番茄中WRKY2基因的克隆

WRKY转录因子在植物应对生物或非生物胁迫的反应及生长和发育中起重要作用,为研究WRKY转录因子在番茄中的功能,本研究根据课题组已经克隆的番茄WRKY转录因子片段设计引物,采用RT-PCR方法,从JA诱导的番茄幼苗中,获得了608 bp的cDNA片段。序列分析表明,该序列含有WRKYGQK保守结构域,与Capsicum annuum WRKY-c序列相似性是79%,与Nicotiana tabacum NtWRKY-7序列相似性是74%,表明已经成功克隆了番茄WRKY2基因片段。     

红麻非生物逆境胁迫响应基因HCWRKY71表达分析及转化拟南芥

WRKY转录因子在植物响应非生物逆境胁迫过程中具有重要的调控作用。本研究根据红麻转录组unigene序列(CL3883.Contig4),设计引物进行PCR扩增,经sanger测序获得全长为957 bp的HcWRKY71基因cDNA序列。该基因开放读码框为957 bp,编码1个含有318个氨基酸的蛋白,具有1个WRKY功能保守结构域,属于II类WRKY转录因子。在盐胁迫下,HcWRKY71基因表达量随NaCl溶液浓度升高而增加;在干旱胁迫下,HcWRKY71基因表达量随干旱胁迫时间的增加呈现先下降再上升然后再下降的趋势;在重金属镉胁迫下,HcWRKY71基因表达量随CdCl2溶液浓度的增加而降低。表明该基因表达受盐、干旱和重金属镉胁迫的诱导。利用农杆菌介导花序浸染法将该基因转化拟南芥发现,HcWRKY71基因提高了转基因拟南芥幼苗的耐盐性,这为进一步研究HcWRKY71基因的耐逆机制奠定了坚实的基础。     

小麦TaWRKY71a基因克隆、生物信息学及表达分析

WRKY蛋白是主要存在于植物体内一类转录因子家族,在植物的生长发育和逆境应答中发挥重要作用。为了揭示小麦WRKY基因功能,从普通小麦中克隆出Ta WRKY71a基因后进行氨基酸序列分析,并对Ta WRKY71a基因在不同组织及不同胁迫条件下的表达模式进行分析。结果表明,Ta WRKY71a基因编码一个含有355个氨基酸的蛋白质。氨基酸序列分析显示,Ta WRKY71a蛋白含有1个WRKY结构域及1个C2H2锌指结构。预测分析表明,Ta WRKY71a蛋白定位在细胞核;其二级结构包含28.17%的α-螺旋、16.34%的延伸链、4.79%的β-转角和50.70%的无规则卷曲。不同物种间WRKY蛋白的同源性分析比较表明,Ta WRKY71a与粗山羊草WRKY71、水稻WRKY71、高粱WRKY71和拟南芥WRKY40的氨基酸序列之间具有高度的保守性。q RT-PCR分析表明,Ta WRKY71a在叶、根、茎、花和种子中均有不同程度表达,并受ABA、Na Cl和PEG诱导表达,推测该基因可能参与小麦逆境胁迫应答。研究结果为进一步研究Ta WRKY71a的生物学功能奠定了基础。     

甜菜BvWRKY23基因的RNAi载体构建

WRKY转录因子家族成员在调控植物生长发育、应答生物与非生物胁迫等方面具有重要的生物学功能。以抗旱甜菜（Beta vulgaris L.）幼苗为材料,提取叶片总RNA并反转录为cDNA,通过RT-PCR方法扩增获得甜菜WRKY转录因子家族成员BvWRKY23基因的RNAi靶片段,以中间载体PBSK-RTM作为媒介,利用传统的“酶切-连接”法构建了含有CaMV 35S启动子、BvWRKY23基因片段反向重复序列的RNAi（RNA interference）植物表达载体pCambia2301ky-BvWRKY23-RNAi。     

苦荞麦FtWRKY6基因的克隆及其在低磷与激素诱导下根中的表达分析

WRKY转录因子是植物非生物胁迫反应中的重要调节子。荞麦耐贫瘠，磷利用率较高。为了探究WRKY基因在荞麦磷饥饿反应中可能的调节作用，以苦荞麦为材料，采用逆转录PCR方法，从低磷处理的根RNA样品中获得了FtWRKY6基因的编码序列。FtWRKY6 cDNA长1 572 bp,编码524个氨基酸，含有2个典型的WRKY保守结构域，锌指类型为C₂H₂,归属于第Ⅰ类WRKY,与绿茶CsWRKY24在氨基酸水平上的同一性较高(55.5%)。拟南芥原生质体瞬时表达分析表明，FtWRKY6定位于细胞核中；酵母单杂交试验表明，FtWRKY6具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明，在根中FtWRKY6的表达受低磷和3种重要的低磷反应相关激素—吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)和细胞分裂素(CTK)显著诱导。上述结果提示，FtWRKY6具有转录因子的基本结构与生化特征，在根中可能通过IAA、GA、CTK信号通路的交互作用介导苦荞麦在低磷条件下的响应过程。     

小麦白粉病菌诱导的TaWRKY34基因的鉴定与分析

WRKY转录因子在植物抗病防卫反应中发挥重要作用。利用cDNA宏阵列(macroarray)和RT-PCR相结合的方法,从小麦全长cDNA文库的WRKY转录因子中筛选出一个应答小麦白粉病菌胁迫的TaWRKY34转录因子,该基因编码464个氨基酸。染色体定位分析表明,该转录因子位于小麦第一同源群染色体的短臂上,并且只在细胞核中表达。其蛋白序列与拟南芥、大麦和葡萄抗病相关WRKY转录因子的亲缘关系较近,与其中的3个WRKY基因具有相似的表达模式。TaWRKY34在Pm16/北京8377抗白粉病近等基因系中,对小麦白粉病菌、水杨酸和茉莉酸诱导的表达模式存在差异。TaWRKY34可能与小麦对白粉菌的抗性有关。     

毛竹PheWRKY76基因序列及相关表达分析

WRKY转录因子家族在植物生长发育和非生物胁迫应答中发挥着重要的作用。本研究以毛竹(Phyllostachys edulis)为材料,克隆PheWRKY76基因并进行相关分析,该基因的开放阅读框全长909 bp,编码302个氨基酸,具有典型的WRKY结构域。PheWRKY76在毛竹的根、茎、叶、花和笋中均有表达,并且受到高盐、干旱和低温等胁迫诱导表达。在不同年龄毛竹的叶片中,随着植株年龄的增加,PheWRKY76基因表达量增加,在不同发育程度的叶片中,老叶PheWRKY76基因表达量较新叶中高,推测该基因可能作为调控因子参与了毛竹的非生物胁迫应答和生长发育调控。     

海岛棉GbWRKY32基因的克隆及特性分析

利用RT-PCR技术从海岛棉品种新海21中克隆了1个WRKY基因,在GenBank数据库中比对发现其与陆地棉GhWRKY32的序列高度同源,因此命名为GbWRKY32。该基因ORF为1 077 bp,编码358氨基酸,预测分子量为39.288 k D,等电点为5.02。序列分析表明该基因含有一个WRKY保守结构域,锌指结构为:C-X5-C-X23-H-X1-H,属于WRKY转录因子家族Ⅱ类D组成员。GbWRKY32蛋白为疏水性蛋白,不具有跨膜区和信号肽结构。GbWRKY32转录因子不具有转录自激活活性。本研究成功构建GbWRKY32基因的植物表达载体并转入根癌农杆菌EHA105菌株中,这有助于该基因功能的后续研究。     

中间锦鸡儿CiWRKY2基因克隆与表达分析

通过RACE技术从中间锦鸡儿中克隆得到一个WRKY转录因子编码基因CiWRKY2,该基因g DNA为3 224 bp,含有4个内含子;cDNA长2 032 bp,开放阅读框1 725 bp,可以编码574个氨基酸,蛋白分子量大小约为63.29 kD,等电点为7.65。系统进化分析发现,CiWRKY2与豆科植物WRKY相似度最高,属于第一类WRKY蛋白。亚细胞定位显示CiWRKY2蛋白定位于细胞核。实时荧光定量结果表明CiWRKY2主要在叶、根中表达,并且该基因转录水平的表达受到干旱、盐碱、高温、低温和ABA诱导,表明CiWRKY2基因可能在植物抗逆中起到一定作用。     

巴西橡胶树WRKY转录因子基因HbWRKY41的克隆与表达分析

为阐明巴西橡胶树WRKY转录因子基因Hb WRKY41的分子特征及表达特性,利用RT-PCR方法从巴西橡胶树中克隆了该基因。Hb WRKY41开放阅读框1 020 bp,编码339个氨基酸,预测蛋白分子量为38.48 k Da,理论等电点为5.52。Hb WRKY41含有1个WRKY保守结构域和1个C_2HC型锌指结构,与蓖麻、棉花、大豆及拟南芥WRKY41蛋白聚为一类,属于Ⅲ类WRKY转录因子家族成员。实时荧光定量PCR检测结果表明,Hb WRKY41在巴西橡胶树根、树皮、胶乳、叶和花等组织中均有表达,以在衰老叶片中的表达最高,而在胶乳和树皮中的表达相对较低。干旱、低温及高盐胁迫均可上调Hb WRKY41的表达,其中以低温或盐胁迫下Hb WRKY41的表达持续升高。Hb WRKY41可能在巴西橡胶树叶片衰老和非生物胁迫应答中起着重要调控作用。