陆地棉TLP基因家族的全基因组鉴定及表达分析

【目的】类甜蛋白(Thaumatin-like proteins,TLP)参与多种植物病原真菌侵染后的防御反应。本研究通过在全基因组分析TLP基因,为深入探究其在介导棉花抗黄萎病通路中的分子机理提供基础。【方法】分别利用生物信息学方法和荧光定量聚合酶链式反应技术对陆地棉中的TLP基因进行全基因组鉴定和响应棉花黄萎病菌侵染表达分析。【结果】共鉴定出88个TLP基因;通过系统发育分析和序列特征分析可将棉花TLP家族分为10类。TLP基因家族外显子数量介于1～5之间,内含子介于0～4之间,同组成员具有相似的基因结构。大部分TLP含有5个保守的motif,具有相同的基序组织模式,均为Motif 5_4_2_3_1。染色体定位显示87个TLP基因定位于陆地棉20条染色体上,其中A亚组和D亚组各分布有42和45个,其在染色体上的分布存在串联重复现象。响应病原菌侵染表达分析显示,黄萎病菌侵染可以诱导6个候选基因的表达,不同抗性品种相对表达量达到峰值的时间不同,且耐病品种(GZ-1)上述基因表达量比感病品种(86-1)有增高的趋势。【结论】该研究结果有助于了解棉花TLP基因家族的进化与功能。     

香蕉过氧化物酶基因表达和酶活性与香蕉抗枯萎病的关系

为了获得能反应香蕉遭受枯萎病侵染的标记基因。通过随机克隆测序的方法从香蕉根系cDNA文库中获得一个过氧化物酶基因,命名为MaPOD1（GenBank登录号为KC478598）。扩增获得的cDNA序列与质粒序列一致,表明该基因是香蕉POD基因编码框全长cDNA,包含一个948 bp的最大开放阅读框,编码一个长328个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有过氧化物酶活性位点和亚铁血红素配体位点结构。实时荧光定量PCR分析表明该基因在香蕉根和假茎中表达量较高;在球茎中的表达量最低。在耐病和感病品种中,MaPOD1均上调表达,但在耐病品种中MaPOD1在所有时间点相对于对照增加的倍数均高于感病品种,表明在该基因在香蕉的抗病性中起着重要作用。该基因的表达与酶活变化趋势相同,基因表达滞后于酶活变化。MaPOD1可以作为一个新的响应枯萎病侵染的标记基因。     

FOC4的2个过氧化氢酶基因的克隆与表达分析

为探讨香蕉枯萎病菌与寄主互作过程中过氧化氢酶的作用,分别利用硫酸钛法和羟胺氧化法测定了尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(FOC4)侵染香蕉苗根部后H2O2及超氧阴离子(O2?–)的含量变化;同时,借助Genbank中香蕉枯萎病病原菌Fo5176菌株基因组信息,采用RT-PCR方法克隆获得了FOC4的2个过氧化氢酶基因cDNA序列并对其进行了生物信息学分析以及在外源H2O2和普通巴西蕉苗诱导下的不同阶段表达模式分析。结果表明,FOC4的侵染能引起香蕉苗根部H2O2及超氧阴离子的含量增加,香蕉苗根部存在活性氧迸发;2个过氧化氢酶中,一个为孢子特异的过氧化氢酶,另一个为细胞质特异的过氧化氢酶;在香蕉苗及外源H2O2诱导下,2个过氧化氢酶表达均有上调,其中Foc4 CatalaseA可能是消除强氧化胁迫环境起主要作用的过氧化氢酶之一。     

海岛棉枯萎病抗性与类黄酮代谢相关基因表达量的相关

枯萎病是危害海岛棉生产的重要因素之一, 研究枯萎病抗性分子机制将为培育抗病海岛棉品种、解决枯萎病对海岛棉的危害问题提供坚实的基础。本研究在前期转录组测序的基础上, 对海岛棉枯萎病抗性差异表达基因进行分析(DEG, Differentially Expressed Gene); 以7个抗病性表现不同的海岛棉品种为材料, 利用qRT-PCR的方法研究抗病差异表达基因在不同接菌时间点的表达量差异, 并分析基因表达量与病情指数的相关性。结果表明, DEG分析得出类黄酮代谢通路相关基因与海岛棉枯萎病抗性有关。qRT-PCR分析显示抗病材料中类黄酮代谢通路关键基因的表达量显著高于感病材料。在接菌后多个时间点, 类黄酮代谢通路中的关键基因TT7、CHI和DFR在抗病材料中的表达量显著或极显著高于感病材料, 其中CHI和DFR基因的表达量与病情指数呈显著负相关。综上所述, 类黄酮代谢通路相关基因对海岛棉枯萎病抗性均有影响, 且CHI、TT7和DFR基因是关键基因。     

海岛棉枯萎病抗性与类黄酮代谢途径基因表达量的相关性

枯萎病是危害海岛棉生产的重要因素之一,研究枯萎病抗性分子机制将为培育抗病海岛棉品种、解决枯萎病对海岛棉的危害问题提供坚实的基础。本研究在前期转录组测序的基础上,对海岛棉枯萎病抗性差异表达基因进行分析(Differentially Expressed Gene,DEG);以7个抗病性表现不同的海岛棉品种为材料,利用qRT-PCR方法研究抗病差异表达基因在接种0~40 h的表达量差异,分析基因表达量与病情指数的相关性。结果表明,DEG分析得出类黄酮代谢通路相关基因与海岛棉枯萎病抗性有关。qRT-PCR分析显示抗病材料中类黄酮代谢通路关键基因的表达量显著高于感病材料。在接菌后多个时间点,类黄酮代谢通路中的关键基因TT7、CHI和DFR在抗病材料中的表达量显著或极显著高于感病材料,其中CHI和DFR基因的表达量与病情指数呈显著负相关。综上所述,类黄酮代谢通路相关基因对海岛棉枯萎病抗性均有影响,且CHI、TT7和DFR基因是关键基因。     

香蕉内生拮抗细菌KKWB-5的几丁质酶在大肠杆菌中的表达纯化与复性研究

将香蕉内生拮抗细菌KKWB-5的几丁质酶在大肠杆菌中的表达,旨在检测该酶对香蕉枯萎病病原菌4号小种的抗性。PCR扩增该基因连入大肠杆菌表达载体pET22b,导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组菌株,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达,对目的蛋白进行纯化,并将纯化后的目的蛋白复性,对复性产物进行水解几丁质活性和拮抗香蕉枯萎病活性的分析。SDS-PAGE分析表明目的蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式大量表达,经变性Ni2+柱纯化得到了高纯度的重组蛋白,表达量达293 mg/L;稀释和透析两种复性方法中,透析复性法的目的蛋白得率较高,为84.6 %。复性后的目的蛋白具有水解几丁质的活性,同时对香蕉枯萎病病原菌也具有一定的抗性,但抗性较弱。该几丁质酶在大肠杆菌中得到高效表达,且复性后的几丁质酶对香蕉枯萎病病原菌4号小种有一定的抑制作用,该酶对KKWB-5菌株拮抗香蕉枯萎病菌的能力有一定的贡献。     

海岛棉枯萎病抗性与糖基转移酶类基因表达量的相关性

枯萎病是危害海岛棉生产的重要因素之一，研究枯萎病抗性分子机制是培育抗病海岛棉品种的分子基础。基于对前期转录组测序数据分析，本研究对参与海岛棉抗枯萎病调控的糖基转移酶基因进行了初步研究，以8个不同抗病性的海岛棉品种为材料，在枯萎病菌处理后，利用实时荧光定量PCR检测9个棉花抗枯萎病相关基因进行表达量分析，结果表明，GB＿A03G0575在海岛棉枯萎病侵染过程中随着时间的推移，表达量会先减少再增加，推断其可能在受到病菌胁迫时植物生长会受到影响。GB＿A13G1825和GB＿A11G1787基因在抗病材料中的表达量会比感病材料的多，最大表达量出现的时间，感、抗材料基本一致，推测这些基因对抗病有一定影响，表明在抗病过程中三个基因可能起着比较重要的作用。本研究结果为海岛棉抗枯萎病育种及抗病机理提供候选基因资源。     

香蕉MaWRKY28基因的克隆及其功能分析

为探究香蕉WRKY28基因响应Foc-TR4侵染的作用及调节机制,本研究从抗病‘桂蕉9号’品种中克隆了香蕉MaWRKY28基因;利用ExPASy、MEGA 6.0等软件对其蛋白序列进行理化性质分析及系统进化树的构建;采用q RT-PCR分析了该基因在抗(‘桂蕉9号’)、感(‘威廉斯’)香蕉品种受Foc-TR4侵染不同时间后的表达量变化;构建过表达MaWRKY28基因载体,转化拟南芥,并检测该基因在转化植株中的表达量。结果表明,从‘桂蕉9号’中克隆了一个WRKY28基因,命名为MaWRKY28 (GenBank登录号为MK941141)。MaWRKY28基因编码区全长999 bp,编码332个氨基酸,属于不稳定的分泌蛋白,具有典型的WRKY结构域;系统进化树分析表明,香蕉与海枣(Phoenix dactylifera)、油棕(Elaeis guineensis)的同源性最高,相似性高达87%;qRT-PCR结果显示,在Foc-TR4侵染的香蕉根系过程中,MaWRKY28基因呈上调表达趋势,且在抗病品种中的表达量整体高于感病品种;筛选获得的7株阳性转化拟南芥植株中,MaWRKY28基因的相对表达量较野生型均显著提高。综上说明,MaWRKY28基因在香蕉抗枯萎病菌侵染过程中参与了抗病相关过程,且能在异源受体拟南芥中成功转化并高效表达。本研究结果为进一步研究香蕉抗病品种的抗性机理提供了帮助。     

Pi-ta在不同单倍型水稻品种与稻瘟病菌互作中的表达量分析

本研究利用q RT-PCR分析Pi-ta基因在受侵染的不同单倍型云南水稻地方品种中的表达量,初步分析Pi-ta基因在受侵染的不同单倍型地方水稻品种中的表达差异。将含有无毒基因AVR-Pita的稻瘟病菌株O-137喷雾接种不同单倍型的云南水稻地方品种,分别于接种0 h、48 h取样,提取接种水稻叶片总RNA,逆转录成c DNA,q RT-PCR检测O-137接种不同云南水稻地方品种后不同时间点Pi-ta基因的表达量,结合Pi-ta基因单倍型分型进行分析。q RT-PCR结果表明,Pi-ta在受侵染的不同单倍型云南水稻地方品种中的表达量均有不同程度的下调,且在感病品种单倍型中的下调幅度大于抗病品种单倍型;但Pi-ta在不同3'-UTR单倍型感病品种中的表达量,差异不显著。结果表明,抗性基因Pi-ta在受侵染的抗病品种单倍型中的表达量下调幅度小于感病品种单倍型,但其在所选的两种不同3'-UTR单倍型感病品种间的表达量没有显著差异。     

根节线虫可改变棉株中氨基酸的代谢

所有的商用栽培品种都易感根节线虫( Meloidogyne incognita) ,但敏感程度不同。导入抗性种质的棉株的抗性机制是含有两个主要基因 ,抗性品系可能产生一种独特的 1 4k Da蛋白质。研究表明 ,这种蛋白质的含量在易感品系的根系中比被根节线虫侵染后的抗性品系的根系中增加更多。被根节线虫侵染后的根系中单一氨基酸的克分子比率与未被侵染的也不同 ,是由于易感品系比抗性品系受侵害程度大。根节线虫能改变根系中的蛋白质含量。蛋白质的含量有选择地增加可能来源于根节线虫的蛋白质 ,两个易感品系和两个抗性品系被侵害后 ,纤维素的含量都比较…     

巴西蕉果肉类黄酮生物合成特点及其关键酶基因的差异表达分析

为了明确巴西蕉果肉类黄酮生物合成的特点及其关键酶基因的差异表达特性,本研究选取抽蕾期(0 DAF)、断蕾期(20 DAF)、采收期(80 DAF)、成熟度Ⅱ期(8 DPH)、成熟度Ⅵ期(16 DPH)的巴西蕉的果肉,分别测量总黄酮的含量,观察其变化趋势。分别提取根、叶、花、果实以及上述五个时期的果肉RNA进行转录组测序,分析类黄酮生物合成关键酶基因在不同组织器官及不同发育成熟阶段的表达特性,并对其中10个关键酶基因的表达进行验证。结果表明从抽蕾期至断蕾期再到采收期,巴西蕉果肉黄酮含量呈明显的下降趋势,至采收时下降到最低点,在采后成熟过程中小幅上升再下降。类黄酮生物合成6个关键酶基因家族共78个基因在巴西蕉不同组织器官中是差异表达的,其中3个基因在根、叶、花和果实中都高水平表达,有42个、11个、18个、8个基因分别在根、叶、花、果实中高表达;这78个基因也在巴西蕉果实不同发育成熟阶段差异表达,有4个基因在果实发育成熟阶段都高水平表达,有27个、27个、19个、15个、9个基因分别只在抽蕾期、断蕾期、采收期、成熟度Ⅱ期和成熟度Ⅵ期中高水平表达;类黄酮生物合成关键酶基因CHS(Ma02_t24860.1)、CHI(Ma11_t21950.1)和F3'H(Ma03_t31570.1和Ma05_t26350.1)与总黄酮的变化趋势相似,推测这4个关键酶基因在香蕉果实黄酮生物合成过程中具有非常重要的作用。研究结果可为解析巴西蕉类黄酮生物合成的分子机制提供帮助。     

利用生物信息学和qRT-PCR分析鉴定水稻细菌性条斑病QTL qBlsr5a的候选基因

细菌性条斑病(简称细条病)是水稻的主要病害之一。前期研究已将细条病抗性QTL qBlsr5a精细定位在5号染色体上一个大约300kb的区间内。为了寻找该QTL的候选基因,本研究利用生物信息学方法对该区间进行分析,筛选出10个与抗病相关的注释基因。然后以感病品种H359及其抗病近等基因系H359-BLSR5A为材料,对细条病菌接种后这10个基因的表达动态进行qRT-PCR分析。结果表明,2个基因在抗、感材料中几乎没有检测到表达产物;7个基因对病原菌侵染没有明显的响应;1个基因(LOC_Os05g-01700)在病原菌侵染后表达量发生变化且在抗、感材料间存在显著差异。因此推测,该基因是qBlsr5a的一个重要的候选基因。     

矮生香蕉品种特性及栽培技术研究

矮生香蕉品种可在南北方发展温室栽培,是优良的经济树种与观赏树种,研究矮生香蕉的品种特性与配套栽培技术,可为发展矮生香蕉的观赏与鲜食应用提供基础和指南。试验选取了矮生香蕉品种‘中蕉12 号’为材料,评估其枯萎病抗性,开展地培及盆栽试验研究其栽培特性,总结其温室栽培技术要点。试验结果表明,矮生香蕉‘中蕉12 号’株高仅为85.7~103.3 cm,树形矮小,树姿优美,生长期较短约为10 个月,与易感品种‘巴西香蕉’相比具较强枯萎病抗病性,产量适中（6.0~7.8 kg/株）,品质优良,果实品质媲美常规鲜食品种‘巴西香蕉’。矮生香蕉品种‘中蕉12 号’可鲜食与观赏两用,用于休闲观光以及生态农业建设,具有良好的应用前景,符合现代都市农业的发展需求。     

实时荧光定量检测盐胁迫下香蕉幼苗CaM和Ca~(2+)-ATPase基因的相对表达量

通过增加外源CaCl_2和钙离子螯合剂EGTA处理后,研究香蕉幼苗在60 mmol/L NaCl人工模拟的盐胁迫0、4 h、8 h、12 h、24 h和48 h不同时间下,测定其叶片和根的CaM和Ca~(2+)-ATPase基因的相对表达量。结果表明,在NaCl胁迫过程中,香蕉幼苗在正常的生长条件下,其根和叶片的CaM基因和Ca~(2+)-ATPase基因均有表达。巴西蕉幼苗根在盐胁迫过程中Ca M基因没有发生显著变化,但是粉蕉根却发生了显著变化,这可能与粉蕉耐盐性高于巴西有关。随着盐胁迫时间的延长,巴西蕉和粉蕉幼苗根的Ca~(2+)-ATPase基因的相对表达量均呈现先上升后下降的趋势。     

香牙蕉与枯萎病4号小种抗性相关的SCAR分子标记开发

香蕉枯萎病是香蕉的一种毁灭性病害,采用抗病品种是控制病害的有效途径。目前香蕉抗病或耐病品种选育效率低,需要长期的田间观察和表征。分子标记辅助选择可以大大的提高传统育种的效率和准确性。香牙蕉是香蕉贸易中的主要类型,也是中国主栽的香蕉类型。本研究从100对SRAP分子标记中筛选出一对引物me9-em5,其在感病香牙蕉扩增出一条约400 bp的特异条带,抗病香牙蕉没有该条带的扩增。通过回收测序,设计并获得引物SC11-SC12,将SRAP分子标记成功转化为可以鉴定香牙蕉对枯萎病的抗感病性的SCAR标记。该标记可以鉴定本研究中涉及的香牙蕉的枯萎病抗感病性,且准确率达到96.875%。在香蕉抗枯萎病育种中具有较高的应用价值。     

利用基因沉默技术创造抗稻瘟病水稻资源

水稻稻瘟病是最具毁灭性的病害之一,严重地影响水稻的高产和稳产。在病原菌侵染水稻时,附着胞的形成对稻瘟病菌的致病性起着关键作用。研究证实一种P型ATP酶（ P-ATPase）参与了附着胞的形成。在病原菌与寄主的互作过程中,寄主的一些小分子物质可以进入病原菌中,达到抗病原菌侵染的目的。以稻瘟菌致病关键的P-AT-Pase基因MgAPT2第一外显子上特异性好的232 bp的区域作为干扰片段,正反向插入干扰载体中,通过农杆菌介导,转化到感稻瘟病水稻品种日本晴中,通过苗期稻瘟病接种鉴定和MgAPT2基因的表达检测,结果表明：转基因植株稻瘟病抗性得到增强且稻瘟病菌MgAPT2基因的表达量下降,为水稻抗稻瘟病种质资源的创新提供了新思路。     

黄瓜不同品种苗期感染枯萎病菌后几种酶活性的变化

分析了黄瓜不同抗性品种受枯萎病菌侵染后,叶片组织内过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化.结果表明,无论是抗病品种还是感病品种,在接种枯萎病菌后,随着接种天数的增加,4种酶活性与对照相比均有一定程度的升高,但抗病品种的酶活性增加幅度高于感病品种.说明这4种酶在黄瓜对枯萎病的抗性机制中起了重要作用.     

应用荧光定量PCR 技术分析普通菜豆品种中尖镰孢菜豆专化型定殖量

尖镰孢菜豆专化型(Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli)引起的菜豆枯萎病是菜豆生产中最严重的维管束类病害之一, 防治该病害有效方法是利用抗病品种。因此, 一种能够从菜豆受侵染组织中准确鉴定并定量检测枯萎病原菌含量的方法将有助于筛选抗性品种, 应用于普通菜豆枯萎病抗病育种。本研究基于荧光定量PCR技术开发出一种能够对定殖于菜豆组织中的枯萎病原菌准确定量的新方法。该技术对根、茎组织中病原菌DNA的最低检测量为1 pg, 能在接种病原菌6 d后明显区分抗病性不同的品种, 可在菜豆植株表现出明显发病症状前准确鉴定不同品种抗性水平的差异。经验证参试的感病品种BRB-130和A0640-1根、茎组织中定殖的病原菌DNA量显著高于抗病品种260205和黑芸豆, 与表型鉴定的结果完全符合。利用荧光定量PCR技术能够在病原菌侵染早期快速、准确、高效定量菜豆组织中定殖的病原菌, 这对指导菜豆抗病育种和植物病害传播的研究都具有非常重要价值。     

黄瓜不同品种苗期感染枯萎病菌后几种酶活性的变化

分析了黄瓜不同抗性品种受枯萎病菌侵染后,叶片组织内过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化。结果表明,无论是抗病品种还是感病品种,在接种枯萎病菌后,随着接种天数的增加,4种酶活性与对照相比均有一定程度的升高,但抗病品种的酶活性增加幅度高于感病品种。说明这4种酶在黄瓜对枯萎病的抗性机制中起了重要作用。     

香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1的分子特征与时空表达模式

为弄清香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因(MaSSIII-1)的分子特征及时空表达模式，以‘巴西蕉’果肉为试材，采用PCR法进行MaSSIII-1基因克隆，通过Quantitative real-time PCR (qPCR)和Western blot技术对MaSSIII-1基因及其蛋白表达模式进行分析。结果显示：MaSSIII-1基因cDNA全长为2397 bp，编码798 个氨基酸，包括4 个典型的结构域，GenBank 登录号为KU757067。MaSSIII-1 基因在香蕉根、球茎、花和苞片中表达量较低，在叶、果皮和果肉中表达量较高；随着香蕉果实发育，MaSSIII-1 基因表达量逐渐上升，在抽蕾后50~60 天达到最大；随着果实采后成熟，MaSSIII-1 表达量在采后5 天达到最大，随后逐渐下降。在香蕉果实不同发育及采后成熟阶段，MaSSIII-1 蛋白呈现出与mRNA水平相一致的表达趋势。证明MaSSIII-1 基因的表达不仅涉及到香蕉果实支链淀粉合成代谢，可能还涉及采后早期果实成熟或者支链淀粉降解。