Hi5-SF悬浮细胞系的建立及鉴定

从中国典型培养物保藏中心(CCTCC)引进High Five细胞并对其进行驯化,获得无血清悬浮驯化株(Hi5-SF)。依据《中华人民共和国药典(2010年版三部)》对其进行细胞生物学特性研究、微生物污染、病毒外源因子及细胞致瘤性检测。结果发现,Hi5-SF细胞复苏活力76.3%,生长曲线呈"S"型,最大增殖密度可达3.50×10~6 mL~(-1),群体倍增时间为26.2h;细菌、真菌及支原体检查均为阴性;血细胞吸附试验、致细胞病变试验和特异性病毒荧光抗体结合物检查结果均为阴性;致瘤性检查结果也为阴性。说明该细胞株符合兽用疫苗生产用细胞质量要求,可以在疫苗研究与生产中应用。     

BHK-21细胞库的建立及其生物学特性鉴定

从美国典型培养物保藏中心(ATCC)和中国兽医药品监察所(中监所)引进2株BHK-21细胞系,传代扩增培养后液氮冻存,建立相应的细胞库;复苏细胞后对活力、形态、生长曲线、微生物污染、染色体核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性进行研究。结果显示,2个来源的BHK-21细胞系均呈成纤维型,生长状态良好;生长曲线呈S型;细菌、真菌、支原体及外源病毒检查均为阴性;染色体为21对,二倍体均占主体;外源质粒在该2株细胞系中能进行复制和表达。这可为开展BHK-21细胞系及口蹄疫疫苗的研究与开发提供基础理论依据和细胞资源。     

ST细胞库的建立及其生物学特性鉴定

从美国典型培养物保藏中心(ATCC)引进ST细胞系,扩大培养后液氮冻存建立了种子细胞库和工作细胞库;细胞复苏后对细胞的活力、形态、生长曲线、微生物污染、核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性进行了研究。结果表明,ST细胞系呈成纤维型,生长状态良好;生长曲线呈S型;细菌、病毒、支原体检测均为阴性;染色体为19对;外源质粒在该细胞中能进行复制和表达。建立的细胞库,可为开展ST细胞及猪瘟疫苗的研究提供基础理论依据和细胞资源。     

ST细胞的鉴定及种子细胞库的建立

为确保疫苗生产的的安全性,对不同代次的ST细胞进行鉴定。从中国兽医药品监察所引进第40代的ST细胞,传至80代,每个代次各冻存3瓶于液氮中。细胞复苏后,对细胞的特征、纯净度、核型、致瘤性及对细胞的毒性进行了研究。结果表明,ST细胞系呈现梭状上皮细胞,生长状态良好,细胞的生长速度基本一致;细菌、霉菌、支原体、外源病毒的检测均为阴性;染色体数目为19对且核型相同;无致瘤性;对豚鼠和兔子无毒性;病毒在ST细胞系中稳定地繁殖,TCID50≥107.00,HI≥1∶32。建立ST细胞的种子细胞库,为开展猪细小病毒疫苗的生产提供安全保障,也为猪伪狂犬病疫苗及猪细小病毒弱毒苗的研究提供基础理论依据。     

PK-15细胞生物学特性鉴定

对PK-15细胞进行细胞形态、生长曲线、微生物、外源病毒、胞核学及细胞致瘤性等特性进行了研究。结果表明,PK-15细胞呈不规则多边形、生长状态良好,无细菌、外援病毒及支原体污染,染色体共19对,细胞无致瘤性。     

MDCK细胞库的建立及其生物学特性研究

分别从美国典型培养物保藏中心(ATCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)、北京协和细胞资源中心及某企业引进4株MDCK细胞系,扩大培养后液氮冻存,分别建立种子细胞库和工作细胞库。细胞复苏后分别对每株细胞进行了活力、形态、生长曲线、微生物污染、核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性研究。结果表明,4个来源的MDCK细胞均呈上皮型,生长状态良好;生长曲线呈S型;细菌、真菌、支原体检测都为阴性;染色体2n=78;外源质粒在该细胞中能进行复制和表达。建立的细胞库为开展MDCK细胞及流感细胞基质疫苗的研究提供了基础理论依据和细胞资源。     

基于PK15细胞的猪圆环病毒2型全悬浮培养工艺

【目的】筛选1株适合PCV2病毒生产的悬浮细胞株,摸索PCV2悬浮生产工艺（病毒种毒来源、MOI及收获时间）,为大规模悬浮培养技术制备疫苗提供试验依据。【方法】使用有限稀释法对PK15原细胞稀释后接种于96孔板,每2 d观察细胞生长和形态,待细胞90%长满后,将细胞从96孔板陆续扩至24孔板、12孔板、6孔板,最后到方瓶,筛选3株可贴壁生长的、形态较好的PK15克隆。3株克隆（PK15-1C8、2F11、1E5）按照1×10⁶细胞/mL的密度,直接接种在PK15的无血清培养基中,并置于37℃,5%二氧化碳,120 r/min的摇床培养箱中继续培养,每天监测细胞密度和活率,每3 d传代,使细胞逐渐适应悬浮环境,驯化为可全悬浮、无血清培养的悬浮细胞株;细胞传代稳定并建库后,接种PCV2病毒,通过对比3株悬浮克隆细胞培养PCV2病毒含量的差异,筛选1株克隆细胞,用于生产PCV2;针对不同种毒（来源于贴壁细胞或悬浮细胞）,摸索感染MOI（0.1、0.2、0.5）及收获时间（48、72、96、120h）,确定PCV2最佳生产工艺。【结果】（1）贴壁细胞置于无血清培养基中,适应至第2代时细胞即可呈悬浮生长,连续传至11代,细胞生长稳定,按照1×10⁶/mL接种细胞,细胞生长72h时细胞密度可达到10×10⁶/mL,活率在95%以上,倍增时间为20h左右;（2）3株悬浮细胞使用相同条件,分别接种PCV2病毒后,PK15-1C8克隆细胞的病毒含量可达到10^6.4TCID₅₀/mL,克隆PK15-2F11（10^5.5TCID₅₀/mL）、PK15-1E5（10^5.6TCID₅₀/mL）,3株克隆细胞病毒含量均高于原克隆（10^4.7TCID₅₀/mL）,但PK15-1C8克隆细胞的病毒含量更高且更稳定,确定为后续研究用细胞;（3）使用贴壁细胞来源的种毒（10^6.4TCID₅₀/mL）感染PK15-1C8克隆细胞后,最优工艺为接毒时细胞密度1×10⁶/mL,以0.1MOI接毒,接毒后72h收获,最高病毒含量为10^6.5TCID₅₀/mL。以来源于悬浮细胞的种毒（10^6.3TCID₅₀/mL）感染细胞后,病毒含量较贴壁细胞来源种毒更高,最高可达10^7.3TCID₅₀/mL,其最优工艺为接毒时细胞密度1×10⁶/mL,以0.2MOI接毒,接毒后72h收获。【结论】通过对PK15细胞进行单克隆筛选,驯化悬浮、3株悬浮细胞接种PCV2后病毒含量的对比,确定一株病毒含量最高的悬浮细胞,并以此悬浮细胞为基础进行PCV2生产工艺摸索,建立了全悬浮无血清培养的PK15-1C8细胞增殖PCV2工艺,该工艺首次使用悬浮细胞扩增PCV2病毒为种毒进行接毒,最高病毒含量可达10^7.3TCID₅₀/mL,可用于工厂化疫苗生产。     

BHK-21细胞用于塞内卡病毒培养最高代次范围研究

根据《兽用生物制品生产用细胞系试验技术指导原则》,将BHK-21细胞原始细胞库F11代传至F52代,取其中部分代次按照《制造及检验试行规程》进行细胞形态、纯净性、胞核学检查、细胞致瘤性检验、病毒培养适应性检验。结果表明,BHK-21细胞F11～F52代各指标的鉴定结果符合规程要求。为确保细胞种子稳定性,建议疫苗生产用细胞限定在43代以内。     

猪细小病毒NJ株ST细胞适应性研究

为评价ST细胞代次的增高对猪细小病毒NJ株免疫原性的影响,将第10、30、60代ST细胞分别接种猪细小病毒NJ株F8、F18代毒种进行病毒培养,通过检测其病毒含量、血凝价以及制备疫苗免疫机体的抗体水平等指标来进行评价。结果表明,各代次病毒含量为10~(7.2)～10~(7.5)TCID_(50)/mL,血凝价为2~9～2~(10);制苗后免疫阴性豚鼠与后备母猪,免疫28 d后均出现抗体反应,HI效价分别为2~7～2~9和2~8～2~9。不同代次毒种接种不同代次ST细胞培养的病毒含量、血凝价及疫苗免疫效力均符合要求。各代次细胞增殖性能稳定,培养的PPV NJ株均能满足兽用生物制品的生产要求。     

河曲马睾丸组织成纤维细胞系的建立及生物学特性研究

采集河曲马睾丸组织,用热消化法制备原代细胞,通过差速消化和差速贴壁法纯化细胞,扩大培养至第3代用液氮保存,细胞复苏后进行活力、形态、生长曲线、微生物污染、核型、乳酸脱氢同工酶谱及荧光蛋白质粒转染表达等特性研究。结果显示,河曲马睾丸组织原代和传代细胞呈成纤维型,生长良好,最大增殖数量为4.32×105 mL-1,倍增时间为34.58h;细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性;染色体2 N=64,二倍体为85%,占主体;乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱有明显特征,共有4条谱带,其中LDH3浓度较高,活性较强;外源质粒在该细胞中能进行复制和表达。表明已成功建立河曲马睾丸组织成纤维细胞系,使河曲马这一重要种质资源在细胞水平上得以保存。