中国水仙NtPI基因的克隆与表达分析

采用RACE技术从中国水仙‘金盏银台’(Narcissus tazetta var.chinensis)花芽中获得1个与花器官发育有关的MADS-box基因,命名为NtPI(GenBank登录号:JQ326272).该基因全长804 bp,含有1个618 bp的开放阅读框,编码205个氨基酸,具有典型的MADS结构域和K结构域,与仙客来水仙(Narcissus cyclamineus)同源性最高,达98％.系统进化树显示,NtPI属于B类MADS-box基因家族的PI/GLO类基因.半定量RT-PCR分析表明,该基因在‘金盏银台’和‘玉玲珑’2种水仙花朵的各个部位均有表达,但表达的水平有所不同.在‘金盏银台’中,雄蕊和雌蕊的表达量大于花瓣和副冠,而在‘玉玲珑’花瓣和副冠中,表达丰度远远大于雄蕊和雌蕊.     

中国水仙NtMYB1基因的克隆及表达分析

为研究调控花青素合成机制,利用RT-PCR和RACE技术从中国水仙‘金盏银台’（Narcissus tazetta var. chinensis‘Jinzhan Yintai’.）的花瓣和副冠中克隆得到一个MYB基因的cDNA序列,命名为NtMYB1,在GeneBank上登录号为KC763973。序列分析表明,NtMYB1基因全长842 bp,其中开放阅读框长681 bp,编码226个氨基酸,推测的蛋白分子量为25.2 ku,理论等电点为7.94。NtMYB1具有明显的R2R3-MYB结构域,且在R3结构域的下游含有一个相对保守的PDLNLDLSIG氨基酸基序。同源性分析表明,其编码的氨基酸序列与陆地棉、甜樱桃的MYB蛋白相似性分别达到65％和63％。利用实时荧光定量PCR技术检测NtMYB1基因在中国水仙花不同发育时期和部位的表达水平,分析结果表明,NMYB1基因在中国水仙成花不同时期均有表达,但表达量具有明显差异,其中NtMYB1基因在花蕾期的相对表达量约为花苞期的40倍,且其表达量在花瓣要高于副冠。推测NtMYB1可能参与调控花青素合成基因的转录沉默。     

荔枝快速碱化因子基因的克隆与表达分析

从已构建的荔枝果皮cDNA文库中挑取克隆测序,获得一条荔枝快速碱化因子(LcRALF)基因(GenBank登录号:EU024484).该基因的cDNA全长为666 bp,含1个381 bp的开放读码结构,编码126个氨基酸.生物信息学分析表明,该基因的氨基酸序列与拟南芥、烟草等物种的RALF基因一致性较高,具有RALF基因氨基酸序列的典型特征.RT-PCR分析表明,该基因在荔枝果皮中特异表达,且在新采收的荔枝果皮中表达量最高.随着果皮的衰老该基因表达量逐渐下降.     

杜鹃红山茶ACO1的克隆及其表达分析研究

根据山茶（Camellia japonica）同源序列设计特异性引物,利用同源克隆和3°,5°-RACE技术,从杜鹃红山茶（C. azalea）花芽组织中克隆出ACC氧化酶（ACC-oxidase, ACO）基因,命名为CaACO1,基因全长1232 bp,开放阅读框963 bp,编码320个氨基酸。实时荧光定量PCR分析发现,ACO1在杜鹃红山茶不同组织中均得到表达,其中茎尖ACO1表达量最低,其次花芽、叶芽、根尖,表达量较高的是真叶和花器官,随着叶片成熟和花器官发育ACO1表达量均逐渐增加。结果表明,该基因可能参与杜鹃红山茶叶片发育,并且与花器官衰老密切相关。ACO1在参试的8个山茶品种花器官发育过程中的表达模式基本一致,但不同品种间的表达量存在差异。相关性分析发现ACO1表达量与花型、花色、花径和花瓣数4个形态指标均无显著相关性。     

多花水仙HDS基因cDNA全长克隆与序列分析

以‘黄花水仙2号’和‘金盏银台’为材料,水仙各自花瓣的cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术克隆出2个HDS基因,分别命名为NtHDSY和NtHDSJ,测序结果表明,NtHDSY和NtHDSJ基因全长分别为2 592 bp和2 599 bp,2个基因均含有1个2 178 bp的开放阅读框（ORF）,编码745个氨基酸。同源性分析表明,黄花水仙2号与金盏银台、铁皮石斛、长春花、大豆、葡萄和苹果的相似系数分别为：97.77％、79.29％、75.29％、75.51％、75.02％和74.40％。Real-time PCR分析表明：NtHDS基因在花瓣和副冠内的表达量在开花过程的花蕾期与盛花期存在明显差异,推测该基因可能与多花水仙香气物质的合成有关。     

萼脊兰SjHMGR基因克隆及表达分析

为探究兰科植物的花香基因,拓展兰科植物在花香分子育种方面思路。以萼脊兰花瓣为实验材料,按照NCBI上登录的兰科植物的HMGR基因序列设计引物,采用RT-PCR和RACE技术成功克隆萼脊兰3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（SjHMGR）。采用生物信息学方法,利用内参基因EF1a,对SjHMGR基因的时空表达特性进行分析研究。结果显示,获得的SjHMGR基因全长为1892 bp,开放阅读框为1689 bp,编码367个氨基酸,登录号为MK448292;SjHMGR有3个HMG-COA特殊位点,且属于HMG-COA超基因家族;SjHMGR编码的蛋白为亲水性蛋白;亚细胞定位于线粒体;蛋白质2级结构分析发现,SjHMGR蛋白具有α-螺旋、延伸链和不规则折叠。SjHMGR编码蛋白质的功能预测发现,SjHMGR在中间代谢起到非常重要的角色;同源性分析与系统进化树分析发现,萼脊兰SjHMGR蛋白与兰科的进化距离最近,在同1个分支上。qRT-PCR结果显示,SjHMGR基因在根和叶中的表达量很低,在萼片和花瓣中的表达较高,具有时空特异性。     

兜兰查尔酮合成酶基因的克隆与表达分析

以同色兜兰为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花中获得一个兜兰查尔酮合酶基因（chalcone synthase,CHS）的cDNA全长,命名为PcCHS,GenBank登录号JQ030889。序列分析表明,PcCHS全长1 424 bp,包含106 bp的5′非编码区、133 bp的3′非编码区和一个长度为1 185 bp编码394个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示,PcCHS具有CHS家族保守的功能活性位点和特征多肽序列。序列比对表明,PcCHS与兰科植物的蝴蝶兰、文心兰和石斛兰等的CHS蛋     

卡特兰ChCHS1和ChDFR1基因的克隆及表达分析

以卡特兰紫色花品种‘粉女郎’（Cattleya hybrid‘Pink Lady’）为材料,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中分离得到了一个查尔酮合酶（chalcone synthase, CHS）和一个二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase, DFR）同源基因的cDNA全长,分别命名为ChCHS1和ChDFR1,GenBank登录号分别为KP171693和KP171694。序列分析结果发现：ChCHS1的cDNA全长1 508 bp ,编码394个氨基酸;ChDFR1基因的cDNA全长1 250 bp,编码350个氨基酸。同源性检索和生物信息学分析表明,这2个基因编码的蛋白都具有各自的功能位点和保守性特征多肽序列。氨基酸序列比对与系统进化树分析显示,ChCHS1、ChDFR1基因在兰科中与蕙兰、石斛兰关系最近,与百合科关系较近。相对实时荧光定量PCR结果表明,ChCHS1 和ChDFR1都在蕾期表达量最低,伴随花朵的开放,表达量逐渐上升,最终分别在花朵盛开期和接近开放时达到最高。     

蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的cDNA克隆及其表达分析

利用低夜温诱导的蝴蝶兰花芽的抑制消减杂交文库中分离的蔗糖合成酶基因的ESTs片段,采用RT-PCR和RACE技术,从蝴蝶兰花芽中克隆得到蔗糖合成酶基因的全长cDNA,命名为PhSUS,GenBank登录号JX162557.该基因全长2 816 bp,包含147 bp的5’非编码区、218 bp的3 '非编码区和一个长度为2 451 bp编码816个氨基酸的开放阅读框.PhSUS预测的分子量为93.30 ku,等电点为5.95.蛋白同源性分析结果表明,PhSUS与兰科植物的文心兰、石斛兰和莫氏兰(Mokara)等的蔗糖合成酶有很高同源性.保守结构域分析结果表明,PhSUS含有蔗糖合成酶和葡糖基转移酶两个保守功能域及4个ADP结合位点.表达分析结果表明,PhSUS在检测的组织中都有表达,但表达丰度不同.PhSUS在花蕾发育中后期、成熟花和花器官的表达量都较营养阶段根和叶中的表达量高.PhSUS的克隆为研究其参与花芽分化和发育的表达调控奠定了重要基础.     

蝴蝶兰C类花器官发育基因PhAG1a的克隆及表达分析

为研究MADS-box基因在花器官发育中的功能,进一步理解兰科植物花器官发育的分子调控机理。利用RT-PCR和RACE技术从蝴蝶兰中克隆了一个MADS-box基因PhAG1a(GenBank登录号为KY399811),并利用实时荧光定量方法分析其表达特性。序列分析表明,该基因的cDNA全长为1 107 bp,含完整的开放阅读框,可编码248个氨基酸,属于C功能AGAMOUSE家族基因,与蝴蝶兰属的PhalAG1和PeMADS1基因关系最近;表达模式分析表明,PhAG1a基因在营养器官中不表达,只在蕊柱和子房中表达。在5类突变体花器官中,PhAG1a基因在退化雄蕊变异为侧瓣、侧瓣退化与蕊柱合生和侧萼片变异为唇瓣等3类突变体花器官中,PhAG1a基因的表达没有变化,在侧瓣变异为唇瓣和侧瓣顶端长出花药的突变体花器官中,PhAG1a基因在蕊柱中的表达水平显著降低。推测该基因在决定蝴蝶兰合蕊柱的发育中起重要的调控作用。     

文心兰 PAD4 基因克隆及表达分析

为了研究文心兰（Oncidium hybridum）抗病相关基因 PAD4 在文心兰抗病种质资源培育中的功能,采用 RT-PCR 结合 RACE 法,从巧克力文心兰(Oncidium Sharry Baby ‘Sweet Fragrance’)中克隆得到一条全长 2 214 bp 的基因的 cDNA 序列,开放阅读框长 1 894 bp,预测可编码 647 个氨基酸,5′UTR 长度为 65 bp,3′UTR 长度为 255 bp。生物信息学分 析表明：PAD4 编码的蛋白属于水解酶超家族,有 6 个跨膜螺旋,无信号肽,亚细胞定位预测其主要定位于细胞质膜上。 系统进化树表明,文心兰 PAD4 与同为兰科植物的小兰屿蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris）、铁皮石斛（Dendrobium catenatum）、深圳拟兰（Apostasia shenzhenica）亲缘关系最近。同源分析结果显示,与铁皮石斛的 PAD4 蛋白同源性最 高（78.08%）。实时荧光定量 PCR 分析显示,PAD4 在文心兰不同组织部位中都有表达,在假鳞茎中的表达量最高,其 次是下端叶,在根中的表达量最低。接种软腐病病原菌显示,PAD4 在感病文心兰中表达量上调,侵染后 4 h 时快速响 应并达到最高值。SA（salicylic acid）和 CaCl2 都能够诱导 PAD4 的表达,都在 24 h 时达到最高峰。研究表明,PAD4 基因可能在文心兰抗病过程中有重要作用。     

芒果SEPALLATA3基因的生物信息学与表达分析

SEPALLATA3（SEP3）属于MADS-box基因家族,与植物的成花时间和花器官分化有关。在本研究中,从芒果转录组数据中挖掘获得了2个MiSEP3s基因,分别命名为MiSEP3-1和MiSEP3-2。生物信息学分析显示,MiSEP3-1和MiSEP3-2基因的基因组DNA长度分别为4189 bp和3721 bp,2个基因的开放阅读框长度一致均为732 bp,编码244个氨基酸,蛋白质分子量分别为59.29 kD和59.28 kD。2个MiSEP3s的氨基酸序列中含有典型的MADS结构域和K-box结构域。启动子序列分析显示,2个MiSEP3s基因启动子均包含光响应元件、激素响应元件、逆境响应元件和转录因子结合位点,但调控元件种类和数量存在差异。基因表达模式分析显示,2个MiSEP3s基因在营养期的茎、叶和芽中表达量较低,但在成花转变后期的芽中持续上调表达,在花中达到表达高峰。该结果为MiSEP3基因功能的研究提供参考。     

龙眼Mn-SOD基因的表达及其启动子功能分析

以龙眼胚性愈伤组织为材料,研究龙眼Mn-SOD基因在应答非生物因子和外源激素处理下的转录情况,并利用烟草瞬时转化法分析其启动子的表达活性。结果表明:龙眼胚性愈伤组织中Mn-SOD基因的表达受到红光和蓝光的抑制;而在白光处理下,Mn-SOD呈现先上升再下降的趋势,在绿光中,则是先下调再上升。在盐胁迫处理下,Mn-SOD基因的表达受到抑制,在蔗糖和不同天数处理中则不受影响。在一定浓度范围内,外源激素IAA、GA3、Me JA、SA和ETH均能诱导或抑制龙眼胚性愈伤组织中Mn-SOD基因的表达,提示其参与外源激素的应答。构建4个不同启动子缺失片段驱动报告基因GUS的植物表达载体并转化烟草。结果表明,龙眼Mn-SOD基因4个不同启动子缺失片段启动GUS基因的能力均低于Ca MV35S启动子,但均可启动GUS基因的表达。瞬时表达和定量表达结果显示,3’缺失的MSD-pro4(-669~-267 bp)启动GUS基因的能力最强,其次为5’缺失的MSD-pro1(-669~-1 bp),最弱的为MSD-pro2(-432~-1bp)和MSD-pro3(-267~-1 bp),提示Mn-SOD启动子-669~-432 bp区段内含有重要的正向顺式调控元件;而-432~-1 bp区段含有负调控元件。     

玳玳花瓣脂氢过氧化物裂解酶基因cDNA的克隆及原核表达

以玳玳花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆了玳玳HPL基因cDNA全长,全长为1 776 bp,其中包含52 bp的5′非编码区,224 bp的3′非编码区,1 500 bp的编码区(编码499个氨基酸,分子量为55.7 ku)。将该HPL基因cDNA编码区的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与其他植物的HPL基因cDNA序列进行比较,推断玳玳花瓣HPL属于13-HPL类。通过PCR扩增得到了玳玳HPL基因组全长。测序结果显示玳玳HPL基因中包含1个长2 374 bp的内含子。将分离出来的玳玳HPL基因cDNA的编码区序列插入pET-15b载体上构建原核表达载体,在细菌BL21细胞中进行原核表达。结果表明:该编码区片段可在原核细胞中大量表达,其表达产物分子量大小约为55 ku,与13-HPL蛋白的分子量55.7 ku相符。本研究为下一步利用HPL基因cDNA进行遗传转化研究奠定基础,将为花卉香味的遗传改良提供一条新途径。     

芒果MiFRI1和MiFRI2基因的克隆与表达分析

FRIGIDA(FRI)是植物春化途径中影响成花的关键基因之一.本研究克隆了2个芒果FRI基因,分别命名为MiFRI1和MiFRI2.序列生物信息学分析结果显示,MiFRI1和MiFRI2基因的ORF长度分别为1752、1815 bp,编码584、605个氨基酸,蛋白质分子量为64.98、66.86 kDa.进化树分析...     

瓜实蝇性别决定基因tra——2的克隆及表达分析

本研究对瓜实蝇Bactrocera cucurbitae Coqillet的性别决定基因tra- 2的eDNA序列进行了克隆和分析。根据转录组数据库及序列同源性分析，分别克隆并获得瓜实蝇雌雄成虫tra- 2的基因片段，利用生物信息软件对所得序列进行分析;采用qPCR技术，研究该基因在瓜实蝇不同发育阶段的表达情况。研究结果表明，瓜实蝇ra-2基因的eDNA序列共1 450 bp,无性别特异性，含753 bp的开放阅读框，共编码250个氨基酸。 该基因在瓜实蝇不同发育阶段均有不同的表达量，瓜实蝇tra-2基因具有母体遗传表达特性，在胚胎期的表达量较高，雌成虫表达量显著高于雄成虫。     

菜心 BclUBE2 基因的克隆与表达分析

采用同源克隆法从菜心中获得 cDNA 全长 459 bp 的 E2 基因,命名为 BclUBE2。该基因编码 153 个氨基酸,分子量为 17.24 ku,理论等电点为 5.37,为亲水性非分泌蛋白。结构分析显示,该蛋白含有一个泛素结合酶E2 活性位点、一个 WD 重复序列和一个高度保守的半胱氨酸。进化分析发现,菜心 BclUBE2 蛋白与芸薹属芜菁和油菜的亲缘关系较近。qRT-PCR 分析表明,菜心 BclUBE2 基因在根、茎、叶、叶柄中均有表达,且表达丰度和变化趋势不同。在低温胁迫下,根中的表达量呈现先降低后升高的变化趋势,且在处理 1 h 时表达量最低;在茎、叶、叶柄中均呈现先升高后降低的表达趋势,茎和叶柄处理 6 h 时的表达量最高,叶片处理 1 h 时的表达量最高。说明菜心 BclUBE2 基因在响应低温胁迫中发挥作用。     

红肉蜜柚 PDR 型转运蛋白基因的发掘及 CmPDR11-2 表达与耐草甘膦初步分析

基于红肉蜜柚 RNA-seq 数据库,筛选出 50 个 ABC 转运蛋白家族基因,其中包含 11 条 PDR 型基因。对11 条柚 PDR 基因进行命名和生物信息学分析。同源性分析结果表明：CmPDR11-2 编码的氨基酸序列与拟南芥中转运百草枯除草剂的 AtPDR11 基因同源性最高,达 69.25%,利用 RT-PCR 技术克隆得到 CmPDR11-2 的 ORF 序列。该序列长度为 4 371 bp,编码一个含有 1 456 个氨基酸的蛋白质,分子量 165.138 03 ku,该蛋白属于稳定的亲水性蛋白,无信号肽,具有 12 个跨膜结构,定位于细胞膜。实时荧光定量 PCR 结果表明,草甘膦除草剂胁迫处理条件下,1~15 d 处理组柚叶的 CmPDR11-2 基因相对表达量呈整体上升趋势,且均高于对照组,反应迅速且持久,这表明 CmPDR11-2 基因表达与红肉蜜柚耐草甘膦有关。