新疆生产建设兵团科技进步三等奖新疆醉马草（小花棘豆）毒性成分新疫苗的研制

成果简介：本成果改进了小花棘豆毒性成分苦马豆素的提取装置和方法；通过动物试验，测定了苦马豆素的毒性。并探讨了苦马豆素的作用机理：应用现代分子生物学及免疫化学方法，研制了小花棘豆毒性成分疫苗。其中对苦马豆素中毒机理有新的发现；通过疫苗预防、抗体治疗和改进饲喂方法，建立了一整套小花棘豆安全利用方案；分离得到了7种生物碱在国内外未见报道：发现了小花棘豆黄酮在抗氧化、保肝、抗疲劳等方面的新应用。小花敕豆是新疆危害最严重的毒草之一，本成果对小花棘豆的毒性作用、中毒机理和防治措施等进行了明确阐述，为小花棘豆的开发利用提供了依据。本成果具有较高的应用价值和广泛的应用前景。     

疯草研究进展

疯草是指含有苦马豆素的豆科黄芪属和棘豆属有毒植物,动物疯草中毒病是危害草原畜牧业最严重的问题之一.苦马豆素是疯草的主要毒性成分,它能抑制动物细胞α-甘露糖苷酶和甘露糖苷酶Ⅱ的活性,影响低聚糖的代谢和糖蛋白的加工,导致低聚糖蓄积和糖蛋白合成障碍.中毒动物表现为行为异常、瘫痪、不育、流产、体质量下降,严重的发生死亡,造成巨大的经济损失.本文主要对疯草的毒性成分、中毒机理、化学防除和脱毒利用等方面的研究进行了综述,旨在为疯草中毒病的防治和疯草的利用提供思路和认识.     

疯草研究进展

疯草是指含有苦马豆素的豆科黄芪属和棘豆属有毒植物,动物疯草中毒病是危害草原畜牧业最严重的问题之一.苦马豆素是疯草的主要毒性成分,它能抑制动物细胞α-甘露糖苷酶和甘露糖苷酶Ⅱ的活性,影响低聚糖的代谢和糖蛋白的加工,导致低聚糖蓄积和糖蛋白合成障碍.中毒动物表现为行为异常、瘫痪、不育、流产、体质量下降,严重的发生死亡,造成巨大的经济损失.本文主要对疯草的毒性成分、中毒机理、化学防除和脱毒利用等方面的研究进行了综述,旨在为疯草中毒病的防治和疯草的利用提供思路和认识.     

新疆生产建设兵团科技进步三等奖 新疆醉马草(小花棘豆)毒性成分新型疫苗的研制

<正>项目来源及编号:兵团博士资金专项(2008JC07)项目主持人:马春晖教授完成单位:塔里木大学动物科学学院起止时间:2008.1-2011.12项目简介:成果简介:本成果改进了小花棘豆毒性成分苦马豆素的提取装置和方法;通过动物试验,测定了苦马豆素的毒性,并探讨了苦马豆素的作用机理;应用现代分子生物学及免疫化学方法,研     

苦马豆素抗牛病毒性腹泻病毒的研究

【目的】疯草是中国西部影响草地生态和畜牧业健康发展的毒草之一。主要有豆科棘豆属和黄芪属有毒植物等,在冬季牧草严重缺乏的时节,牛羊等牲畜被迫采食后可引起中毒和生产性能下降,甚至死亡,每年给我国草地生态和畜牧业造成的直接经济损失达几十亿元,是危害最严重的毒草。目前,我国西部天然草地动物因疯草中毒死亡所造成的经济损失仍持续剧增。苦马豆素被认为是引起动物疯草中毒的主要毒性成分。由于疯草分布广泛,资源丰富,如何改善草地生态,合理开发利用疯草成为研究的课题和方向。近几十年来, 随着对疯草研究的深入和扩展,人们发现苦马豆素不仅具有良好的抗肿瘤效果,还可作为免疫调节剂、抗HIV及扩散抑制剂、抗病毒和细胞保护剂等药物使用。目前,国内在对苦马豆素抗肿瘤、调节机体免疫方面研究较热,但是,对苦马豆素在抗病毒活性、作用机理方面的研究尚无相关报道。为了探讨茎直黄芪中生物碱苦马豆素（swainsonine,SW）抗牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）的作用机制,明确其体外抗病毒作用效果,为抗BVDV的药物筛选提供参考依据。【方法】利用细胞培养技术,采用CPE观察法和MTT比色法相结合的方法测定不同浓度SW对牛肾原代细胞(madin-darby bovine kidney cells,MDBK)的毒性作用,确定药物的安全浓度和TD50,并分别采用先加药后感染病毒、先感染病毒后加药、药毒作用2 h后加入、感染病毒同时给药后再加药四种作用方式,检测不同浓度SW对BVDV入侵的阻断作用、复制的抑制作用、直接杀伤作用和综合作用,并计算不同作用方式下的治疗指数。【结果】结果显示：SW浓度小于0.256 μg•mL-1范围内对MBDK细胞无毒性作用,在大于0.512 μg•mL-1浓度下MBDK细胞表现出一定程度的病变,TD50为2.512 μg•mL-1,按Reed-Muench 氏法计算BVDV TCID50为10-4.7/0.1mL;在体外随苦马豆素质量浓度的增加,其抗BVDV作用具有很好的量效关系,且与作用方式有关,比较四种作用方式下的治疗指数1.05、2.47、2.08和3.21,说明SW对BVDV的综合作用（65.29%,P＜0.01）和复制（65.05%,P＜0.01）的抑制作用较好,亦有一定的直接杀伤作用,但对其入侵的阻断作用不佳。【结论】SW在体外有良好抗BVDV活性作用,并推测苦马豆素（SW）抗病毒的主要效应可能是SW能进入细胞内抑制BVDV的复制增殖以及直接灭活游离BVDV而发挥作用。     

西藏茎直黄芪中苦马豆素的纤维素酶法提取和气相色谱法检测研究(英文)

疯草是一种有毒植物,广泛分布在世界大部分地区,牲畜采食后容易引起中毒或死亡,给养殖业造成严重的经济损失。茎直黄芪属于疯草的一种,它主要分布于中国西藏,是一种严重危害到当地畜牧产业的有毒植物。本研究的目的是利用纤维素酶法提取茎直黄芪中苦马豆素并进行气相色谱法检测,确定最佳提取工艺条件。通过单因素试验、正交试验和方差分析优化确定了苦马豆素的酶法提取工艺条件,并用气相色谱法测定了提取物中苦马豆素的含量。优化的最佳提取条件为:粉碎目数为40目,料液比1∶40,纤维素酶添加量3.5%、酶解时间3.0 h。在优化提取条件下,苦马豆素的提取率可达到0.003 941%。研究表明,纤维素酶法快速、高效、方便、节能,有利于茎直黄芪中苦马豆素的提取。     

金龟子绿僵菌中苦马豆素的分离与鉴定

探求从金龟子绿僵菌中分离苦马豆素的有效方法,提高苦马豆素产量及降低苦马豆素生产成本。采用超声波处理、过滤、离心、索氏抽提、萃取、离子交换色谱、吸附柱色谱及减压升华等方法,从菌丝体中分离苦马豆素,以薄层色谱、气相色谱及熔点测定法对分离产物进行鉴定分析,气相色谱法测定金龟子绿僵菌干燥菌丝体中苦马豆素的含量。结果分离到白色针状结晶3.15 mg,经薄层色谱、熔点测定及气相色谱鉴定分析,确定分离到的结晶为苦马豆素,提取率为21μg/g。气相色谱法测定金龟子绿僵菌干燥菌丝体中苦马豆素的含量为2.26 mg/g。     

中国主要疯草中苦马豆素的动态变化规律

通过研究疯草中主要毒性成分—苦马豆素的动态变化规律,为疯草防治利用提供理论依据。在采集疯草时对其生长环境进行观察和GPS定位,确定样品采集信息。采用气相色谱方法,对不同地区采集的不同种类、不同生长时期和不同生长部位的疯草样品中的苦马豆素含量进行测定,分析苦马豆素动态变化规律。按照疯草种类区分,甘肃棘豆苦马豆素平均含量最高,达到0.148‰,最低为哈密黄芪,为0.044‰;按照区域区分,采于青海野牛坡的花期急弯棘豆苦马豆素含量最高,达到0.277‰;按照生长阶段区分,花期苦马豆素含量最高,平均达到0.139‰;不同部位中,花的含量最高,平均达到0.162‰。不同种类疯草中苦马豆素含量由高到低的顺序依次为:甘肃棘豆、急弯棘豆、茎直黄芪、小花棘豆、变异黄芪、哈密黄芪;按区域区分,不同区域疯草中苦马豆素含量随海拔升高而升高;按生长阶段区分,不同生长时期的疯草中苦马豆素含量由高到低依次为花期、花果期、果期和花前期,按生长部位区分,苦马豆素含量也有差别,由高到低分别是花、叶、荚果、根和茎。     

苦马豆素对小鼠肝脏抗氧化功能的影响

[目的]探讨苦马豆素对小鼠肝脏抗氧化功能的影响,进一步揭示苦马豆素的毒性作用机理.[方法]将64只昆明种小鼠随机分为对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组,将小花棘豆全草粉碎后,按Ⅰ组添加15;(含苦马豆素30 mg/kg)、Ⅱ组添加30;(含苦马豆素60 mg/kg)、Ⅲ组添加45;(含苦马豆素90 mg/kg)的比例制作颗粒饲料,饲喂至典型中毒症状出现.攻毒第14、28、42、63 d每次每组随机采集4只小鼠的肝脏,检测SOD、GSH-Px、CAT、NOS活性及MDA、NEFA、·OH、NO和Glu含量的变化.[结果]与正常对照相比,试验组小鼠肝脏SOD、GSH-Px、CAT等抗氧化物酶的活性极显著下降(P＜0.01),MDA、NEFA、·OH、NO含量极显著上升(P＜0.01),Glu含量极显著下降(P＜0.01).[结论]苦马豆素对小鼠肝脏抗氧化功能有显著影响,而且具有一定的时间和剂量效应关系,长期低剂量摄入苦马豆素可引起小鼠不同程度的肝损伤.     

甘肃棘豆中降解苦马豆素内生细菌的筛选与鉴定

为研究甘肃棘豆(Oxytropis kansuensis Bunge)中降解疯草毒素——苦马豆素的内生细菌,采用选择性富集培养的方法,以苦马豆素作为唯一碳源,从甘肃棘豆内生细菌中筛选到1株苦马豆素降解菌,命名为Ab.在摇床转速为150 r·min-1、28℃条件下培养30 h,菌株Ab对质量浓度为100 mg·L-1苦马豆素的降解率为11.577 1%;延长培养时间并不能提高其降解苦马豆素的能力,但可耐受高质量浓度(1 g·L-1)的苦马豆素.通过形态学、生理生化试验和16S rDNA序列比对分析对Ab进行鉴定,结果表明,菌株Ab为革兰阴性短小杆菌,在LB平板上菌落呈圆形,中心凸起,边缘整齐,乳白色,表面光滑,属于短波单胞杆菌属(Brevundi monas),与缺陷短波单胞菌(Brevundi monas diminuta)同源性为100%.说明甘肃棘豆中存在降解苦马豆素的内生细菌Brevundi monas diminutaAb;降解苦马豆素的内生细菌可能与产生苦马豆素的内生真菌共同维持疯草中苦马豆素的动态平衡.     

黄花棘豆有毒成分的分离与鉴定

本研究从黄花棘豆中分离出吲哚兹定生物碱—苦马豆素,并证实这种生物碱对α-甘露糖甙酶有抑制作用。研究表明:人工饲喂黄花棘豆中毒羊血浆的α-甘露糖甙酶显著低于正常对照羊(p<0.01),停止饲喂黄花棘豆后,中毒羊逐渐康复,血浆α-甘露糖甙酶迅速恢复正常。经测定黄花棘豆及甘肃棘豆的苦马豆素含量分别为0.012%,0.021％。从而认为苦马豆素是黄花棘豆和甘肃棘豆的主要有毒成分。     

气相色谱内标法测定苦马豆素的含量

以气相色谱内标法测定变异黄芪中苦马豆素的含量。用超声波协助提取并用溶剂萃取变异黄芪样品,选用D-甘露醇为内标物,采用AT.SE-54毛细管作为色谱柱,柱温210℃,气化室300℃,检测器280℃,分流比30∶1,氢火焰离子化检测器。结果表明,苦马豆素与内标分离良好,在0.015 6~1.0 g/L时线性关系良好(R2=0.999 7),平均加样回收率为90.6%(RSD=2.41%)。该方法简便、灵敏、易操作,可用于疯草类植物样品中苦马豆素含量的检测。     

苦马豆素对家兔肝脏抗氧化功能的影响

为了探讨苦马豆素对家兔肝脏抗氧化功能的影响,进一步揭示苦马豆素的毒性作用机理,将24只家兔随机分为4组,即对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组。将小花棘豆全草粉碎后,按Ⅰ组添加15%(含苦马豆素30 mg/kg)、Ⅱ组添加30%(含苦马豆素60 mg/kg)、Ⅲ组添加45%(含苦马豆素90 mg/kg)的比例制作混合饲料,饲喂至典型临床症状出现为止。攻毒后第14、35、71-70 d每次每组随机采集2只家兔的肝脏组织,检测机体SOD、GSH-Px、CAT和NOS活性及MDA、NEFA、·OH和NO含量的变化。结果显示,与正常对照组相比,试验组家兔肝脏SOD、GSH-Px、CAT等抗氧化物酶的活性极显著下降(P﹤0.01),而MDA、NEFA、·OH和NO含量极显著上升(P﹤0.01)。结果表明,不同浓度苦马豆素对家兔肝脏抗氧化功能有显著影响,且具有一定的时间效应和剂量效应关系,长期低剂量摄入苦马豆素可引起家兔机体不同程度的肝损伤。     

产苦马豆素疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis的诱变筛选

【背景】疯草是黄芪属和棘豆属有毒植物的统称,疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis是从疯草中分离获得的一种具有产生苦马豆素（swainsonine,SW）能力的真菌。因其产物SW一方面体现出良好的抑制肿瘤细胞生长、浸润和转移作用及潜在的抗艾滋病病毒等多种药用活性,另一方面牛羊因大量误食疯草能导致中毒,对草原畜牧业健康发展造成了严重的危害,受到研究人员的广泛关注。但由于疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis产苦马豆素生物合成机制尚不清楚,严重制约了后续通过生物发酵大量获得SW用以抗肿瘤机制研究与临床应用,以及通过基因工程手段对疯草进行脱毒育种,使疯草成为牛羊可食用、无毒的天然牧草。【目的】利用有效的研究手段,阐明Alternaria Section Undifilum oxytropis产苦马豆素生物合成机制。【方法】以Alternaria Section Undifilum oxytropis为出发菌株,分别采用紫外辐照诱变、亚硝基胍化学诱变、紫外辐照与亚硝基胍复合诱变的3种诱变方式,在不同诱变时间、诱变剂量等条件下对其进行了诱变筛选研究。通过测定不同诱变方式和作用条件下对菌株的致死率,经发酵培养、连续5代传代培养、并采用α-甘露糖苷酶活性分析法检测诱变菌株产苦马豆素含量变化,优化确定了不同诱变方式下最佳诱变条件,并将优势突变菌株接种马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar,PDA）和改良察式液体培养基,连续培养32 d,测定并绘制了突变菌株D4和UD1的生长周期曲线。【结果】经上述3种诱变方式处理后,分别获得1株产苦马豆素含量变化较大、能稳定连续传代培养的突变菌株U4、D4、UD1。其优化的诱变条件,紫外辐照为辐照处理160 s,亚硝基胍化学诱变为亚硝基胍诱变剂量6 μL、诱变处理时间5 min,紫外辐照与亚硝基胍复合诱变为紫外辐照20 s,亚硝基胍诱变剂量2 μL,诱变处理时间5 min。突变菌株U4、D4、UD1较原始菌株,菌落形态偏小、中间凸起,菌落颜色呈微粉色或白色,且其产苦马豆素含量均有显著变化,其中U4突变菌株产苦马豆素量平均增加16.02%（P<0.01）、D4 突变菌株产苦马豆素量平均降低23.58% （P<0.01）,UD1 突变菌株SW产量平均增加21.87%（P<0.01）,但D4、UD1突变菌株生长周期与出发菌株一致,均为24 d。【结论】通过紫外辐照诱变、亚硝基胍化学诱变、紫外辐照与亚硝基胍复合诱变方法,成功筛选出产苦马豆素含量变化较原始菌株差异较大的3株突变菌株U4、D4、UD1,这为后续利用高通量测序等分子生物学手段,在分子水平上阐释疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis关键基因、关键酶在其生物合成苦马豆素机制关系方面奠定研究基础。     

苦马豆素抗血清治疗山羊甘肃棘豆中毒的血清学和免疫学指标评价

通过检测苦马豆素抗血清治疗山羊甘肃棘豆中毒的血清学和免疫学指标,评价苦马豆素抗血清对山羊疯草中毒的治疗效果。将18只山羊随机分为对照组(A组,6只)、攻毒治疗组(B组,6只)和攻毒组(C组,6只),其中B、C组山羊于第1天拌精料饲喂甘肃棘豆草粉,开始攻毒剂量为10 g/(kg.d);C组山羊(第55天)出现死亡时停止攻毒。攻毒后第21天,B组山羊颈部肌肉注射苦马豆素抗血清,每只山羊每次0.25 mL/(kg.d),连续注射4 d。各组山羊于攻毒前进行第1次采血,以后每隔7 d采血1次,共采血8次。结果显示,攻毒后第7天,B、C组山羊AKP活性和AMA活性分别上升和下降,且均与A组差异极显著(P<0.01);第14天,B、C组山羊血清LDH活性明显高于A组(P<0.05);第21天,B、C组山羊的E-玫瑰花环率明显低于A组(P<0.05)。对B组山羊注射苦马豆素抗血清,治疗后(第28天)首次检测结果显示,B组山羊AKP、AMA和BUN活性较C组均表现为差异极显著(P<0.01);第35天(第2次检测),B组山羊血清中苦马豆素浓度明显低于C组(P<0.01),而E-玫瑰花环率明显高于C组(P<0.05);第42天,B组山羊LDH活性显著低于C组山羊(P<0.05)。研究证实,苦马豆素抗血清能够有效治疗甘肃棘豆对山羊肝脏、心脏和肾脏等组织器官造成的损伤,可用于治疗山羊疯草中毒。     

家兔苦马豆素多克隆抗体的制备及其对小花棘豆中毒的治疗效果

采用合成的苦马豆素(swainsonine,SW)人工抗原免疫接种家兔,获得高效价的SW抗血清,分离纯化得到的家兔SW多克隆抗体,复制家兔小花棘豆中毒模型,用SW多克隆抗体治疗小花棘豆中毒家兔,通过检测血清生化指标和免疫学指标,评价SW多克隆抗体治疗家兔小花棘豆中毒的效果。将18只家兔随机分为对照组(6只)、攻毒组(6只)和攻毒治疗组(6只),攻毒组和攻毒治疗组按照10g/(kg·d)的剂量饲喂小花棘豆,攻毒组试验兔出现死亡时(第70天)停止攻毒。攻毒第21天,攻毒治疗组试验兔注射SW多克隆抗体,每只兔每天1mL,连续注射4d。以攻毒试验开始为第0天进行首次采血,试验开始后每7d采血1次,进行血清免疫和生化指标测定。结果显示,攻毒第7天时攻毒家兔血清AKP活性和SW质量浓度显著高于对照家兔(P0.05);第14天时攻毒家兔血清AST和LDH活性显著高于对照家兔(P0.05),血清AMA活性和E-玫瑰花环率均显著低于对照家兔(P0.05);第21天时攻毒家兔血清BUN、CRE和GLU浓度显著高于对照组家兔(P0.05)。攻毒治疗组家兔注射SW抗血清后血清AKP、LDH、AST、ALT活性,BUN、CRE、GLU浓度和SW质量浓度较攻毒家兔显著下降,AMA活性和E-玫瑰花环率显著上升。说明,SW多克隆抗体可有效治疗家兔小花棘豆中毒。     

Isolation and NMR Study on Swainsonine from Locoweed, Astragalus strictus

Locoweed is a poisonous plant wildly distributed in most area of the world and can cause livestock poisoning or death with significant economic loss. The principal responsible for its toxicity is indolizidine alkaloid swainsonine, a new potential anticancer and antiviral drug. Astragalus strictus is mainly distributed in Tibet of China and is a serious hazard to the local livestock industry. To analyze its main toxic ingredients and supply more structural information and more accurate data, swainsonine has been isolated from this plant by D101 macroporous resin and the ^1H and ^13C chemical shifts of the compound has been assigned by 1D-NMR and 2D-NMR techniques. At the same time, complete assignments of swainsonine＇s ^13C spectral signals are reported.     

小花棘豆及苦马豆素研究文献分析

以《CNKI—中国期刊全文数据库》和《万方数据库》为调查对象,以小花棘豆、苦马豆素为检索词,排除非小花棘豆、苦马素提取等相关文献,对1979—2010年32年来我国对小花棘豆及苦马豆素研究文献的数量、研究领域、文献来源进行分析,初步总结了小花棘豆及苦马豆素研究的主要指标和发展趋势。