山羊胎儿睾丸细胞体外分离培养及雄性生殖系干细胞的生长行为

摘要：采用4种不同的处理方法消化山羊胎儿睾丸组织，其中0.1%的胶原酶Ⅰ处理15 min后， 用0.25%胰酶处理5 min，经3次洗涤，睾丸细胞分散较好。用不同的培养体系体外培养，结果显示：原代培养山羊胎儿睾丸细胞培养120 h左右，获得桑椹状雄性生殖系干细胞(mGSCs)集落和单层支持细胞，mGSCs集落呈半悬浮式隆突生长，mGSCs集落和支持细胞分区明显；传代培养显示，在小鼠成纤维细胞饲养层上， mGSCs集落和mGSC单细胞被同质化程度较显著，而含有支持细胞的mGSC单细胞和mGSCs集落被同质化程度较弱；传代mGSCs集落和支持细胞共培养体系中，mGSCs集落正常生长，而且集落中细胞间隙紧密，mGSCs分化较慢。     

山羊乳腺上皮细胞的培养及EGFP基因转化

用组织块培养法获得山羊乳腺细胞原代培养物，并根据山羊乳腺成纤维细胞与上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同将二者分离纯化。对细胞形态进行光镜观察发现：纯化的山羊乳腺上皮细胞传代至第15代时其生长仍正常。纯化的乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构，呈乳头状，称之为乳球体；乳腺上皮细胞可产生并分泌乳汁。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型，大多数上皮细胞呈短梭形或多角形，呈蜂窝状；部分细胞呈圆饼状，体积较大；部分细胞呈长形。采用电穿孔法将绿色荧光蛋白（EGFP）基因转化体外培养的山羊乳腺上皮细胞，荧光显微镜下观察到EGFP基因的表达。     

小鼠精原细胞体外增殖与冷冻保存

利用一步酶法将7日龄昆白系小鼠睾丸分离获得生精上皮单细胞悬液(主要含精原细胞和支持细胞),分别接种于D-MEM、D-MEM/F12和KSOM后,系统研究其精原细胞的存活和增殖情况,并对生精上皮单细胞、曲细精管及完整睾丸进行了-70℃冷冻保存,同时对生精上皮单细胞进行了液氮冷冻(-196℃)保存。结果表明,小鼠精原细胞在D-MEM和D-MEM/F12中均能存活并增殖,表现为在培养的第1～9天/1～8天呈逐渐减少趋势,第9～13天/8～12天呈增殖趋势,第17天/16天以后增殖减缓,而在KSOM中只短暂存活不能增殖。生精上皮单细胞、曲细精管及完整睾丸-70℃短期(1周和2周)冷冻保存及单细胞悬液液氮短期(2周)和中长期(1和3个月)冷冻保存后,均可获得较理想的细胞存活率(均大于85%)。     

黑麂耳成纤维细胞培养及异种重构胚构建

黑麂(Muntiacus crinifrons)是我国特有的珍稀濒危物种。采用组织块贴壁法获得了纯化的黑麂耳成纤维细胞。用3种不同的培养液(DMEM(低糖)、DMEM(高糖)和RPMI-1640)对第3代细胞进行培养,结果细胞群体倍增时间相近,DMEM(低糖)的培养效果稍好。以黑麂耳成纤维细胞为核供体,以山羊和兔卵母细胞为胞质受体,通过核移植构建异种克隆胚,囊胚率分别为0和11.5%,结果表明两种胞质受体均能支持黑麂耳成纤维细胞核的重编程,但重构胚的发育能力有所差别。     

小鼠精原细胞体外存活、增殖特性及冷冻保存研究

为研究小鼠精原细胞体外存活、增殖特性及其以单细胞或处于功能性结构中(曲细精管或完整睾丸)耐受冷冻-解冻程序的能力。本研究收集生后7d昆白系小鼠睾丸，一步酶法分离获得生精上皮单细胞悬液(主要含精原细胞和支持细胞)，分别接种于D-MEM、D-MEM/F12、KSOM（均含10%的FBS）后系统观察了精原细胞的存活和增殖情况；对生精上皮单细胞进行了-70℃冷冻保存和液氮冷冻保存，对曲细精管及完整睾丸进行了-70℃冷冻保存。结果显示，D-MEM和D-MEM/F12均能使小鼠精原细胞存活和增殖，精原细胞分别在培养的第1~9d或第1~8d 呈逐渐减少趋势，第9~13d或第8~12d呈增殖趋势，而第17d或第16d以后增殖减缓，KSOM只能使小鼠精原细胞短暂存活而不能使其增殖。精原细胞单独培养时增殖不明显而逐渐呈现出分化迹象。生精上皮单细胞、曲细精管及完整睾丸-70℃短期(1wk和2wk)冷冻保存或单细胞悬液液氮短期(2wk)和中长期(1个月和3个月)冷冻保存后均可以获得较理想的细胞存活率(均大于85%)。     

西农萨能羊胰岛素诱导基因2(INSIG2)的克隆及组织表达分析

胰岛素诱导基因2(insulin induced gene2,INSIG2)是参与脂质形成和代谢调控的重要基因,而山羊乳腺中脂质合成和代谢与乳品质密切相关。为进一步明确它们之间的关系进而为改善山羊乳品风味提供科学支持。本实验以西农萨能羊(Capra hircus)乳腺组织为研究材料,采用RT-PCR技术克隆山羊INSIG2基因,并采用实时荧光定量(RT-qPCR)技术在山羊10个组织中对INSIG2基因进行了组织表达分析。研究获得了915bp的cDNA序列(GenBank登录号:JQ361767),其中编码区678bp,该基因编码225个氨基酸,预测蛋白质分子量为24.8730kD,等电点(pI)为8.77。通过核苷酸和氨基酸序列比对分析发现,山羊的INSIG2与GenBank中牛(Bos taurus)的相似性最高。蛋白质结构分析显示,INSIG2存在6个跨膜螺旋;疏水性分析发现,其N端和C端均具有亲水性;遗传距离分析发现,山羊与牛的亲缘关系最近,其次是猪(Susscrofa)。INSIG2基因的组织表达分析表明,INSIG2基因在10个被检测组织中均有表达,且肺组织中表达量最高,肌肉次之,乳腺组织的表达量居中,心脏组织中最低。研究结果为该基因在山羊乳腺组织中的功能研究提供依据。     

猪核移植供体细胞的分离培养及传代的研究

通过对猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代的研究,摸索出一套猪体细胞的分离、培养和传代的方法,建立了猪的供体细胞系。研究结果表明:猪的卵丘细胞单层的生长需要5~6 d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞,组织块法单层的生长需要10~11 d,酶消化法需要8~9 d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系,这些供体细胞培养方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞材料来源。     

EMS离体诱变及抗草莓灰霉病愈伤组织的筛选

试验用甲基磺酸乙酯（EMS）处理草莓愈伤组织后通过草莓灰霉病病原毒素（Toxin）离体筛选获得抗病愈伤组织并诱导成苗。EMS诱变处理‘幸香’草莓离体叶片产生的愈伤组织,用经毒力检测的草莓灰霉菌毒素粗提液进行离体筛选,通过在愈伤组织继代培养中附加不同浓度毒素粗提液,以确定适宜的抗病选择压,获得抗灰霉病突变体材料。结果表明,将愈伤组织直接进行EMS处理的成活率高于将愈伤组织切割成小块继代培养再经EMS处理的愈伤组织;且0.2% EMS处理1h为最适剂量。在含80%毒素粗提液的培养基培养10 d为抗性筛选的适宜选择压。诱变处理后的867块愈伤组织,在经不连续二次筛选后有195块成活,成活率22.5%,其中有82块再生出了不定芽,再生率为42.1%。不定芽经生根后移栽至田间进一步进行抗性鉴定。     

山羊角膜内皮细胞的分离培养与鉴定

摘要：比较四种原代角膜内皮细胞分离培养方法,并对分离培养的山羊角膜内皮细胞生长特性进行初步研究。取屠宰1～2月龄关中奶山羊角膜,无菌分离角膜内皮层和Descemet’s membrane,分别用组织块法、胰蛋白酶法、dispase法和dispase加胰蛋白酶法分离培养原代角膜内皮细胞,比较这四种方法处理后细胞离散和贴壁情况。结果显示,dispase加胰蛋白酶法为最佳分离纯化角膜内皮细胞的方法。分离的细胞经形态学观察、免疫组化染色、Giemsa染色、扫描电镜和透射电镜等方法鉴定为角膜内皮细胞。说明dispase加胰蛋白酶法为角膜内皮细胞分离培养的理想方法,该方法可为哺乳动物角膜内皮细胞的理论研究和构建组织工程化人工角膜内皮提供种子细胞。     

接种单细胞微生物对土壤团聚体形成及其稳定性的影响

将根瘤菌（Rhizobium sp.）G-01、肠杆菌（Enterobacter sp.）San8及粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）R1等3株产胞外多聚物（Extracellular polymeric substances,EPS）的单细胞微生物接种于供试土壤,进行土培试验和盆栽黄瓜试验,研究接种微生物及作物根系对土壤团聚体形成、团聚体组成变化的影响。结果表明,3株单细胞微生物分泌EPS的量分别为2.12 mg（1010 cells）?1、0.56 mg（1010 cells）?1、172.71 mg（1010 cells）?1,其主要组分是多糖、其次是蛋白质,且含有羟基、羧基、羰基等官能团;土培试验后,接种产EPS单细胞微生物处理土壤的大团聚体（> 0.25 mm）含量比接种丝状微生物处理提高了71.31%,而盆栽试验后各处理土壤的大团聚体含量（> 0.25 mm）比土培试验后土壤显著增加,这可能是由于植株根系挤压及其分泌物作用促进了土壤大团聚体形成并提高了团聚体稳定性所致。