TaPHYA3氨基酸序列中包含光敏色素基因完整的功能结构域。系统进化树分析表明,小麦TaPHYA1、TaPHYA2和TaPHYA3之间进化关系相近,且与单子叶植物玉米、水稻的PHYA聚为一个亚类。另外,TaPHYA的表达丰度具有组织特异性,在茎、叶、穗中表达量分别是根中的1.35、0.34和0.87倍;而在同光质条件下,其表达丰度也具有光质特异性,TaPHYA的总表达量在黑暗和远红光条件下最高,在蓝光条件下次之,而红光和白光条件下最低。该结果为深入研究小麦光敏色素A基因亚家族的功能奠定了基础。     

小麦TaHPPR基因的克隆与表达分析

为研究羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)在小麦逆境胁迫中的作用,本研究利用同源克隆法获得1个小麦HPPR基因,命名为TaHPPR,并对其组织表达特性和逆境胁迫表达特性进行了分析.以'太原806'、'小白麦'、'京冬8'及'京411'为供试材料,用荧光定量方法获得组织表达和逆境胁迫表达数据.序列分析表明:TaHPPR基因含有...     

小麦NPR1-like基因的克隆及赤霉菌诱导下的表达分析

AtNPR1是拟南芥系统获得性抗病反应中的关键基因,对拟南芥的广谱抗性起重要调控作用。从赤霉菌诱导的小麦抗、感赤霉病近等基因系RNA差异表达谱中获得3个与AtNPR1类似的EST片段,据此检索相应序列信息并设计引物,采用RT-PCR方法从小麦中克隆得到3个cDNA全长序列,分别命名为TaNPR1、TaNPR2和TaNPR3,其开放阅读框分别编码580、607和601个氨基酸残基。序列分析表明,这3个小麦NPR1-like蛋白都含有保守的BTB/POZ、ANK和NPR1_like_C结构域及功能氨基酸,但仅TaNPR1具有2个对NPR1寡聚体形成十分必要的保守半胱氨酸残基。蛋白质聚类分析表明,TaNPR1与TaNPR2和TaNPR3的同源性均较低,其中TaNPR1与NPR1蛋白聚为一类,而TaNPR2和TaNPR3均与NPR1同源蛋白聚为一类。荧光定量PCR分析结果显示,TaNPR1、TaNPR2和TaNPR3基因都可被植物抗病相关信号分子水杨酸和茉莉酸甲酯诱导。与感病材料Apogee相比,抗病近等基因系Apogee73S2中TaNPR1和TaNPR3能够更早地响应赤霉菌的诱导并显著上调表达;而TaNPR2在感、抗材料中对赤霉菌侵染的响应都较为缓慢且变化不明显。这些结果表明,TaNPR1和TaNPR3可能在小麦对赤霉菌的防御反应中起重要作用。     

‘秋天火焰’槭类黄酮糖基转移酶（UFGT）基因的克隆及序列分析

UFGT（类黄酮糖基转移酶）是植物花色苷生物合成途径的最后一个酶。以槭树‘秋天火焰’秋季变色期叶片总RNA为模板,设计简并引物,采用RT-PCR方法,扩增出一条长397bp的cDNA片段,序列分析结果表明,该cDNA片段与GenBank中登录的荔枝、柑橘柚等物种的氨基酸同源性在70%左右,可知克隆到的核苷酸片段为槭树叶片UFGT基因的cDNA片段,Genbank登录号为KC140229。     

小麦三雌蕊突变体TaAP1-3基因的克隆及表达分析

为探讨TaAP1-3基因在小麦三雌蕊性状形成中的作用,从小麦三雌蕊近等基因系CM28和CM28TP中克隆得到3个同源基因TaAP1-3a、TaAP1-3b和TaAP1-3c。通过碱基序列、氨基酸序列、聚类及实时荧光定量分析表明,Ta-AP1-3a、TaAP1-3b和TaAP1-3c 基因cDNA 序列分别为1210,1208,1199 bp,ORF分别为825,816,855 bp,分别编码274,271,284个氨基酸残基。 TaAP1-3a、TaAP1-3b 和 TaAP1-3c 与中国春 TaAP1-3的核苷酸序列相似度分别为96．02%,93.1%,93.56%,氨基酸序列相似性高达99%,95%,97%,并且与 A 类基因 TaAGL29、OsMADS15、ZAP1、BM8、EnWM8、TaAP1-3聚集到 AP1/SUQA 亚家族 FUL2类群中。实时荧光定量分析表明, TaAP1-3a、TaAP1-3b 和TaAP1-3c在CM28和CM28TP的3个发育时期的小穗中均有表达,但各个时期的表达量有明显差异。 CM28中主要在二棱期-小花分化期表达,CM28TP中主要在雌雄蕊原基分化期表达。试验分析显示,TaAP1-3a、TaAP1-3b和TaAP1-3c可能具有上述A类基因相似的功能,其表达模式可能与小麦三粒/一粒性状形成相关。试验结果为进一步探讨该基因在小麦三雌蕊性状形成过程中的作用奠定了基础。