产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立产气荚膜梭菌α毒素的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,本研究以抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体(MAb)为捕获抗体,抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体为检测抗体,建立了检测α毒素的DAS-ELISA。通过优化反应条件,建立标准曲线;并对建立的DAS-ELISA方法进行性能评价及初步应用。采用该方法测定产气荚膜梭菌α毒素的最低检测限为0.353倍的小鼠LD_(50),可定量范围为0.353~90.368倍小鼠LD_(50)。结果表明该DAS-ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可以用于大批量样品检测。初步应用结果显示:患产气荚膜梭菌病的兔群肠内容物中产气荚膜梭菌的α毒素水平显著高于健康兔群(p0.05)。本研究检测α毒素的DAS-ELISA建立有助于畜禽产气荚膜梭菌病的诊断及研究。     

D型产气荚膜梭菌主要毒素基因的PCR检测

为了研究产气荚膜梭菌主要毒素基因,试验采用生物软件以NCBI上登录的产气荚膜梭菌α毒素、ε毒素作为参考,设计扩增D型产气荚膜梭菌α毒素与ε毒素的特异性引物,预期基因片段大小分别为1 110 bp、888 bp,进行PCR扩增。结果表明:设计的引物可以良好地扩增α毒素基因与ε毒素基因,基因片段大小与预期一致。     

动物源A型产气荚膜梭菌流行情况调查及α毒素基因分析

产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病原菌,在一定条件下可引起多种严重疾病。为了调查不同动物A型产气荚膜梭菌流行情况及α毒素基因同源性,本试验从不同地区共采集病料307份,其中鸡133份(包括肉鸡112份、蛋鸡21份)、鸭65份、犬31份、猪14份、兔子20份、小鼠9份、牛粪便18份、鸵鸟粪便17份。取肠道内容物和粪便进行产气荚膜梭菌分离鉴定和毒素基因分型,并检测cpe、β2毒素基因携带率;从不同地区、不同动物源A型产气荚膜梭菌分离株挑选18株进行α毒素基因扩增,将所得基因序列进行同源性比较。结果显示,307份样品中68份(22.1%)呈产气荚膜梭菌阳性,不同动物源产气荚膜梭菌阳性率介于5.9%～44.4%;68株产气荚膜梭菌分离株α毒素基因阳性率为100%,所有分离株毒素基因分型均为A型,未检测到cpe毒素基因,β2毒素基因总阳性率为63.2%;分离株与NCBI参考菌株α毒素基因相似性介于97.8%～100%。结果表明,不同动物α毒素具有很高的同源性,本调查为研发A型产气荚膜梭菌α毒素通用疫苗提供数据支持。     

产气荚膜梭菌α毒素免疫组化检测方法的建立

为建立检测产气荚膜梭菌α毒素的方法,本研究以抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体为特异性检测抗体,对人工腹腔注射α毒素的病死兔器官组织进行免疫组化染色,经反应条件优化,建立了产气荚膜梭菌α毒素的免疫组化检测方法。应用该方法对临床16例疑似产气荚膜梭菌病兔组织中的α毒素进行检测,同时进行病原菌分离鉴定。结果显示,该方法可以检测到人工感染兔心脏、肺脏、脾脏、肾脏、膀胱、肝脏、胃、小肠、盲肠和延脑中的α毒素分布,对照组则均为阴性,具有良好的特异性;临床应用检测结果表明:16例疑似病兔胃和肾脏中α毒素的检测均为阳性,检测阳性率高于细菌分离培养。本研究建立的该方法可以用于产气荚膜梭菌病的临床诊断,也为该毒素在动物机体内的分布规律及致病机理的研究提供了可靠的手段。     

犬产气荚膜梭菌的分离和PCR检测方法的建立

从12头疑似产气荚膜梭菌感染的猝死警犬中分离获得了18株病原菌，经生化试验及毒素中和试验，确定为A型和C型产气荚膜梭菌。参考GenBank中登录的基因序列，设计合成了针对产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、CPE和β2共6对分型毒素基因的引物，对以前昆明地区分离的1株产气荚膜梭菌进行了PCR扩增，结果扩增出了与预期大小相同的6个基因片段，分别为233、196、324、446、567和665 bp。建立的PCR方法能同时用于产气荚膜梭菌鉴定和毒素分型，较细菌毒素检测方法快速，与细菌分离鉴定的结果一致。     

A型产气荚膜梭菌α毒素的研究进展

α毒素（CPA）是产气荚膜梭菌最重要的毒素之一,而且也是A型产气荚膜梭菌最主要的毒力因子。Macfarlane首先发现α毒素的本质为酶,它具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性。产气荚膜梭菌是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症、人类的食物中毒和创伤性气性坏疽的主要病原菌之一,该菌分为A、B、C、D、E5型,其致病因子是菌体产生的外毒素。本文主要综述了A型产气荚膜梭菌α毒素的基本特征、结构、功能、检测技术等方面的研究进展。     

产气荚膜梭菌肠毒素的分子生物学研究进展

产气荚膜梭菌(Clostridum perfringens)是一类G 产芽胞的厌氧梭菌,可以引起人食物中毒和家畜气肿疽,其致病性很大程度取决于产生不同的外毒素.目前至少已鉴定出20余种不同的产气荚膜梭菌的毒素.根据产气荚膜梭菌的4种主要毒素(α,β,ε,т),可以将产气荚膜梭菌分为A～E5个型.……     

羊梭菌病快速鉴别PCR方法的建立及初步应用

根据GenBank已公布的产气荚膜梭菌和腐败梭菌的α毒素基因序列,分别设计并合成针对2种α毒素基因的特异性引物,通过扩增条件的优化,建立快速鉴别产气荚膜梭菌和腐败梭菌的双重PCR方法。特异性试验显示,产气荚膜梭菌和腐败梭菌参考菌株均扩增出了相应的预期目的条带,而大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和链球菌则均未能扩增出相应条带。灵敏度试验结果显示,产气荚膜梭菌和腐败梭菌基因组DNA最低检测量分别为17.95pg/μL和1.261pg/μL。应用该方法对样品进行检测,其中5份为产气荚膜梭菌阳性。成功建立了特异性强、敏感性高的双重PCR方法,可以有效进行产气荚膜梭菌和腐败梭菌的快速鉴别,对羊梭菌病病原快速鉴定及流行病学调查具有重要意义。     

抗产气荚膜梭菌ε毒素单克隆抗体的研制和部分特性鉴定

小鼠ＳＰ２／０骨髓瘤细胞和用产气荚膜梭菌ε类毒素免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠的脾细胞，以ＰＥＧ为融合剂进行融合，获得分泌抗产气荚膜梭菌ε毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株１３株，经鉴定，杂交瘤所分泌的单克隆抗体在ＥＬＩＳＡ中均特异地与产气荚膜梭菌ε毒素反应，而不与α和β毒素反应，１３株单克隆抗体均为ＩｇＧ１亚类，经毒素抗毒素中和试验测定，１３株单克隆抗体中，１２株具有中和ε毒素的活性。     

腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素的 共表达及其免疫效力评价

为获得腐败梭菌α毒素和D型产气荚膜梭菌ε毒素的共表达产物,并鉴定其致死活性和反应原性,评价其免疫保护效力,利用PCR扩增腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因Gcsa和Gcpe并克隆至pETDuet-1质粒,转化E.coli BL21(DE3),自诱导培养基诱导这2段基因共表达;用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清中和试验对表达产物进行鉴定;将诱导后的大肠杆菌灭活,制成铝佐剂疫苗1 m L/只皮下注射免疫家兔2次,测定免疫血清中和抗体效价,用1 MLD的腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素分别攻击。结果显示,所构建的E.coli BL21(pETDuet-Gcsa-Gcpe)可以同时表达Gcsa和Gcpe,表达产物能够与腐败梭菌和D型产气荚膜抗毒素血清反应;且具有小鼠致死毒性,只有用2种抗毒素一同作用,才能将其毒性中和;制成灭活疫苗免疫家兔,免疫血清对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为2 MLD/0.1 m L,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价≥50 MLD/0.1 m L;用2种毒素攻击,免疫组家兔全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典》(2015版)效力检验标准。结果表明,所构建的表达载体可以实现α毒素和ε毒素的活性共表达,本研究为腐败梭菌和产气荚膜梭菌的多联基因工程灭活疫苗的研究提供了实验基础。     

产气荚膜梭菌主要毒力因子的分子生物学研究进展

产气荚膜梭菌（Clostridium aerogenes capsulatus)又名镶边梭菌（C.Perfringens)，魏氏梭菌（C.welchii)，为一类G＋产芽胞的厌氧杆菌，其致病作用一般由它产生的胞外酶或毒素诱导，最重要的就是α－毒素和θ－毒素，此外，其它的一些胞外酶，如胶原酶E，透明质酸酶（μ－毒素）DNA酶和神经节苷酶（唾液酸酶）的病理作用也已经阐明，人和动物食物中毒主要与该菌在芽胞形成过程中产生的一种芽胞相关蛋白（肠毒素）有关，随着产气荚膜梭菌分子生物学领域的飞快发展，各种主要毒素和肠毒素基因均已克隆成功，本文重点针对产气荚膜梭菌α－毒素，θ－毒素，神经节苷酶以及肠毒素和芽胞形成的分子机制等方面的研究进展作一综述。     

产气荚膜梭菌所致动物猝死症

产气荚膜梭状芽胞杆菌 (Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ)简称产气荚膜梭菌 ,又称魏氏梭菌 (Ｃｌｏｓｔｒｄｉｕｍｗｅｌｃｈｉｉ) ,根据该菌产生的α、β、ε、ι 4种主要毒素 ,将其分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ 5型。1 994年笔者报道了国外由Ａ、Ｂ、Ｃ型菌感染或混合感染所致仔猪坏死性肠炎的猝死症。近年国内也时有由产气荚膜梭菌Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ五型菌所致多种家畜猝死症的报道。现将产气荚膜梭菌所致疫病、所产毒素及近年国内由产气荚膜梭菌所致家畜猝死症概述如下。1　产气荚膜梭菌所致疫病及所产毒素类型毒素中和试验对…     

致病性梭菌毒素产生的因素Ⅰ,产气荚膜梭菌与诺氏梭菌

产气荚膜梭菌B型、D型及诺氏梭菌B型等五个菌株,在最好的蛋白胨培养基中,产气荚膜梭菌能产生β毒素;在番木瓜蛋白酶(Papain)消化肉汤中能产生ε毒素。熟肉基能产生诺氏梭菌α毒素。这三种毒素产量最高所需要的时间,分别为4、48与120小时,最     

产气荚膜梭菌毒素基因分型PCR检测方法的建立及初步应用

建立一种快速鉴别诊断不同型产气荚膜梭菌的PCR检测方法,为动物产气荚膜梭菌病的快速诊断及流行病学调查提供有效的技术手段。克服传统鉴定方法耗时长、费用高的缺点,提高了检测效率。通过对产气荚膜梭菌α毒素、β毒素、ε毒素和ι毒素基因序列分析,利用Premier5.0软件设计并合成了5对特异性引物,建立了针对5种不同型产气荚膜梭菌的PCR鉴别诊断方法。通过反复试验确定了最佳退火温度为53℃。通过灵敏度试验表明,PCR检测方法最低能检测到的DNA浓度α毒素为308pg/μL,β毒素、ε毒素为30.8pg/μL,ι毒素A为0.122pg/μL,ι毒素B为0.05pg/μL。通过特异性试验表明,本方法具有较高的特异性。同时,通过对本方法检测出的阳性样品16S rRNA序列分析发现,与GenBank中的其他产气荚膜梭菌的16S rRNA序列同源性均在98%以上。表明建立的检测方法灵敏度高、特异性强,可以应用于动物产气荚膜梭菌病的实验室诊断。     

产气荚膜梭菌ε毒素研究进展

产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患细菌性传染病病原,在自然界中分布极广,一定条件下可引起多种疾病。该菌常通过其外毒素危害人和动物机体,所产毒素主要有α、β、ε和ι4种外毒素。根据毒素产生的情况,将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E、F和G 7个型。ε毒素毒力最强,主要由B型和D型菌分泌。论文通过致病机理、病理变化、流行特点及相关疫苗研究方面对产气荚膜梭菌ε毒素研究进展进行综述,以期为产气荚膜梭菌病的防控提供参考。     

A型产气荚膜梭菌α毒素的提纯试验

应用硫酸铵盐析、SephadexG 2 5和SephadexG 1 0 0层析的方法提纯A型产气荚膜梭菌α毒素 ,并利用卵磷脂水解试验监测α毒素的析出峰。结果表明 ,以 50 % (W/V)硫酸铵盐析A型产气荚膜梭菌α毒素 ,经SephadexG 2 5过柱后能很好地层析脱盐 ,并初步提纯 ,再经SephadexG 1 0 0层析后则能得到相对较纯的α毒素。该方法快速、简便     

抗产气荚膜梭菌ε毒素单克隆抗体的研制和部分特性鉴定

小鼠SP2/0骨髓瘤细胞和用产气荚膜梭菌ε类毒素免疫BALB/C鼠的脾细胞,以PEG为融合剂进行融合,伙得分泌抗产气荚膜梭菌ε毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株13株。经鉴定,杂交瘤所分泌的单克隆抗体在ELISA中均特异地与产气荚膜梭菌ε毒素反应,而不与α和β毒素反应。13株单克隆抗体均为IgG_1亚类,经毒素抗毒素中和试验 测定,13株单克隆抗体中,12株具有中和ε毒素的活性。     

反刍动物源产气荚膜梭菌新疆流行株的分离鉴定及分型研究

为了弄清反刍动物源产气荚膜梭菌新疆流行株的生物学特性和分子特征,本研究从新疆不同地区规模化养殖场和屠宰场采集158份牛羊临床病料,进行产气荚膜梭菌的分离培养;通过形态学、生化特性、16S rRNA序列分析对产气荚膜梭菌分离株进行鉴定;利用多重PCR技术扩增产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、β2基因,将测序结果与NCBI数据库比对进行新疆流行株的基因分型。结果从158份临床病料中共分离出产气荚膜梭菌67株,形态学、生化和16S rRNA序列分析鉴定结果均为产气荚膜梭菌。毒素基因检测表明,其中α基因检出率为100.00%(67/67),ε基因检出率为17.91%(12/67),β2基因检出率为37.31%(25/67),β、ι基因未检出。毒素基因分型可将产气荚膜梭菌新疆流行株分为A、D型,其中A型占82.09%(55/67),D型占17.91%(12/67),提示产气荚膜梭菌新疆流行株优势型别为A型。本研究为产气荚膜梭菌流行病学研究和防控提供科学依据。     

鸡坏死性肠炎de诊断与防治

一．历史、分布１９６１年，Parish首次报道了家禽的坏死性肠炎，并用病原魏氏梭菌复制出了本病。以后世界大多数养鸡地区都有类似的病例报道，我国一些养鸡地区，先后都报道过多起鸡坏死性肠炎。本病又称梭状芽胞杆菌肠炎（Clostridialenteritis）、菌群失调症（dysbacte－riosis）或小肠细菌生长过度症（SIBO）。病死禽以肝肿大，肠道出血，肠黏膜有麸皮样坏死灶为特征。二．病原坏死性肠炎的病原为A型和C型产气荚膜梭菌。产气荚膜梭菌的部分菌株在体外培养等产生毒素较少，难以分型。A型和C型产气荚膜梭菌产生α毒素，产气荚膜梭菌C…     

产气荚膜梭菌α毒素的研究进展

产气荚膜梭菌 (Clostridiumperfringens)的致病作用一般由它所产生的胞外酶或毒素诱导。主要有α -毒素、β -毒素、θ -毒素及其他的一些胞外酶。本文针对产气荚膜梭菌α毒素的组成、结构、理化性质、作用机理及分子遗传等方面的研究进展作了简要综述。