转甜菜碱醛脱氢酶基因马铃薯的抗旱耐盐性

通过根癌农杆菌介导法将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入马铃薯栽培品种甘农薯2号, 经PCR、Southern杂交和Northern杂交证明BADH基因已整合到马铃薯基因组中并在转基因植株中转录和表达。测定表明对照植株没有BADH酶活性, 各转化株系在胁迫前后BADH酶活性近似, 在2~11 U之间。BADH酶活性与叶片的相对电导率呈一定的负相关(y= –3.7738x+57.083, r=0.989^**)。在NaCl和PEG胁迫下, 转基因植株生长正常, 株高比对照提高0.41~1.00 cm, 单株重量比对照增加10%~35%, 说明外源BADH基因的导入提高了马铃薯植株对干旱和盐碱的抗性。     

转甜菜碱醛脱氢酶基因提高烟草抗旱及耐盐性

将甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因与组成型启动子CaMV 35S启动子融合,构建了植物表达质粒pBIBB。通过根癌农杆菌介导将BADH基因导入烟草,经PCR、Southern杂交、Northern杂交证明BADH基因已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。测定转基因植株叶片中甜菜碱醛脱氢酶活性,结果显示对照植株没有BADH酶活性,转基因植株的各个株系间甜菜碱醛脱氢酶比活力差异较大,范围在0.1~1.0 U mg-1间。转BADH基因的烟草在盐胁迫和聚乙二醇（PEG）胁迫条件下生长状态良好,生长势强于未转基因植株,说明BADH基因能在异源植物中正常翻译、表达和用于植物抗旱、耐盐基因工程的研究。     

转BADH基因玉米植株的获得及其耐盐性分析

采用超声波辅助花粉介导植物转基因方法, 将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入玉米自交系郑58, 获得了耐盐性强的转基因玉米植株。经卡那霉素抗性初筛、PCR扩增、Southern blot杂交分析, 证明BADH基因已导入转化植株并整合到其基因组中。用不同浓度的NaCl溶液对T₂代转基因玉米植株与对照进行盐胁迫处理, 结果表明, 转BADH基因玉米植株表现出一定的抗逆性, 生长状况明显优于对照; 根据非转化苗对NaCl的反应以及生长状况, 确定250 mmol L^-1 NaCl溶液为玉米幼苗耐盐性筛选的适宜浓度; 依据此临界浓度下形态指标和生理生化指标的测定结果, 与对照相比, 转基因植株的株高提高10.94%~25.7%, 鲜重增加8.62%~18.2%, 干重增加9%~18.18%, 相对电导率降低37.21%~58.14%, 叶绿素含量增加15.89%~90.65%, 超氧化物歧化酶(SOD)活性提高64.92%~148.29%, 丙二醛(MDA)含量减少26.97%~48.05%。综上所述, 转入甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因提高了玉米的耐盐性。这是首例将BADH基因导入优良玉米自交系郑58的报道。超声波辅助花粉介导法是一种经济、高效、实用和无基因型依赖性的植物基因转化方法。     

转甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因棉花的获得及其耐盐性鉴定

甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)是合成甜菜碱的关键酶,广泛用于植物的耐盐转基因研究。为获得耐盐性提高的棉花植株,本研究通过花粉管通道法将山菠菜甜菜碱醛(BADH)基因转化到陆地棉品种——中棉所35。经卡那霉素田间抗性鉴定、标记基因NPT-Ⅱ和目标基因BADH的PCR检测,以及Southern杂交检测,结果表明BADH已整合到棉花的基因组中,并获得转标记基因NPT-Ⅱ和目标基因BADH棉株5株。通过对T2种子在0.6%Na Cl盐池发芽实验结果表明,转化植株的出苗率高达63.4%,对照材料出苗率2.4%,转化植株耐盐性较对照有明显提高。本研究获得转基因植株可作为抗逆育种的种质材料。     

农杆菌介导WRKY Ⅱ基因转化马铃薯抗旱性研究

以马铃薯品种东农308和费乌瑞它微型薯为外植体,利用农杆菌介导法,将抗逆基因p3300-Ubi-WRKY Ⅱ导入马铃薯,经PCR和Southern-blot杂交检测,东农308和费乌瑞它分别有7株和5株呈阳性,证明p3300-Ubi-WRKY Ⅱ基因已整合到马铃薯基因组中。将转基因植株进行抗旱性试验,结果表明,转基因植株对水分胁迫的抗性比对照有显著提高。     

BADH基因转入玉米自交系的研究

采用花粉管通道法将甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)转入玉米自交系京24,以提高玉米的耐盐性。在玉米植株T0代喷洒200mg/L草铵膦除草剂进行抗性试验,获得4株抗性苗。在T0代进行PCR初步检测得到3株转基因植株。在T2代通过Southern blotting以及Northern blotting检测,表明外源BADH基因已经整合并表达。对T2代株系和京24自交系(CK)在高盐胁迫下进行相对含水量、叶片电解质外泄率、甜菜碱含量、脯氨酸含量等生理指标的测定,结果表明转基因株系的生理指标明显好于对照,说明转入BADH基因能提高玉米的耐盐性。     

甘菊DlBADH1基因启动子DBP12表达特性研究

用pCAMBIA1305.2做载体,构建含有甘菊(Dendranthema lavandulifolium)DlBADH1基因(登录号:DQ011151)启动子DBP12(登录号:DQ497621)的质粒pCHW-2.利用叶盘转化法,通过农杆菌EHA105菌株介导,将重组质粒导入烟草叶片.采用GUS组织活性检测法鉴定烟草转基因植株,结果表明:DPB12启动子驱动的GUS基因表达无组织特异性.对转基因植株进行NaCl、ABA、SA处理,GUS荧光测定发现:100μmol/L ABA胁迫处理24 h和400 mmol/LNaCl胁迫处理48 h,转pCHW-2烟草植株叶片中GUS酶活性均有大幅度提高.该结果表明:DlBADH1基因启动子DBP12是一个诱导型启动子.这一研究结果为进一步研究甘菊中BADH基因调控表达机理提供了参考.     

Atfad8叶绿体转基因烟草对冷胁迫的生理响应

摘 要：采用5℃低温处理,研究Atfad8叶绿体转基因烟草对冷胁迫的生理响应。结果表明:随着低温胁迫时间的延长,烟草幼苗的丙二醛(MDA)含量和过氧化物酶(POD)活性呈增加趋势,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性先上升后下降。 Atfad8叶绿体转基因烟草的MDA含量明显低于对照植株,而抗氧化酶活性明显高于对照植株。Atfad8基因的导入提高了烟草幼苗的耐冷害能力。     

异源表达盐单胞属(Halomonas)周质磷酸盐结合蛋白基因PBP降低转基因烟草砷积累研究

为探讨PBP基因在异源烟草中的生物学功能,筛选出低砷(As)积累亲本烟草种质。以转PBP基因烟草T₂代种子和野生型烟草(Nicotiana tabacum K326)种子为材料,利用Real-time PCR分析外源PBP的时空表达模式,测定As胁迫下转基因烟株抗氧化酶(AOEs)活性变化及分析转基因烟草株系中As积累差异。AOEs活性测定表明,As胁迫第5天时CK植株中SOD和POD酶活性达到极值,分别为80.25 U/g和152.02 U/g,显著高于转基因植株;在胁迫后期(3～5 d) CK植株中H₂O₂和MDA含量也显著高于转基因植株。另外,在第7天和14天时转基因植株中As含量比CK植株均显著降低。离子转运蛋白基因表达分析表明,As胁迫不仅诱导转基因植株PBP基因表达显著上调,而且也引起转基因和CK植株中HAK1和PHT4等通道蛋白基因的显著上调,且CK植株中HAK1和PHT4的平均表达水平为转基因植株的1.5倍和3.75倍。外源PBP基因导入可有效降低转基因烟草对As的积累。     

农杆菌介导OD}EB2B基因转化中薯3号的研究

以中薯3号脱毒微型薯为外植体,利用根瘤农杆菌介导ODREB2B基因转化马铃薯,经PCR和RT-PC R检测有6株为转基因植株,确定ODBEB2B基因已整合到马铃薯的基因组中并正常转录和翻译。在0.5% NaCI和10% PEG胁迫处理1周后,马铃薯叶片超氧化物歧化酶(SOD),过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性均呈现升高的趋势,但转基因植株升高幅度大于对照,二者差异达到极显著水平(P<0.01)。结果表明,ODREB2B基因的表达提高了中薯3号的杭干旱和耐盐能力。     

转BADH基因苜蓿T-DNA侧翼序列分析及转化事件特异性分析

为了从分子水平上鉴别不同的转基因株系,以转BADH基因苜蓿的T₀代基因组DNA为模版,采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法分离其外源基因插入位点的侧翼序列,获得了B127株系的左翼序列和右翼序列,以及B125、B138、B295和B196株系的左翼序列。侧翼序列特征分析表明,有的T-DNA边界序列被删除,有的边界序列被保留,并填充了一段未知来源的核苷酸序列。根据侧翼序列中插入载体序列和紧邻插入序列的基因组序列特征,分别设计PCR扩增的上、下游引物,并对获得的42个转BADH株系分别进行左、右翼序列的扩增,结果表明,转基因植株B106、B125、B138、B157、B158、B289、B295、B305和B127具有相同的扩增条带,B203、B220、B223和B196具有相同的扩增条带,说明这些株系可能仅来源于2个转化事件。本研究建立的事件特异性检测方法可以准确地将不同的转化株系区别开来。     

水稻胆碱单加氧酶基因的克隆与表达分析

高等植物中甜菜碱由胆碱经两步氧化反应合成,其中由胆碱单加氧酶(CMO)催化第一步氧化反应,甜菜碱醛脱氢酶(BADH)催化第二步氧化反应.采用生物信息学技术和RT-PCR的方法从水稻幼苗组织中分离得到了水稻CMO基因的cDNA克隆,将其命名为OsCMO.该基因含有10个外显子和9个内含子,其开放阅读框编码一条长为410个氨基酸残基的多肽,与拟南芥、山菠菜、苋、碱蓬和甜菜等植物的胆碱单加氧酶的氨基酸序列的一致性50%～62%.mRNA分析表明OsCMO基因在水稻幼苗组织中的表达受高盐、低温和干旱等胁迫的上调诱导表达,表明该基因可能在抵御非生物胁迫中发挥重要作用.     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因同源片段的克隆与序列分析

在盐和干旱等渗透胁迫条件下,一些植物会积累甘氨酸甜菜碱(简称甜菜碱)作为渗透调节物质,甜菜碱在植物体内由胆碱经两步氧化形成,催化这两步反应的酶分别是胆碱单氧化物酶(cholinemonooxyge-nase,CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(betainealdehydedehydrogenase,BADH)。由于甜菜碱的合成途径简单,进行遗传操作方便,在诸多抗逆性基因中甜菜碱合成酶基因被看作是最有希望的胁迫抗性基因。其中,BADH基因的全长cDNA序列首先被从藜科植物菠菜(Spinaciaoleracea)中克隆到,此后人们相继以该基因为参照,研究其它植物中的BADH基因。本文作者在以菠菜BADH基因为对照研究菊科植物的BADH基因时,根据已发表BADH基因的保守区序列设计了一对PCR兼并引物,以菠菜基因组DNA为模板,采用PCR法扩增出长分别为825bp(seq1)和822bp(seq2)的两个DNA片段,经测序和序列分析,seq1与GenBank中登录的菠菜BADH基因的基因组序列(U69142)一致,其外显子区与已发表的该基因的cDNA序列(M31480)一致,seq2与U69142序列的同源性为68%,其外显子区与M31480序列的同源性为83.93%。而且,在由该核苷酸序列推导的氨基酸序列中,含有醛脱氢酶高度保守的十肽VTLELGGKSP,说明该基因为菠菜BADH基因的同源基因。根据现有文献分析,菠菜中可能存在两个BADH的同工酶,作者所克隆基因片段所属的基因可能编码菠菜BADH的另一个同工酶。该序列已在GenBank中登录,登录号:DQ070842。     

Transgenic soybeans expressing betaine aldehyde dehydrogenase from Atriplex canescens show increased drought tolerance

Betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) catalyses the oxidation of betaine aldehyde to glycine betaine. To test whether BADH can increase drought tolerance in soybean (Glycine max), BADH from the drought‐tolerant plant Atriplex canescens (AcBADH) was introduced into the soybean cultivar ‘Jinong 17’ by Agrobacterium‐mediated cotyledon transformation. Eight independent AcBADH transgenic lines were subjected to drought stress. As expected, AcBADH was expressed in transgenic soybean leaves and not in the control. In transgenic plants, AcBADH expression increased following drought treatment. Under osmotic stress, the germination index was 6%–17% higher in the transgenic lines than in the control. Using a randomized block design, we measured drought‐related physiological indices and yield traits. The proline content in AcBADH transgenic soybeans increased by 12.5%–16.6%, peroxidase activity increased by 1%–7%, dry weight of plant increased by 15%–20% and malondialdehyde contents decreased by 1.5%–13%, compared to the control. Under drought conditions, two of the eight transgenic soybean lines had higher yields than the control, with increases of 7.59%–8.84%. Therefore, transgenic expression of AcBADH may provide a promising strategy to engineer drought tolerance without adverse consequences.     

青稞HvBADH1基因的克隆及其转化烟草的初步研究

应用RT-PCR结合RACE技术, 从青稞总RNA中扩增得长度为1 512 bp的甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因cDNA全长编码序列。通过氨基酸同源性比对, 发现该序列的推定表达产物与大麦BADH同工酶BBD2的同源性为98.4%, 而与小麦、玉米和水稻等禾本科作物的BADH同源性分别为97.0%、84.7%和85.1%。将克隆到的青稞cDNA序列命名为HvBADH1, 投递到GenBank, 获得收录号EF492983。HvBADH1可以在原核表达系统TB1-pMAL c2x中正常表达出分子量为54.2 kD的多肽链。将HvBADH1的编码ORF, 插入到添加了植物表达CaMV 35S启动子和Nos polyA终止子调控元件的植物表达载体pCAMBIA1301质粒相应的克隆位点中, 构建了HvBADH1基因的农杆菌植物转化系统LBA4404(pCAM-ba)。进而采用农杆菌介导法, 将HvBADH1基因导入烟草中, 对所获得的潮霉素抗性烟草株系进行PCR、Southern blot和RT-PCR等分子生物学检测, 结果表明, 在得到的2个转基因株系中, HvBADH1基因已整合到受体植物基因组中, 并且可以在mRNA水平上进行转录。     

小麦农杆菌转化系统的建立与转基因植株的获得

针对农杆菌转化系统的诸多影响因素进行了系统研究，建立了有效的小麦农杆菌转化系统；利用石4185、石6365的花药愈伤组织为受体，进行了甜菜碱醛脱氢酶和胆碱氧化物酶等目的基因的转化研究。     

青稞HvBADH1基因的克隆及其转化烟草的初步研究

应用RT-PCR结合RACE技术, 从青稞总RNA中扩增得长度为1 512 bp的甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因cDNA全长编码序列。通过氨基酸同源性比对, 发现该序列的推定表达产物与大麦BADH同工酶BBD2的同源性为98.4%, 而与小麦、玉米和水稻等禾本科作物的BADH同源性分别为97.0%、84.7%和85.1%。将克隆到的青稞cDNA序列命名为HvBADH1, 投递到GenBank, 获得收录号EF492983。HvBADH1可以在原核表达系统TB1-pMAL c2x中正常表达出分子量为54.2 kD的多肽链。将HvBADH1的编码ORF, 插入到添加了植物表达CaMV 35S启动子和Nos polyA终止子调控元件的植物表达载体pCAMBIA1301质粒相应的克隆位点中, 构建了HvBADH1基因的农杆菌植物转化系统LBA4404(pCAM-ba)。进而采用农杆菌介导法, 将HvBADH1基因导入烟草中, 对所获得的潮霉素抗性烟草株系进行PCR、Southern blot和RT-PCR等分子生物学检测, 结果表明, 在得到的2个转基因株系中, HvBADH1基因已整合到受体植物基因组中, 并且可以在mRNA水平上进行转录。