花生蛋白磷酸酶2C家族基因的鉴定和盐胁迫响应分析

为了分析花生中蛋白磷酸酶2C基因(PP2C)的情况,对耐盐花生突变体(S2)和对照(S4)在胁迫处理前后的叶片进行RNA-Seq分析。通过生物信息学分析筛选出了79个具有完整开放阅读框的PP2C基因,它们位于花生A组野生种的10条染色体上,不同染色体上的PP2C基因数目差异很大,分布为1~15个。根据拟南芥中的PP2C基因的聚类分析结果,79个花生PP2C基因能聚到已报道的12个亚族15个亚类。为了分析这些PP2C基因对盐胁迫响应情况,利用突变体S2和对照S4构建了盐胁迫处理前后的表达谱,筛选出35个受盐胁迫诱导表达的PP2 C基因,涉及12个亚族14个亚类,其中A亚族b亚类、G亚族b亚类、I亚族、L亚族所有成员均受盐胁迫诱导表达;而G亚族a亚类的所有成员均不受盐胁迫诱导表达。对这35个PP2C基因的启动子研究发现,绝大多数PP2C基因的启动子存在多种胁迫响应元件:如与高温胁迫相关的调控元件HSE、与干旱诱导相关的MYB转录因子结合位点MBS、逆境胁迫应答元件TC-rich repeats、与抗氧化反应相关的ARE元件等。为花生PP2C基因的功能研究和利用奠定了基础。     

谷子非特异性磷脂酶C基因SiNPC4的克隆及功能分析

非特异性磷脂酶C(NPC,nonspecific phospholipase C)水解磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺产生第二信使二酰甘油(DAG),NPC类基因在植物处于干旱、高盐、低磷等非生物胁迫条件下时发挥重要的作用,并参与脱落酸(ABA)、油菜素内酯(BL)等激素信号传导途径。本研究以谷子品种龙谷25为试验材料,通过序列比对,克隆到一个新的NPC类基因,命名为Si NPC4。该基因被定位在谷子第8条染色体上,编码区全长2877 bp,由3个外显子和2个内含子组成,编码512个氨基酸,蛋白分子量为56.77 k D。系统进化树分析表明该基因位于NPC基因家族第3亚族,保守结构域分析表明该蛋白含有保守的磷脂酶结构域和4个基序。亚细胞定位结果显示,Si NPC4蛋白被定位在细胞质、细胞膜、细胞核中。基因表达谱分析结果表明,该基因主要在谷子根部表达,并受干旱、盐、低温、黑暗、ABA、BL、赤霉素(GA)和茉莉酸甲酯(Me JA)等的诱导表达。将Si NPC4基因转入拟南芥中,转基因拟南芥与野生型拟南芥相比对ABA和BL激素的敏感性降低,推测该基因可能作为负调控因子参与植物对ABA和BL激素的响应过程。在干旱和高盐处理下,过表达植株与野生型植株长势没有明显差异。     

过表达谷子液泡H~+-ATPase E亚基基因在拟南芥中的耐盐性

V-H+-ATPase在植物生长、发育和胁迫响应等生物学过程中发挥重要作用。本研究通过序列比对,从谷子中克隆到V-H+-ATPase E亚基基因Si VHA-E。进化树分析显示,Si VHA-E基因在进化上属于E1/E3亚族,与玉米V-H+-ATPase E亚基基因Zm VHA-EL亲缘关系较近。表达谱分析结果显示,Si VHA-E在高盐、茉莉酸甲酯(Me JA)、水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)处理下表达上调,在低温和低氮处理下表达下调。亚细胞定位分析表明Si VHA-E定位于液泡膜上。遗传转化拟南芥的耐盐性鉴定表明,在盐处理条件下,转基因株系的种子萌发率、幼苗主根长、植株鲜重及存活率显著高于野生型的。与野生型拟南芥植株相比,Si VHA-E过表达植株体内Na+含量减少,体内相对含水量提高。此外,ABA萌发试验结果显示,在种子萌发后期,Si VHA-E过表达植株对ABA更加敏感。研究表明,谷子Si VHA-E可以显著提高拟南芥耐盐性,这可能与其正向调控ABA信号途径以及减少植株体内Na+积累和水分散失有关。     

谷子Ⅲ型PRX基因家族全基因组鉴定及干旱胁迫下表达分析

Ⅲ型过氧化物酶(Class Ⅲ peroxidase, PRX)是植物中特有的过氧化物酶家族,在植物生长发育以及非生物胁迫中发挥重要作用。谷子作为C4植物是禾本科抗逆研究的模式植物,然而目前对于谷子中Ⅲ型过氧化物酶家族基因功能鲜有报道。为探究谷子Ⅲ型过氧化物酶基因家族(SitPRXs)在干旱胁迫和ABA诱导下的表达模式,进行了全基因组表达分析。本研究利用生物信息学方法在谷子全基因组中鉴定出132个Ⅲ型PRX基因家族成员,并根据其在染色体上位置顺序依次命名为SitPRX1～SitPRX132。通过对谷子、拟南芥和水稻的系统进化分析将其分为5个亚家族,基因结构和保守基序分析表明同一亚家族具有较高的保守性。基因复制分析显示, 17个SitPRX基因(13%)存在片段复制,78个SitPRX基因(59%)存在串联复制,串联复制事件在SitPRX基因扩增中起重要作用。谷子与拟南芥、水稻和玉米的物种间同源性分析显示谷子中大多数SitPRXs是在双子叶植物和单子叶植物分化后形成的。转录组分析显示, SitPRX基因家族成员在谷子幼苗、根、茎、叶以及圆锥花序中表达存在差异。启动子顺式作用元件分析显示,...     

转GmAREB基因提高拟南芥的干旱、氧化胁迫耐性

以耐盐性较强的大豆(Glycine max L.)品种铁丰8号为试验材料,克隆到1个A亚族bZIP类转录因子基因,命名为GmAREB (Glycine max ABA responsive element binding protein)。该基因由1 317个核苷酸组成,编码439个氨基酸残基,包括4个保守的磷酸化位点区域(C1、C2、C3和C4)、1个核定位信号区(KVVE)和1个bZIP转录因子保守域。聚类分析显示GmAREB蛋白与拟南芥ABF2、水稻OsTRAB1具有较高的同源性,并存在较近的亲缘关系。采用凝胶阻滞实验方法证明GmAREB蛋白与ABRE顺式元件具有体外结合特异性。功能分析结果表明, 在干旱胁迫条件下, GmAREB转基因拟南芥的存活率(50%)显著高于野生型(5%);气孔统计分析显示转基因植株的气孔开度(0.8 μm)明显比对照开度小(2.6 μm)。氧化胁迫结果显示GmAREB转基因拟南芥在甲基紫精溶液中叶绿素含量比野生型高(7.3 mg g^–1 FW)。转基因拟南芥RT-PCR分析表明,GmAREB基因过表达能够增强下游胁迫相关基因ABI1、ABI2的表达,抑制气孔开闭相关基因KAT1、KAT2的表达。综上所述,GmAREB基因过表达有效调控了转基因拟南芥下游靶基因表达,加速了气孔关闭,减少了水分蒸发和叶绿素降解,从而提高了转基因拟南芥对干旱、氧化胁迫耐性。     

谷子转录因子基因SiNAC45在拟南芥中对低钾及ABA的响应

NAC(nascent polypeptide-associated complex)转录因子在植物生长发育和非生物胁迫响应等过程中发挥重要的调控作用,目前,关于NAC转录因子参与耐低钾胁迫的研究报道很少。本研究在前期工作对低钾胁迫的转录组测序基础上,对筛选出的一个低钾胁迫下表达量上调的NAC类转录因子基因SiNAC45进行了深入研究。结果表明,SiNAC45基因全长1383 bp,编码461个氨基酸,分子量为50.7 k D,等电点为6.92。SiNAC45在20~100个氨基酸之间有一段NAM保守结构域。系统进化树结果显示,SiNAC45位于NAC基因家族的第1亚族。基因表达谱分析显示,SiNAC45主要在谷子根部表达,并且能够被低钾和ABA诱导表达。亚细胞定位结果显示SiNAC45定位于细胞核。基因功能分析结果显示,在不同浓度低钾处理下,和野生型拟南芥相比,SiNAC45转基因拟南芥的根长和植株鲜重显著增加,说明过表达SiNAC45可以提高转基因植物对低钾胁迫的抗性。下游基因表达分析结果显示,在SiNAC45转基因植物中两种重要的钾离子转运体基因AKT1和HAK1的表达显著提高,证明SiNAC45通过调控植物钾离子转运体基因的表达影响植物对低钾胁迫的耐性。种子萌发试验结果显示,SiNAC45转基因拟南芥与野生型拟南芥相比对ABA的敏感性降低,说明SiNAC45可能负调ABA信号。     

小麦蛋白磷酸酶2A基因TaPP2AbB″-α启动子的克隆及表达分析

植物蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)由结构亚基A、调节亚基B和催化亚基C组成,在应答逆境胁迫途径中发挥着重要作用。小麦基因Ta PP2Ab B″-α是调节亚基亚家族B″的成员,过量表达该基因可以促进拟南芥的根系生长及侧根发育,在盐胁迫和渗透胁迫条件下的作用更显著。本研究从小麦(Triticum aestivum L.)抗旱品种"旱选10号"基因组中克隆了Ta PP2Ab B″-α基因的启动子PB″α,序列长度为1899 bp,含有TATA-box和CAAT-box,以及响应干旱和渗透胁迫的顺式作用元件EECCRCAH1(?1058 bp至?1052 bp)、GCCCORE(?1073 bp至?1068 bp)和MYCCONSE(?1179 bp至?1174 bp)。将启动子PB″α和5种5′端缺失启动子片段与报告基因GUS(β-glucuronidase)连接后转化拟南芥,组织化学染色结果显示PB″α在植株的叶片和根中均有表达。5′端缺失分析表明缺失片段PB″α-1545和PB″α-1389具有启动子活性,活性区域位于?1389 bp和?946 bp之间。GUS定量分析结果显示,在盐和渗透胁迫条件下,PB″α、PB″α-1545和PB″α-1389的活性显著上升。本研究表明PB″α具有较强的启动子基本活性,并且在盐胁迫及渗透胁迫条件下活性显著上升,该结果为合理选用启动子改良作物提供了依据。     

谷子PYR/PYL/RCAR基因家族进化及表达分析

脱落酸(abscisic acid, ABA)是植物五大激素之一,在植物的生长发育及逆境胁迫中发挥重要的作用。PYR/PYL/RCAR (pyrabactin resistance/pyr1-like/regulatory components of ABA receptor)为ABA的受体蛋白,是ABA信号传导网络中的核心组分。谷子为重要的旱作模式植物,为了解谷子PYL基因家族的进化情况,本研究采用生物信息学手段,在全基因组范围水平对谷子PYL基因家族进行了分析。利用同源比对的方法,鉴定到9个PYL基因,被分成三大类。谷子与拟南芥、水稻、高粱和玉米PYL基因的系统进化树显示,PYL基因家族在单双子叶植物分歧之后,进行了各自演化,但是在禾本科植物中,该基因家族相对更保守一些,Ks和同源性分析表明谷子的PYL基因大多数在谷子与水稻物种分歧之前就已经存在。谷子9个PYL基因分布于5条染色体上,PYL蛋白多定位于细胞质,大多为酸性亲水性蛋白,组织表达分析显示谷子PYL基因的表达具有明显的组织特异性;启动子分析结果显示,谷子只有两个PYL基因含有抗旱相关元件MBS,且每个基因只包含一个元件。这些结果将会为进一步研究谷子PYL基因的功能及作用机制提供一定的帮助。     

烟草磷酸酶基因NtPP2C16的克隆、表达载体构建及表达分析

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C-type protein phosphatases,PP2C)是ABA信号转导途径中的关键组分,在植物生长发育、细胞周期调节及应对逆境胁迫的过程中发挥重要的作用。为探究PP2C基因在烟草适应非生物胁迫中的功能,从烟草栽培品种K326中克隆到了一个PP2C同源基因,该基因开放阅读框为1 617 bp,编码538个氨基酸残基。同源性分析结果显示,该基因所编码的蛋白与绒毛状烟草PP2C16的亲缘关系最近,故命名为NtPP2C16。生物信息学分析表明,NtPP2C16催化区域上具有PP2C家族进化中相对保守的11个结构亚区。qRT-PCR研究分析结果表明:该基因的表达显著受ABA和H_2O_2 2种信号分子诱导,并且响应干旱、高盐、低温和低钾胁迫。成功构建NtPP2C16-pBI121过表达载体,为解析NtPP2C16参与烟草非生物逆境胁迫响应提供一定的理论依据。     

谷子逆境应答相关的钙依赖蛋白激酶基因SiCDPK1的克隆与表达

CDPK是一类重要的钙信号感受蛋白和响应蛋白,在植物非生物胁迫应答方面具有重要的作用。为探究耐旱作物谷子CDPK在抗逆胁迫中的应答机制,本文利用RT-PCR技术从谷子幼苗cDNA中克隆到一个与逆境胁迫相关的CDPK基因,命名为SiCDPK1 (GenBank登录号为KC249975.1)。以拟南芥CDPK基因序列为查询序列,预测谷子基因组含有28个CDPK基因。其系统发育分析表明,谷子CDPK基因家族由4个亚类组成,其中SiCDPK1属于第II亚类,其全长1596 bp,编码531个氨基酸,预测蛋白分子量为59.5 kD,等电点pI为5.94,含有典型CDPK的保守结构。启动子调控区含有与多种逆境胁迫相关的调控元件。实时定量结果显示,SiCDPK1基因受PEG、ABA、高盐、自然干旱胁迫诱导表达。本试验为谷子抗逆应答机制的深入研究奠定了良好的理论基础。     

谷子SiPRR37基因对光温、非生物胁迫的响应特点及其有利等位变异鉴定

从谷子品种延谷11号克隆生物钟基因SiPRR37,通过生物信息学分析、组织特异性表达分析、4种不同光温组合条件的昼夜表达模式分析以及对NaCl、ABA、PEG、低温、Fe 5种非生物胁迫的响应特点分析,揭示SiPRR37参与谷子光温互作调控以及应对非生物胁迫的作用机制;并对160份谷子材料重测序检测SiPRR37基因的突变位点进行单倍型分析,探究该基因对谷子主要农艺性状的影响。结果表明,SiPRR37基因蛋白质编码区(sequence coding for amino acids in protein,CDS)全长2247 bp,编码748个氨基酸,含有REC和CCT 2个结构域,基于PRR37蛋白的系统进化分析发现,谷子与糜子、高粱、玉米亲缘关系最近;启动子预测分析发现,SiPRR37启动子区存在光、温、生长素、赤霉素、脱落酸、茉莉酸甲酯、干旱和盐胁迫等多种应答元件。SiPRR37相对表达量从高到低依次为根、穗颈、穗、顶叶、次顶叶、茎秆;4个光温组合条件SiPRR37均只在光照期出现1个表达峰,无论高温(27℃)还是低温(22℃),短日照相比长日照表达峰均要提前,无论长日照还是短日照,低温(22℃)相比高温(27℃)表达峰均要提前;NaCl、低温(15℃)胁迫能够抑制SiPRR37表达,PEG模拟干旱胁迫和Fe胁迫能够诱导SiPRR37基因表达,SiPRR37参与了ABA信号传导过程。位于SiPRR37 CDS区的10个SNP将160份谷子材料分为19个单倍型,其中3个单倍型(Hap_7、Hap_10、Hap_19)是改善穗部性状的有利单倍型。谷子SiPRR37基因表达具有昼夜节律性,同时受光周期和温度调控,并且参与了谷子对盐胁迫、低温胁迫、干旱胁迫和铁胁迫的应答反应,同时SiPRR37与抽穗期和多个穗部性状相关,在开展谷子高产分子辅助选育中具有一定应用潜力。     

谷子F-box家族基因的鉴定、分类及干旱响应

蛋白参与细胞周期调控、细胞凋亡及信号转导等多种生命活动对维持植物正常生长发育和介导非生阿物胁迫响应等过程发挥重要作用。谷子具有显著的耐旱耐瘠薄等特性本研究根据谷子转录组分析结果从个家族成员中鉴定出个在干旱胁迫下表达量上调的基因根据序列相似性将其分为类同一类基因具有相似的内含子外显子结构染色体定位分析发现这些基因分别分布在谷子的条染色体上其中第条染色体上含基因最多有个。结构域分析结果表明个蛋白均含保守的结构域而端含、、、、和等结构域。启动子元件分析表明谷子个基因均含逆境应答元件其中和元件的数量最多个说明这些基因对干旱应答反应可能主要受、转录因子调控。转录组分析结果表明基因对干旱胁迫的响应远远高于其他成员对干旱、高盐、、和都有响应亚细胞定位结果显示蛋白定位在细胞核中。本研究为进一步深入了解基因的功能提供了依据。F-box蛋白参与细胞周期调控、细胞凋亡及信号转导等多种生命活动, 对维持植物正常生长发育a和介导非生阿物胁迫响应等过程发挥重要作用。谷子具有显著的耐旱耐瘠薄等特性, 本研究根据谷子转录组分析结果, 从525个F-box家族成员中鉴定出19个在干旱胁迫下表达量上调的F-box基因; 根据序列相似性将其分为6类, 同一类基因具有相似的内含子-外显子结构; 染色体定位分析发现, 这些基因分别分布在谷子的8条染色体上, 其中, 第2条染色体上含F-box基因最多, 有6个。结构域分析结果表明, 19个F-box蛋白均含保守的F-box结构域, 而C端含FBD、WD40、FBA、ZnF、Kelch和LRR等结构域。启动子元件分析表明, 谷子19个F-box基因均含逆境应答元件, 其中, MYB和MYC元件的数量最多(9~78个), 说明这些基因对干旱应答反应可能主要受MYB、MYC转录因子调控。转录组分析结果表明, SiF-box18基因对干旱胁迫的响应远远高于其他F-box成员, 对干旱、高盐、ABA、SA和JA都有响应; 亚细胞定位结果显示, SiF-box18蛋白定位在细胞核中。本研究为进一步深入了解SiF-box18基因的功能提供了依据。     

谷子丙酮酸磷酸双激酶基因(SiPPDK1)对非生物逆境的响应

通过序列比对在谷子基因组中鉴定出一个PPDK基因,命名为Si PPDK1。为揭示该基因对逆境胁迫的响应,本研究通过对Si PPDK1的基因结构、蛋白特征、功能、启动子区域顺势元件、亚细胞定位、进化特征等进行了系统的分析和预测。荧光实时定量PCR检测了该基因在苗期不同逆境、关键生育期干旱以及不同光照条件下的表达。结果表明该基因位于谷子9号染色体,含有17个内含子,有2个可变剪切。功能域分析和多序列比对发现Si PPDK1蛋白具有非常保守的序列结构,并且与其它植物PPDK蛋白非常相似。q RT-PCR表达谱分析表明Si PPDK1基因在苗期被PEG、ABA、Na Cl和低温胁迫强烈诱导。进一步研究表明Si PPDK1基因在拔节、抽穗和灌浆期干旱和不同光照强度条件下均参与了对干旱和光照的胁迫响应,推测该基因参与了谷子对非生物逆境的应答,尤其在抽穗期干旱和光照胁迫应答中起重要作用。     

谷子CBL基因鉴定及其在干旱、高盐胁迫下的表达分析

CBL/CIPK信号网络系统在植物对逆境应答过程中起重要作用。本文利用生物信息学方法从谷子基因组中鉴定出7个候选CBL基因,命名为SiCBL1~SiCBL7。分析表明谷子CBL基因在蛋白质序列和结构上非常保守,所有预测SiCBL基因都含有7~8个内含子,而且其外显子序列同源性很高并且大部分外显子含有相同的碱基数目。预测SiCBL基因均含有4个EF-Hand功能域而且相邻EF-Hand功能域之间的氨基酸数目非常保守。进化和聚类分析结果表明, CBL基因在陆生植物早期的进化过程中就已经存在,所有CBL基因被分为4个亚组。7个候选SiCBL基因中, 4个基因(SiCBL1、SiCBL2、SiCBL3和SiCBL5)受干旱胁迫诱导表达,3个(SiCBL1、SiCBL3和SiCBL7)受高盐胁迫诱导表达。SiCBL3基因在干旱胁迫下被强烈诱导可能意味着其在干旱应答中起重要作用。本文报道的谷子CBL基因丰富和完善了植物CBL成员, 为进一步研究CBL/CIPK网络系统在抗逆作物谷子逆境响应中的功能、机制奠定了基础。     

两个谷子CIPK基因在非生物逆境胁迫下的表达分析

CIPK是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫过程中发挥重要作用。本文利用生物信息学方法从谷子基因组中鉴定出2个CIPK基因, 命名为SiCIPK6和SiCIPK16。序列分析表明SiCIPK6基因组序列长1994 bp,编码451个氨基酸;SiCIPK16基因组序列长1885 bp,编码473个氨基酸,2个基因均无内含子和可变剪切。生物信息学分析显示这2个基因在蛋白质序列和结构上与其他物种CIPK基因一样非常保守。实时定量PCR分析表明SiCIPK6和SiCIPK16在ABA、低温、高温、干旱、高盐诱导下表达量均有所上调, SiCIPK6基因在ABA、干旱和盐处理时表达量上调幅度较大,而SiCIPK16基因在低温、干旱和高温处理时表达量上调幅度较大。半定量PCR检测结果表明SiCIPK6和SiCIPK16两个基因在拔节、孕穗、灌浆期时均有表达,在相应生育时期受到干旱胁迫时它们表达量均有所提高。推测SiCIPK6和SiCIPK16基因在谷子的干旱或其他逆境胁迫中起一定作用。     

谷子糯质基因共分离分子标记的研究

为得到一种鉴别糯质谷子的分子标记方法,用于优质谷子糯质资源的利用及糯质品种的选育。通过对糯性谷子十里香与梗性谷子豫谷1号配制的F2群体的F3种子胚乳进行碘液检测,结果显示:深蓝色与棕红色胚乳单株数的比例符合3∶1,说明糯质对梗质是由单基因控制的隐性性状。利用糯质分型引物对十里香基因组进行PCR扩增和产物测序,结果表明,十里香的糯性是由Ⅳ型糯质基因控制,即由TSI-2转座子插入到淀粉合成酶基因(Si006103m)内元1形成。根据该糯质基因设计出2对In Del标记引物waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R,扩增谷子基因组DNA,若waxy-TSI2/int1引物组合能扩增出984 bp的扩增片段,并且waxy-int1-1F/4R引物组合不能扩增出540 bp的扩增片段,则该材料为含Ⅳ型糯质基因的糯质谷子。最后,利用该标记组合从100份谷子资源中鉴定到2份属于Ⅳ型糯质基因控制的糯质材料。可见,该标记组合可以准确鉴别谷子Ⅳ型糯质基因。     

谷子角质合成基因对干旱胁迫的响应

干旱是影响谷子产量的重要因素,以抗旱性强的谷子品种赤谷16（M79）及其母本赤谷10号（E1）,父本承谷8号（H1）作为研究材料,采用苗期自然干旱处理并设置对照,在干旱处理第6天（土壤水分含量约为20%）时取叶片进行转录组测序。用ExPASY分析基因的理化性质,GSDS 2.0分析基因结构,MAGA 7.0构建系统进化树,TMHMM Server v. 2.0预测跨膜结构域,SOPMA预测蛋白的二级结构。结果显示8个谷子角质合成基因编码的蛋白均为亲水性蛋白,且均为酸性;经干旱胁迫处理之后,M79、E1和H1中8个基因的表达变化趋势有所不同,Seita.8G128800和Seita.7G197000表达明显上调;8个基因中有4个基因与玉米的基因具有同源性,有3个基因与水稻的基因具有同源性,编码蛋白部分有跨膜结构域。角质合成基因在谷子响应干旱胁迫过程中发挥作用,其调控机理较为复杂。本研究的结果为进一步探讨谷子角质与抗旱的关系提供了一定理论依据。