生防菌Bs916合成脂肽抗生素泛革素的 操纵子结构功能及生物活性

【目的】明确枯草芽胞杆菌Bs916（Bacillus subtilis 916）分泌的脂肽化合物Fengycin操纵子的结构、功能和生物活性,阐明枯草芽孢杆菌Bs916防治真菌病害的分子作用机制。【方法】在Bs916全基因组测序基础上,采用LA-PCR方法克隆Fengycin的操纵子Fen;通过生物信息学方法分析Fen操纵子的遗传特征;运用基质辅助解离质谱法测定Fen操纵子合成的脂肽类化合物中同系物的分子量;采用同源重组方法构建Fengycin突变株BSFG;通过抑菌活性和溶血活性试验测定突变株BSFG的生物活性。【结果】克隆到Bs916基因组DNA中全长约37.67 kb的Fen操纵子,含有5个开放阅读框架分别编码FenA、FenB、FenC、FenD和FenE多功能复合酶;与Bs168对应Fen操纵子的同源性为65%。根据该操纵子特征推测其编码的脂肽类化合物为Fengycin;Fen操纵子负责合成的Fengycin包含5个变异体,分属于两类不同同系物。同系物1的质子化峰分子量分别为1 449.8、1 463.9、1 477.9;属于相差1个（-CH2）亚甲基的同系物,一级结构为[cyclo-（[cyclo-（Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala-Pro-Gln- Tyr-β-amino fatty acid）];同系物2的质子化峰分子量分别为1 491.9和1 505.9,也属于相差1个（-CH2）亚甲基的同系物,相对于同系物1其第6位的Ala氨酸残基变为Val氨酸残基。生物活性测定结果表明突变株BSFG抗菌活性相对于野生型菌株Bs916得到显著下降,但溶血活性的变化不明显。【结论】本研究克隆了生防菌Bs916中合成Fengycin的完整操纵子,通过对操纵子生物信息学分析和生化试验鉴定了Fengycin的5种变异体的化学结构,并阐明了脂肽Fengycin是Bs916抗真菌活性的重要因子之一。     

枯草芽孢杆菌葡萄糖酸操纵子突变株的构建

葡萄糖激酶为核黄素的生物合成原料GTP和5-磷酸核酮糖合成的关键酶,为了提高葡萄糖激酶的表达,构建了整合表达载体pRKS - 14,通过同源重组的方法将线性化的pRKS - 14转化枯草芽孢杆菌GJ05,得到GJ06,在葡萄糖酸操纵子基因gntR和gntK基因之间引入了强启动子PB14,为进一步提高核黄素的产量提供原料保障.     

枯草芽孢杆菌的生物活性及其应用进展

对枯草芽孢杆菌的生物降解、提高机体免疫能力、抗氧化、抑菌活性等生物活性及其在植物生防、畜禽养殖、医药、工业等领域的应用进行了概述,并对其应用前景进行了展望。     

枯草芽孢杆菌产脂肽的发酵条件优化

[目的]优化枯草芽孢杆菌产脂肽的发酵条件,提高枯草芽孢杆菌ATCC21332脂肽产量。[方法]利用较低成本的底物对枯草芽孢杆菌ATCC21332进行发酵优化。[结果]枯草芽孢杆菌在葡萄糖浓度9 g/L、豆粕浓度40 g/L、接种量5%、装液量120 mL(500 mL容量瓶)、温度30°C、转速150 r/min、发酵时间120 h时,脂肽产量最高,为4 885.1 mg/L,比添加活性炭载体的最高产量3 600.0 mg/L增加了35.70%。通过测定发酵过程中不同时间段发酵液中氨基酸含量,发现在81 h时谷氨酸含量急剧增大,添加谷氨酸可使脂肽产量达954.0 mg/L,相比不添加谷氨酸的培养基可使脂肽产量增加近6倍。[结论]该研究为工业化生产提供新思路。     

枯草芽孢杆菌B-916胞外抗菌蛋白质的性质

用硫酸铵分级沉淀枯草芽孢杆菌B-916胞外抗菌蛋白质,共获得8个蛋白质粗提物,其中硫酸铵饱和度为40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质具有较强的抑菌活性,研究结果表明:硫酸铵饱和度40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质浓度分别为17.261μg/m l和18.899μg/m l,上述两者对水稻纹枯病菌和水稻恶苗病菌有较强的抑菌活性,对马铃薯晚疫病菌则没有抑菌活性;当温度高于40℃时抑菌活性均降低,但在120℃时仍有部分抑菌活性;对pH值适应范围较宽,但在pH值为13.6时抑菌活性均丧失;经蛋白酶K、蛋白酶E、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后,抑菌活性均下降。SDS-PAGE电泳结果表明枯草芽孢杆菌B-916能分泌多种蛋白质,其中硫酸铵饱和度40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质中相对分子质量为48 000的蛋白质可能为抗菌蛋白质。硫酸铵饱和度40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质经Sephadex G-100层析后检测到4个蛋白质吸收峰。     

枯草芽孢杆菌FS106杆菌肽发酵培养基优化

对枯草芽孢杆菌FS106产杆菌肽的发酵培养基进行优化。单因素优化结果表明最佳碳源是玉米粉,最佳有机氮源是蛋白胨,最佳无机氮源是KNO3,最佳生长因子是牛肉膏。通过二水平Plackett-Burman试验设计确定最佳的培养基配方为(g/L):玉米粉7.5、蛋白胨15、KNO31、牛肉膏7.5、NaCl 5、CaCO30.75、ZnSO4.7H2O 0.0075。     

枯草芽孢杆菌BAB-1脂肽类化合物的分离及稳定性分析

枯草芽孢杆菌菌株BAB-1是一株高效防治番茄灰霉病的生防细菌。通过盐酸沉淀、甲醇萃取的方法,从该菌株的发酵上清液中提取出一种脂肽类化合物。该物质能够显著抑制番茄灰霉菌菌丝生长及分生孢子的萌发,孢子萌发抑制率为83.02%。抑菌谱试验表明该物质对多种植物病原真菌具有明显的抑制作用。此外,该抑菌物质对热稳定,能耐受较广的pH范围,对多种蛋白酶不敏感,在几种常用有机溶剂中保持抑菌活性基本不变。结果表明枯草芽孢杆菌菌株BAB-1产生的脂肽类物质性质稳定,具有较强的抑菌作用。     

枯草芽孢杆菌SYL-6脂肽类化合物的分离与稳定性分析

通过盐酸沉淀、甲醇萃取的方法,从枯草芽孢杆菌SYL-6菌株的发酵上清液中提取出一种脂肽类化合物进行抑菌试验,结果表明该物质对多种植物病原真菌具有明显的抑制作用。此外,该物质对热稳定,能耐受较广的p H值范围,对紫外线有较好的稳定性。     

离子注入选育枯草芽孢杆菌生防菌B-916高效菌种

为进一步提高枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)生防菌B 916的生长速度和拮抗性能 ,获得生防效果更好的高效菌种 ,利用不同剂量N 对生防菌B 916 ,进行离子注入处理。结果表明 :采用剂量为 1cm2 90× 2 6× 10 13 N 诱变生防菌B 916 ,其存活率最高 ;从诱变效果看 ,离子注入生防菌B 916的最适剂量为 1cm2 15 0× 2 6× 10 13 N ～2 5 0× 2 6× 10 13 N ;生防菌B 916经离子注入获得的突变菌株再次进行离子注入 ,其存活率和诱变效果可明显提高。本研究获得了 13个拮抗能力比生防菌B 916提高 10 %以上且遗传性较稳定的突变菌株     

枯草芽孢杆菌Bs2004固体发酵与干燥工艺研究

对生防菌枯草芽孢杆菌Bs2004菌株的固体发酵条件和干燥方式进行了研究。结果表明:麸皮、豆粕等比例混合为最佳发酵基质,含水量65%,水中添加5%蔗糖和5%酵母粉、pH值7.5、32℃培养24h时,发酵物含菌量最大,达9.62×109cfu/g。发酵物经65℃真空干燥,活菌数为9.581×109cfu/g,为最佳干燥方式。     

枯草芽胞杆菌Bs916突变体库的构建和抑制水稻 细菌性条斑病菌相关基因的克隆

【目的】采用转座子标签技术构建枯草芽胞杆菌Bs916突变体库,从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果发生显著变化的菌株并克隆插入位点的基因,获得生防菌Bs916中与抑制细菌活性可能相关的基因。【方法】携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA通过化学转化方法转化至枯草芽胞杆菌Bs916菌株,构建随机插入突变体库。通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果得到显著提高和下降的突变体;并采用PCR和Southern Blot验证转座子是否成功插入到Bs916染色体基因组上,利用反向PCR技术克隆转座子插入位点基因、测序并进行生物信息学分析。【结果】成功构建了枯草芽胞杆菌Bs916的转座子随机插入的突变体库;PCR和Southern Blot结果表明转座子成功的插入到染色体基因组上,约85%突变体以单拷贝形式插入;筛选出30株对水稻细菌性条斑病菌抑制效果发生显著变化的菌株,克隆到21个突变体插入位点的基因序列并测序。生物信息学分析结果表明这些基因与感受态形成、生物膜形成和次生产物代谢相关。【结论】成功构建了Bs916突变体库,克隆到该库中对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果显著变化菌株的突变位点基因,这些基因推测可能与枯草芽胞杆菌Bs916中的抑制细菌化合物的合成代谢及调控相关。     

枯草芽孢杆菌发酵产N-乙酰神经氨酸的分离提纯

[目的]对GRAS认证的枯草芽孢杆菌发酵所得N-乙酰神经氨酸进行分离纯化,获得安全性高的目的产物。[方法]通过沸水浴破壁、菌液分离、活性炭脱色、乙醇分步沉淀除杂、乙酸结晶以及重结晶等工艺对枯草芽孢杆菌基因工程菌株经培养所得的N-乙酰神经氨酸发酵液进行分离纯化。[结果]分离纯化后,N-乙酰神经氨酸纯度在96.0%以上。[结论]研究结果为N-乙酰神经氨酸应用于食品、保健品等领域提供了质量保障。     

枯草芽孢杆菌BAB-1产脂肽类及挥发性物质的分离和鉴定

【目的】对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis菌株BAB-1产生的脂肽类物质和挥发性物质进行分离鉴定和抑菌活性研究。【方法】采用HPLC和MALDI-TOF-MS对脂肽类物质进行分离纯化和鉴定;采用GC-MS对挥发性物质进行鉴定。【结果】HPLC分析表明,菌株BAB-1产生的脂肽类物质由LP-1、LP-2、LP-3三类组分组成,其中LP-2起主要抑菌作用。MALDI-TOF-MS质谱分析表明,LP-1为surfactin(C13—C15),LP-2为fengycin A(C14—C15)和fengycin B(C14—C18),LP-3成分未能确定。GC-MS结果表明,菌株BAB-1产生的挥发性物质由多种成分组成,主要为醇类、酮类、酸类、胺类和烷烃类等。【结论】枯草芽孢杆菌菌株BAB-1能够产生脂肽类物质和挥发性物质,并且这两类物质都具有较强的抑菌活性。     

Bacillus subtilis fmbR抗菌物质的分离和鉴定

 【目的】对Bacillus subtilis fmbR产生的抗菌物质进行分离和鉴定研究，以确定抗菌物质的组成和结构。【方法】采用HPLC和TLC层析对Bacillus subtilis fmbR抗菌物质进行分离纯化，通过ESI-MS和MALDI-MS分析对抗菌物质的组成和结构进行初步鉴定。【结果】HPLC层析表明了Bacillus subtilis fmbR抗菌物质含有保留时间与surfactin相似的成分。TLC层析和原位酸解证明了Bacillus subtilis fmbR抗菌物质含有闭合肽键类的物质，其中之一为相对迁移率Rf与标样surfactin相近的组分。采用ESI-MS分析检测到Bacillus subtilis fmbR抗菌物质含有分子量与surfactinA相同的m/z1009.1、m/z1023.2 和m/z1037.0等3种同系物；通过MALDI-MS分析获得[M+H]+为m/z 3403.95抗菌物质，该物质分子量与Bacillus subtilis 168产生的细菌素subtilosin的m/z3403.3 相同。【结论】Bacillus subtilis fmbR抗菌物质由C13～C15的3种surfactinA同系物和一种羊毛硫抗生素subtilosin组成。     

枯草芽孢杆菌产酶规律及酶学性质研究

[目的]研究浙江建德分离得到的枯草芽孢杆菌淀粉酶的产酶规律和酶学性质。[方法]将分离得到的枯草芽孢杆菌发酵培养,研究其淀粉酶产酶击览律,并研究了温度、pH、金属离子对酶学性质的影响。利用双倒数曲线法获得该酶的米氏常数Km[结果]随着发酵时闻的延长,发酵液中淀粉酶的含量提高。在培养30h时,产酶量达到最高。该淀粉酶的最佳反应温度和pH分别为40℃和7．5。该酶具有一定的熟稳定性,对酸碱条件较敏感。Na^＋、K^＋、Ca^2＋、Mg^2＋对该酶具有激活作用,Pb^2＋、Hg^2＋对该酶具有显著的抑制作用,Cu^2＋的影响不显著。该淀粉酶的米氏常数K为2．31×10^-3mol/L。[结论]该研究对该菌株淀粉酶的开发及工业应用具有较强的指导意义。     

枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质的生物功能分析

采用AKTA-epxlore层析系统,利用DEAE sepharose fast flow、Phenyl sepharose 6 F.F.和羟基磷石灰石柱层析后,分离纯化获得枯草芽孢杆菌Bs-916抗菌蛋白质Bacisubin.该蛋白质对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisease)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、白菜黑斑病菌(Alternaria oleracea)、甘蓝黑斑病菌(A. Brassicae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici (syd.) Butl.)和水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme Sheld)均有抑菌活性,尤其对Alternaria属的病原菌具有较高的毒力.枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质的抑菌机制是造成病原菌菌丝营养吸收困难,致使菌丝顶端膨大,分支增加,胞壁加厚、断裂,从而抑制了病原菌的生长.研究发现抗菌蛋白具有凝集素活性和核糖核酸酶活性,无蛋白酶活性和蛋白酶抑制活性.     

枯草芽孢杆菌D-29菌株发酵条件的优化

枯草芽孢杆菌D-29是一株具有广谱抑菌活性的生防菌株。对D-29菌株发酵条件进行了优化,结果表明,最佳初始培养基配方为:玉米粉10 g,麦芽糖30 g,碳酸钙1.5 g,豆粉30 g,水1 000 mL;最佳培养条件为:250 mL三角瓶装液量100 mL,初始pH值为7,接菌量1%,培养温度28℃,培养时间48 h,转速170¹90 r/min。