云南烟草丛枝症病害研究Ⅹ病原研究：植原体问题

 云南烟草丛枝症病害四环素治疗无效,可经汁液摩擦和蚜虫传染,病程表现为潜伏期、过敏反应期、缩顶期和丛枝期等4个阶段,细胞内产生质膜体和细胞质泡囊等膜系统畸形病变,病株总核酸中存在特殊的超稳定低分子量RNA,Nested-PCR在病株总核酸中(引物:R16mR1/R16mF2,R16R2/R16F2)未检测到植原体16sRNA基因。说明云南烟草丛枝症病害和烟草丛枝病是不同的病害,病原不是植原体,该病表现出病毒侵染的特征,可能由病毒或类似于病毒的病原引起。依据病害的症状和侵染特征,建议将"云南烟草丛枝症病害"称呼为"烟草簇矮病(Tobacco bushy dwarf)"。     

云南烟草丛枝症病害研究Ⅰ病害的症状学及其病程

 以云南烟草丛枝症病株为毒源,通过蚜虫传染接种大十字期、猫耳朵期、摆盘期、团棵期、旺长期和现蕾期的烟株,观察症状反应并检测与云南烟草丛枝症病害相关的低分子量RNA.研究表明:云南烟草丛枝症病害的病程可分为4个阶段:潜育期、过敏反应期、缩顶期和丛枝期,烟株从感染到表现丛枝要经过约1个月;蚜虫接种后约1周,在蚜虫口针刺吸部位开始出现褪绿斑,继而产生强烈的过敏反应,即从褪绿斑中心开始坏死出现蚀点斑,叶片上布满坏死斑纹,有典型的环纹和蚀纹,严重的烟株叶片破裂,细脉坏死;随后进入缩顶期,烟株生长缓慢,叶间距明显缩短,顶部几乎成为一个平面,叶色稍黄,大十字期和猫耳朵期接种烟株缩顶后生长极其缓慢,萎缩成为僵苗,不表现丛枝症状,也不会开花结实;感染约4周后,摆盘期、团棵期、旺长期和现蕾期接种的烟株开始腋芽丛生,生长速度加快,几天后便表现为典型的黄化丛枝症状,叶黄化且变圆,能够开花结实.其症状和文献记载的所有烟草丛枝、丛顶和丛蔟类病害有明显区别,初步认为是1种未见记载的新病害,建议称之为“烟草簇矮病(Tobaco bushy dwarf)”.文中附病程症状图2版.     

云南烟草丛枝症病害研究 I病害的症状学及其病程

以云南烟草丛枝症病株为毒源,通过蚜虫传染接种大十字期、猫耳朵期、摆盘期、团棵期、旺长期和现蕾期的烟株,观察症状反应并检测与云南烟草丛枝症病害相关的低分子量ＲＮＡ．研究表明：云南烟草丛枝症病害的病程可分为４个阶段：潜育期、过敏反应期、缩顶期和丛枝期,烟株从感染到表现丛枝要经过约１个月;蚜虫接种后约１周,在蚜虫口针刺吸部位开始出现褪绿斑,继而产生强烈的过敏反应,即从褪绿斑中心开始坏死出现蚀点斑,叶片上布满坏死斑纹,有典型的环纹和蚀纹,严重的烟株叶片破裂,细脉坏死;随后进入缩顶期,烟株生长缓慢,叶间距明显缩短,顶部几乎成为一个平面,叶色稍黄,大十字期和猫耳朵期接种烟株缩顶后生长极其缓慢,萎缩成为僵苗,不表现丛枝症状,也不会开花结实;感染约４周后,摆盘期、团棵期、旺长期和现蕾期接种的烟株开始腋芽丛生,生长速度加快,几天后便表现为典型的黄化丛枝症状,叶黄化且变圆,能够开花结实．其症状和文献记载的所有烟草丛枝、丛顶和丛蔟类病害有明显区别,初步认为是１种未见记载的新病害,建议称之为“烟草簇矮病（Ｔｏｂａｃｏｂｕｓｈｙｄｗａｒｆ）”．文中附病程症状图２版．     

云南烟草丛枝症病害研究Ⅳ建立标准毒株

 以蚜虫传染发生云南烟草丛枝症病害的烟株为材料进行组织培养,连续培育3代,以第3代组培烟苗为毒源经蚜虫传染健康烟株,提取毒源和各实验烟株的总核酸进行琼脂糖凝胶电泳.结果表明:第3代组培烟苗为毒源经蚜虫传染的烟株发病表现丛枝症,并检测到与云南烟草丛枝症病害相关的低分子量RNA.说明与云南烟草丛枝症病害相关的病原能在寄主离体培养组织中长期保存,成功建立云南烟草丛枝症病害的标准毒株.     

云南烟草丛枝症病害研究 IV建立标准毒株

以蚜虫传染发生云南烟草丛枝症病害的烟株为材料进行组织培养,连续培育３代,以第３代组培烟苗为毒源经蚜虫传染健康烟株,提取毒源和各实验烟株的总核酸进行琼脂糖凝胶电泳．结果表明：第３代组培烟苗为毒源经蚜虫传染的烟株发病表现丛枝症,并检测到与云南烟草丛枝症病害相关的低分子量ＲＮＡ．说明与云南烟草丛枝症病害相关的病原能在寄主离体培养组织中长期保存,成功建立云南烟草丛枝症病害的标准毒株．     

云南烟草丛枝症病害研究 V传染途径

在隔离环境中,按植物病毒学的标准程序,测试云南烟草丛枝症病害的传染途径,结果表明：云南烟草丛枝症病害具有广泛的传染途径,可以通过机械传染（嫁接、摩擦）和介体传染（菟丝子、蚜虫、烟盲蝽、叶蝉）等方式传播．     

云南烟草丛枝症病害研究Ⅴ传染途径

 在隔离环境中,按植物病毒学的标准程序,测试云南烟草丛枝症病害的传染途径,结果表明:云南烟草丛枝症病害具有广泛的传染途径,可以通过机械传染(嫁接、摩擦)和介体传染(菟丝子、蚜虫、烟盲蝽、叶蝉)等方式传播.     

云南烟草丛枝症病原及传媒研究初报

云南烟草丛枝症一直被认为是烟草丛枝病，其病原是植原体。由于生物学测定结果与植原体病害一般特性不尽相符，对云南烟草丛枝症的病原尚难以确定。我们对典型烟草丛枝症的原发病株和转接发病株按照检测植原体的方法提取DNA。扩增病株中植原体16S rDNA片段，在云南烟草丛枝症中没有检测到植原体的存在。在检测DNA提取物含量过程中，原发病株和转接发病株样品中检测出含量较高的RNA带，分子量约0．8kb；而健康烟株策和枣疯病株中未检测出，由此说明云南烟草丛枝症的病 原不是植原体，病株中检测出的RNA带是该病的病原还是感病后的诱导产物，有待进一步研究；RNA可作为室内鉴别烟草丛枝症的方法。在理论上证明烟蚜是烟草丛枝症的传播媒介，同时估计云南烟草丛枝症的病原是病毒，并与以往国内报道的烟草病毒病害不同，可能是一种新的病毒病害。     

云南烟草丛枝症病害研究 ⅩⅣ 感染时期与病害发生及经济性状的相关性

 以云南烟草丛枝症病株为毒源,通过蚜虫传染接种不同生育期的烤烟,测定烟株的发病率,以及烤烟生物学性状和产量产值的变化。结果表明:烤烟整个生育期都会感染烟草丛枝症病害,感染时期与发病率相关性不显着,但与潜育期相关性极显着,烟叶产量田间损失率取决于感病时期,相关方程为:Y=129.419-1.717X(X为假植至接种的天数)。由此可确定适宜的防治时间,测定防治效果,对提高防效和增加效益具有重要意义。     

云南烟草丛枝症病害研究Ⅷ验证与烟草丛枝症病害相关的稳定RNA

 来自云南省22个县市的烟草丛枝症标本均检测到与云南烟草丛枝症病害相关的稳定RNA,大小相当于800bp左右的DNA;病株的根、茎、叶、花和枯叶中含有此RNA,种子中未检测到此RNA;此RNA的最大吸收峰为269nm;能被蛇毒磷酸二酯酶I消化,不具有类病毒结构特征,推测可能是病毒的基因组分;支持莫笑晗等对此RNA的结构推测,即可能是有广泛内部配对、具有类似发叉结构的线性长度为1.61kb的单链RNA。与云南烟草丛枝症病害相关的低分子量RNA目前发现的超稳定RNA。     

云南烟草丛枝症病害研究 Ⅷ 验证与烟草丛枝症病害相关的稳定RNA

来自云南省２２个县市的烟草丛枝症标本均检测到与云南烟草丛枝症病害相关的稳定ＲＮＡ,大小相当于８００ｂｐ左右的ＤＮＡ;病株的根、茎、叶、花和枯叶中含有此ＲＮＡ,种子中未检测到此ＲＮＡ;此ＲＮＡ的最大吸收峰为２６９ｎｍ;能被蛇毒磷酸二酯酶Ｉ消化,不具有类病毒结构特征,推测可能是病毒的基因组分;支持莫笑晗等对此ＲＮＡ的结构推测,即可能是有广泛内部配对、具有类似发叉结构的线性长度为１６１ｋｂ的单链ＲＮＡ．与云南烟草丛枝症病害相关的低分子量ＲＮＡ目前发现的超稳定ＲＮＡ．     

云南烟草丛枝症病害研究 ⅩⅥ 网罩隔离培育无毒烟苗防治病害

 云南烟草丛枝症病害是经烟蚜和烟盲蝽传染的病毒病,在 "治虫防病"为主的防治技术的基础上,本文研究网罩隔离技术培养无毒烟苗应用于大田控制病害的方法,并进行一定面积的技术示范工作,结果表明:网罩隔离育苗在田间成功地培育出无毒烟苗,病苗率为0.23%～3.6%,较对照下降约75%～95%,移栽后结合优质烟栽培技术,封顶时烤烟的田间发病率为2～5%,说明以无毒苗应用技术为核心、辅之介体控制和病苗拔除等技术的综合防治体系能够有效和稳定地控制烟草丛枝症病害的危害。     

烟草感染丛枝病后的生理生化变化初步研究Ⅰ

 烟草感染丛枝病病原后表现为典型的矮化丛枝症状。供试烟草品种K₃₂₆以烟蚜为媒介,成功接种丛枝病病原后,分析病株与健株中与生长素(IAA)代谢相关的锌元素含量;IAA氧化、过氧化物酶的活性及同功酶变化,同时对抗感病相关的苯丙烷代谢关键酶苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)和植株解除H₂O₂毒害相关的过氧化氢酶活性进行测定。结果表明:感病烟株代谢发生了显着的变化,病株中锌含量降低、IAA氧化及过氧化物酶活性增强且在聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上它们的同功酶谱带多于健株,PAL的活性随接种时间的延长先升后降;过氧化氢酶的活性显着下降。另据测定,病株叶绿素含量减少而可溶性糖含量增高。     

白背飞虱传播云南烟草丛枝症研究

 我们在烟草丛枝症病害（Tobacco witches’ broom symptom diseases ）的媒介昆虫研究中首次发现白背飞虱（Sogatella furcifera Horvath）成虫（长翅型）能传播该病,并对其传毒特性进行研究发现：3头带毒白背飞虱成虫便可传毒,每烟株上超过15头带毒白背飞虱传毒率达最大,最短获毒时间为5 min,当获毒时间为24 h传毒率达最大,当接种时间达48 h传毒率达最大。由于云南省多数烟区烟田与稻田混杂,在烟田中存在相当数量的白背飞虱。因此,白背飞虱是烟草丛枝症病害的重要传毒介体之一。     

CTAB法用于染病烟草植株中烟草丛顶病毒RNA的提取

 CTAB法是一种广泛用于从染病植物中提取总核酸,并用于后续相关病原物PCR检测的核酸提取法,已普遍运用于DNA病毒、植原体、细菌、真菌侵染植物的总DNA提取和病原检测。本文尝试将CTAB法用于一种由RNA病毒（烟草丛顶病毒）引起的烟草丛顶病染病组织总核酸的提取,以总核酸进行烟草丛顶病毒的RT-PCR检测,并与常规RNA病毒核酸提取法——Trizol法作比较。结果表明CTAB法和Trizol法提取的核酸用于烟草丛顶病毒RT-PCR检测时,均能扩增到目的条带,检测结果一致。在对复合侵染材料进行检测时发现,CTAB法提取的染病植物组织总核酸既包括DNA也包含RNA,有利于对DNA和RNA病原物同时进行检测;CTAB法所用试剂较Trizol法便宜,毒性小,且提取的核酸量较多、保存时间较长。因此CTAB法是一种高效、简便、经济的从烟草丛顶病染病组织中提取烟草丛顶病毒RNA的方法。