DREB 2A基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

研究提取盐处理的拟南芥植株叶片总RNA,用DREB2A基因特异引物通过RT-PCR扩增出1050bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的DREB2A基因序列同源性达100%。进一步将DREB2A基因分别克隆至植物表达载体卡盒pCCE12和pCC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的DREB2A基因植物表达载体pCDRE12和pCDR29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导的DREB2A基因对植物的遗传转化奠定基础。     

OsMAPK4基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以低温处理的耐盐水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板,用OsMAPK4基因特异引物通过RT-PCR扩增出1500bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的OsMAPK4基因序列同源性达99.4%,氨基酸同源性达99.1%。进一步将OsMAPK4基因分别克隆至植物表达载体卡盒pBCE12和pBC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pBME12和pBM29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导法转化植物,分析OsMAPK4基因的功能奠定了基础。     

乙肝病毒大包膜蛋白基因植物表达载体的构建及鉴定

构建包含编码乙肝病毒大包膜蛋白(L蛋白)基因的植物表达载体,并转化根癌农杆菌,为进一步制备转基因植物口服乙肝疫苗奠定基础。通过聚合酶链反应(PCR),以质粒pVAX1-L为模板扩增出L基因片段,插入到含有玉米特异性启动子的pCR2.1载体上;再用PCR技术扩增globulin-1-L融合片段,定向克隆到经过加工修饰的含有抗除草剂基因bar的双元表达载体pCAMBIA1300上,将重组质粒转化至农杆菌LBA4404中。HindⅢ和XbaⅠ双酶切证实,globulin-1-L融合片段已经插入到pCAMBIA1300上,测序结果说明克隆的靶基因序列与GenBank上公布的序列完全吻合。     

韧皮部特异性启动子的克隆及含绿色荧光蛋白报告基因新植物表达载体的构建

用PCR方法扩增得到了长度为966bp的笋瓜韧皮部蛋白2基因启动子片段,克隆人pUCm—T载体后,获得了新的重组质粒pUCm—PSP．分别用限制性内切酶酶切重组质粒和pCAMBIA1302植物表达载体,经回收、连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的新型植物表达载体pHZ03．利用细胞感受态法将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌Ri15834中．     

耐盐柳树抗虫基因Cry3A重组表达载体的构建

将苏云金芽孢杆菌Cry3A类抗虫基因经Bam HⅠ、SalⅠ双酶切后与植物表达载体p CAMBIA1304-C6连接,构建p CAMBIA1304-C6-Cry3A重组表达载体,将其转化到农杆菌LBA4404中,同时进行双酶切、测序及PCR鉴定。结果表明:双酶切及测序产物与预期扩增片段相符,重组表达载体p CAMBIA1304-C6-Cry3A构建成功;农杆菌LBA4404中含有重组质粒,成功构建了Cry3A农杆菌基因工程菌株。     

山葡萄几丁质酶基因VCH3的克隆及植物表达载体的构建

利用RT—PCR方法克隆了山葡萄几丁质酶基因VCH3的全长cDNA片段,并将该基因构建到双元载体pBI121质粒35S启动子下游,形成重组质粒pBIVCH3。通过冻融法将该重组质粒转化到根癌农杆菌LBA4404中,获得了植物表达载体。     

笋瓜韧皮部特异性启动子的克隆分析及新型植物表达载体构建

根据已报道具韧皮部组织特异性的笋瓜韧皮部蛋白2（PP2）基因序列设计引物,以山西本地种笋瓜叶片基因组DNA为模板,用PCR法扩增得到了长度为966bp的PP2基因启动子片段,克隆入pUCm—T载体后,经鉴定获得了新的重组质粒pUCm—PSP,测序和序列分析表明与两个已报道的片段分别有95％和99％的同源性,推测具有相似的启动子功能。分别用限制性内切酶PstⅠ和BglfⅡ双酶切重组质粒pUCm—PSP和由CaMV35S组成型启动子驱动GFP报告基因的双元植物表达载体pCAMBIA1302,分别回收pUCm—PSP重组质粒中的PSP小片段和pCAMBIA1302植物表达载体中去掉GFP报告基因上游CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动报告基因GFP的新型植物表达载体pHZ03。利用细胞感受态法将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌Ri15834中,为进一步研究其表达功能奠定了基础。     

OsMAPK7基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以低温处理的耐盐水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板,用OsCDPK7基因特异引物通过RT-PCR扩增出1 700 bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该序列与GenBank上的OsCDPK7基因序列相比,缺失了CDS序列中157￣234处的78个核苷酸,其编码的蛋白序列缺失了53￣78的26个氨基酸。但是缺失部分位于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性中心和钙结合基序等结构域之外,因此预计该基因产物应具备钙依赖的蛋白激酶活性。进一步将OsCDPK7基因分别克隆至植物表达载体卡盒pBE12和pB29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的OsCDPK7基因植物表达载体pBC7E12和pBC729A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导法转化植物,分析OsCDPK7基因的功能奠定了基础。     

抗除草剂bar基因植物表达载体的构建与抗性功能的检测

摘要：根据GenBank上发表的抗除草剂har基因序列设计引物,通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩增,获得har基因片段,连接在pMD18-T中间克隆载体上,用限制性内切酶XbaI和BamHI酶切后连接到pBI121上获得pBI121-bar。用HindⅢ内切酶切含Bt-4AB基因的质粒并与pBI121-bar重组,重组质粒命名为pBI121-bar／Bt。重组质粒导人农杆菌LBA4404工程菌中,转化新海24号棉花胚性愈伤组织。PPT抗性实验证明,构建的pBI121-bar／Bt载体获得抗除草剂抗性,并筛选出PPT临界筛选浓度为3．0mg／L。     

玉米抗草甘膦基因(sxglr-11)的构建与表达

将现有的抗草甘膦基因(sxglr-11)和带有Ubiquitin启动子的载体进行连接,用壮观霉素(spectino-mycin)抗生素标记,构建携带抗草甘膦基因(sxglr-11)的大肠杆菌。然后利用三亲杂交法,将构建的真核表达载体转入根瘤农杆菌菌株LBA4404。对菌落进行PCR检测以及质粒双酶切产物进行电泳检测,并用构建的工程菌转化玉米试管苗。研究结果表明,表达载体成功转入根瘤农杆菌LBA4404。     

纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与DREB1A基因双价植物表达载体的构建

本研究以pAHC17、pCD29A质粒为基础,分别构建了玉米泛蛋白(Ubi)启动子调控的纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与rd29A启动子调控的DREB1A基因的双价植物表达载体pBDB,pBDC。其植物选择标记基因为乙酰CoA转移酶基因(BAR),该载体适用于单子叶植物的遗传转化。并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为利用农杆菌介导法进行BGLⅠ,CBHⅡ和DREB1A基因对单子叶植物的基因工程研究奠定了基础。     

rip、chi及DREB1A多价基因植物表达载体的构建

实验构建了分别由rd29A、2×35S以及E12启动子调控的DREB1A、rip、chi三价基因植物表达载体pBDCR,通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为将上述基因联合导入植物从而培育具有广谱抗菌性和抗渗透胁迫的转基因植物新品种奠定基础。     

纤维素酶基因（BGLI、CBHⅡ）与DREBIA基因双价植物表达载体的构建

本研究以pAHCl7、pCD29A质粒为基础，分别构建了玉米泛蛋白（Ubi）启动子调控的纤维素酶基因（BGLI、CBHII）与rd29A启动子调控的DREBlA基因的双价植物表达载体pBDB，pBDC。其植物选择标记基因为乙酰CoA转移酶基因（BAR），该载体适用于单子叶植物的遗传转化。并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中，为利用农杆菌介导法进行BGLI，CBHlI和DREBlA基因对单子叶植物的基因工程研究奠定了基础。     

rd29A启动子克隆及对低温响应的研究

研究从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA克隆了rd29A基因启动子,序列分析表明该启动子具有两个干旱、高盐和低温响应顺式作用元件(DRE),在851～856 bp碱基处为TATA box,其它主要调控区域也存在。然后,分别用rd29A启动子和CaMV 35S启动子,构建了具有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pBIG和pBIRG。通过基因枪导入法转化洋葱表皮细胞,在25 ℃和4 ℃条件下培养16 h后,用荧光显微镜观察GFP基因的表达水平。结果表明,在低温条件下,rd29A启动子的活性明显高于CaMV 35S启动子,说明rd29A启动子是一低温诱导型启动子,可满足在低温条件下使目的基因在转基因植物中进行表达的目的。     

纳豆激酶植物高效表达载体的构建

纳豆激酶来源于日本的传统食品—纳豆,是一种具有强烈溶栓作用的蛋白激酶,将编码纳豆激酶的基因克隆到含C aM V 35S控制下的双元表达载体pCAM B IA 1300中,PCR结果表明,纳豆激酶基因正向插入到载体中,再通过冻融法将其导入根癌农杆菌LBA 4404中,从而成功地构建了能在植物中高效表达的植物载体,为用植物作为生物反应器来获取纳豆激酶蛋白提供了一条新途径。