牦牛ACTA1基因启动子区克隆、DNA甲基化与组织表达相关性分析

为了探究骨骼肌α肌动蛋白1(ACTA1)基因在肌肉和脂肪等6个组织中的甲基化状态及mRNA表达水平,以类乌齐牦牛、麦洼牦牛为研究对象,成功克隆了牦牛ACTA1基因启动子区序列,且采用重亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测ACTA1基因启动子区甲基化模式,并通过实时荧光定量PCR检测ACTA1基因在臀大肌、心脏、肾脏、肺脏、肝脏和脂肪组织中的mRNA表达水平。结果显示,牦牛ACTA1基因转录起始位点上游及第一外显子区部分序列总长为1 028 bp;BSP法分析发现肌肉组织DNA甲基化水平最低,脂肪组织甲基化率最高,其中,类乌齐牦牛臀大肌、心脏、肾脏、肺脏、肝脏和脂肪的甲基化概率分别为6.25%,6.88%,20.00%,16.25%,26.25%,29.38%,麦洼牦牛臀大肌、心脏、肾脏、肺脏、肝脏和脂肪的甲基化概率分别为5.00%,7.50%,18.13%,20.00%,26.25%,28.75%;ACTA1基因mRNA表达量在肾脏、肺脏、肝脏和脂肪均极显著低于臀大肌(P0.01),且显著低于心脏(P0.05),类乌齐牦牛和麦洼牦牛心脏mRNA表达量具有显著性差异(P0.05),类乌齐牦牛肺脏组织甲基化率显著低于麦洼牦牛(P0.05),其他各组织甲基化率和mRNA表达量差异均不显著(P0.05),各组织甲基化水平与ACTA1基因mRNA表达量呈极显著负相关(r=-0.797,P=0.002)。结果表明,ACTA1基因DNA甲基化模式对肌肉发育具有一定的调控作用,可为牦牛遗传育种表观遗传标记提供部分数据支持。     

褪黑素受体Mel1b在皖西白鹅不同组织中的分布与表达

褪黑素是动物体内一种重要的神经激素,其通过与褪黑素受体结合发挥多种生物学作用。旨在探究褪黑素受体Mel1b在皖西白鹅不同组织中的分布特点与表达水平。采集皖西白鹅的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、小脑、胰腺、胸肌、卵巢和分级卵泡,利用免疫组化和Real-time PCR技术检测各组织中Mel1b的分布特点及表达水平。结果表明：Mel1b在皖西白鹅的心、肝、脾、肺、肾、脑、胰腺、胸肌、卵巢及分级卵泡中广泛分布,且各组织间Mel1b基因和蛋白表达水平存在一定差异,卵巢中表达量最高,且随卵泡发育分级卵泡内表达量逐渐增加,其次是胰腺、脾、肾、肺,在脑、心、肝和胸肌中的表达量最少。可见,皖西白鹅各组织中均存在褪黑素受体Mel1b,且各组织间的表达量不同,结果为进一步探究褪黑素及其受体参与调控皖西白鹅机体内广泛的生物学作用奠定了理论基础。     

牦牛PIK3CB基因克隆及其在卵泡发育过程中的表达研究

旨在探讨磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基β(Phosphoinositide-3 kinase, PI3K,catalytic subunit beta, PIK3CB/P110β)基因序列特征,比较分析其在牦牛不同发育阶段卵泡中的表达规律。通过RT-PCR技术从牦牛卵巢组织中克隆获得PIK3CB基因序列并对其进行生物信息学分析;采用RT-qPCR方法检测PIK3CB基因在牦牛不同组织中的表达水平;将采集的牦牛卵泡根据直径大小分为大(≥7 mm)、中(3.0～6.9 mm)、小(≤2.9 mm)3组,分别收集各组卵泡中的壁颗粒细胞及卵母细胞提取总RNA,采用RT-qPCR方法检测PIK3CB mRNA在各级别卵泡壁颗粒细胞及卵母细胞中的相对表达量。结果显示:克隆获得牦牛PIK3CB基因CDS区长3 213 bp,共编码1 070个氨基酸。蛋白质分析显示,PIK3CB蛋白为亲水酸性蛋白,无跨膜结构无信号肽,二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲组成。PIK3CB核苷酸同源性及遗传进化树分析显示,牦牛与野牦牛和黄牛亲缘关系最近。PIK3CB基因在牦牛心脏、脾脏、肾脏、肌肉、肝脏、肺脏、子宫、胃、小肠、卵巢组织中均有表达,尤其在脾脏、子宫和卵巢组织中表达量显著高于其他组织(P0.05)。RT-qPCR结果显示,PIK3CB基因在卵泡发育过程中均有表达,其中在各级别卵泡壁颗粒细胞中,mRNA表达量随着卵泡发育进程呈现上升趋势,且大、中级别卵泡中的表达量极显著高于小卵泡组(P0.01);但是卵母细胞中mRNA表达量差异不显著(P0.05)。结果提示,mRNA基因参与了牦牛卵泡发育调控,是PI3K信号通路在调节颗粒细胞的功能中不可或缺的催化亚基之一,具体调控机制有待进一步研究。本研究为深入探讨PI3K-AKT信号通路在卵巢发育中的调控机理提供基础资料。     

九龙牦牛AQP7基因鉴定及在各组织中的表达和定位

为鉴定牦牛水通道蛋白7(AQP7)基因,分析其在不同组织中的表达水平及蛋白定位,采用RT-PCR方法克隆九龙牦牛AQP7基因,并进行生物信息学分析,采用RT-qPCR方法检测AQP7基因在九龙牦牛8种不同组织中的表达量,并用免疫组织化学染色方法对AQP7蛋白进行组织表达及定位分析。结果表明,九龙牦牛AQP7基因CDS区序列长度为993 bp,编码330个氨基酸,生物信息学分析发现,AQP7为稳定的疏水性蛋白。进化树结果显示,九龙牦牛AQP7基因与黄牛的亲缘关系最近,同源性为99.7%。AQP7基因在九龙牦牛心脏和肌肉表达量较高,极显著高于肾脏、肝脏、脾脏、肺脏、小肠和瘤胃(P0.01)。免疫组化结果显示,AQP7蛋白主要分布在九龙牦牛心脏和肌肉的肌细胞以及肾脏近曲小管中,且在心脏、肌肉和肾脏中的表达显著高于肝脏、脾脏、肺脏、小肠和瘤胃(P0.05)。结果为深入研究AQP7基因在牦牛低氧适应性中的生理功能和能量代谢机制提供了基础数据。     

类乌齐牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因克隆与组织表达分析

补体C1q(Complement 1q)蛋白由A、B、C 3条多肽链构成,在维护机体内环境稳定、氧化应激、糖脂代谢等过程发挥重要作用。为研究牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因的分子特性及在不同组织中的表达水平,探讨该基因对牦牛高原适应性的影响,通过克隆获得牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因的CDS区序列,分析其核苷酸序列相似性并构建系统进化树;利用在线软件进行功能预测分析;采用实时荧光定量PCR方法检测3个基因在牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中的相对表达量。结果显示:C1QA、C1QB、C1QC基因CDS区全长分别为735,744,732 bp,分别编码244,247,243个氨基酸;3个基因编码的蛋白质均为稳定的亲水性蛋白,主要由甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)组成,含有C1Q结构域和信号肽,不存在跨膜结构域,属胞外蛋白;蛋白氨基酸序列中分别存在18,21,15个潜在的磷酸化位点,三者二级结构主要由无规则卷曲构成,比例分别为61.85%,63.97%,66.67%。荧光定量结果显示,C1QA、C1QB基因在肺脏、脾脏中表达量较高,极显著高于心脏、肝脏、肾脏组织(P0.01),C1QC基因在肺脏的表达量极显著高于心脏、肝脏、脾脏、肾脏组织(P0.01)。试验结果为深入研究C1QA、C1QB、C1QC基因在牦牛高原适应中的生理功能和调控机制提供了基础数据。     

牦牛CTGF基因克隆、蛋白功能及组织表达分析

为获得牦牛CTGF基因的CDS区序列及其编码蛋白的结构和功能,并研究该基因在肾脏、心脏、肺脏、肝脏和臀肌等组织中的mRNA表达水平.以类乌齐牦牛为研究对象,采取RT-PCR方法获得类乌齐牦牛CTGF基因CDS序列,荧光定量PCR(qPCR)方法检测该基因在其5个组织中的mRNA表达水平.结果显示:牦牛CTGF基因含2个CpG岛,开放阅读框长度为1050 bp(登录号:MT968972),可编码349个氨基酸,CTGF编码蛋白存在信号肽,为水溶性不稳定的表面蛋白,共存在21个磷酸化位点和7个糖基化位点,在内质网和微体(过氧物酶体)中分布较多,有3个完整的保守功能结构域.荧光定量结果显示,CTGF基因在类乌齐牦牛肾脏、心脏、肺脏、肝脏和臀肌组织中均有表达,且在肝脏中表达水平最高.旨在为CTGF基因在调控牦牛肌肉生长发育方面提供参考数据.     

大蒲莲猪不同发育阶段组织RT-qPCR分析中适宜内参基因筛选

利用适宜数量且表达稳定的内参基因对目的基因的表达量进行标准化是获得准确、可靠RT-qPCR数据的重要条件。以不同日龄大蒲莲猪8种组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠组织、肌肉、血液)为试验材料,使用ge Norm、Norm Find软件对8个常用候选内参基因(ACTB、B2M、GAPDH、RPL4、SDHA、TBP、YWHAZ、PPIA)的表达稳定性进行分析,筛选适宜内参基因及其组合。ge Norm、Norm Find软件联合分析结果表明,不同日龄大蒲莲猪心脏中表达最稳定的内参基因为TBP、PPIA和YWHAZ,肝脏、肾脏、肠组织和肌肉中最稳定的内参基因均为TBP和PPIA,脾脏中表达最稳定内参基因为TBP和RPL4,肺脏中表达最稳定内参基因为TBP、RPL4、PPIA和ACTB,血液中表达最稳定内参基因为ACTB、YWHAZ和GAPDH。由于大蒲莲猪8种体组织中最适宜内参基因组合和数量不同,因此内参基因筛选是进行RT-qPCR数据分析的必要条件。结果可为研究大蒲莲猪目的基因表达时适宜内参基因的选择提供帮助。     

尼罗罗非鱼MyD88基因荧光定量PCR检测方法的建立

为了准确分析尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88,MyD88）在天然免疫反应中的作用,根据MyD88 EST序列（GenBank登录号：GR679416.1）和β-actin基因序列（GenBank登录号：AB037865.1）,分别在保守区域设计并合成引物。实验利用5倍系列稀释的尼罗罗非鱼肝脏cDNA样品构建标准曲线并进行融解曲线分析,建立尼罗罗非鱼MyD88的SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR检测方法。应用2?ΔΔCt分析方法初步检测了尼罗罗非鱼肝脏、脾脏、血液和肌肉等不同组织中的MyD88相对表达量。扩增结果表明MyD88和β-actin基因标准曲线CT值检测范围分别为24~35和19~30,扩增效率分别为100%和96.7%,相关系数分别为0.998和0.995;熔解曲线分析显示产物均形成单一特异峰,Tm值分别为78.5℃和77.5℃。定量分析结果显示,MyD88基因在参与机体免疫的相关组织肝脏、脾脏和血液中高丰度表达。     

苏钟猪FTO基因的mRNA表达、克隆测序及其生物信息学分析

脂肪肥胖相关基因(FTO)在控制食欲和能量消耗方面具有重要作用。为进一步了解猪FTO基因的结构和功能,以苏钟猪为试验对象,利用RT-PCR方法,分析该基因在苏钟猪5种不同组织(肺脏、肝脏、心脏、背膘和背最长肌)RNA水平的表达谱信息;对苏钟猪FTO基因的编码序列(CDS)进行了克隆测序,并用生物信息学方法分析了苏钟猪FTO蛋白的结构和不同物种间的同源性。结果表明,FTO基因在苏钟猪各组织中的mRNA表达丰度表现为:背膘>心脏>肺脏>肝脏>背最长肌,其中背膘中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。苏钟猪FTO的CDS区发现了8个SNPs,分别为G52A、C523T、G628A、A655G、A810G、A886G、G1002A和A1344G。苏钟猪FTO基因编码一个含505个氨基酸的蛋白,理论等电点为5.23,具有亲水性,不存在信号肽,是非分泌型蛋白,与牛、绵羊、狗等物种的亲缘关系最近。FTO的mRNA表达对苏钟猪的皮下脂肪、心脏、肌肉等组织的脂肪沉积有一定影响,其编码序列中丰富的SNPs可成为苏钟猪肉质改良育种中的重要分子标记。     

山羊PHKG1基因克隆及其表达特性分析

为获得山羊PHKG1基因序列,明确其生物学特征,阐明其在山羊各组织及诱导分化不同阶段皮下和肌内脂肪细胞中的表达特性,以简州大耳羊为试验动物,屠宰后采集心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、背最长肌、皮下脂肪等组织样品,提取组织中总RNA,利用RT-PCR方法克隆山羊PHKG1基因序列,利用各种在线工具分析其生物学特性,利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)技术检测其在各个组织及不同分化阶段的前体脂肪细胞中的表达水平。结果显示,克隆得到的山羊PHKG1基因序列1 233 bp,其中CDS区1 164 bp,共编码387个氨基酸,形成无信号肽的不稳定亲水酸性非跨膜蛋白,亚细胞定位显示其主要存在细胞质中;山羊PHKG1氨基酸序列与绵羊、牛、猪、马、人的相似性均在90%以上,说明该基因在不同物种中具有较高保守性;构建进化树显示,山羊和绵羊在同一分支,符合物种进化规律;组织表达谱显示,PHKG1基因在山羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、背最长肌、皮下脂肪中广泛表达,且在背最长肌中表达水平最高(P0.01),时序表达谱显示,PHKG1基因在成脂诱导分化60 h的肌内脂肪细胞和96 h的皮下脂肪细胞中的表达水平分别显著(P0.05)和极显著(P0.01)高于前体脂肪细胞中的表达水平。结果可为进一步研究PHKG1在山羊脂肪细胞分化过程中的作用奠定基础。     

lncRNA2099对猪前脂肪细胞增殖、分化标志基因的影响

为了探究lncRNA2099对猪前脂肪细胞增殖分化的影响,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测lncRNA2099在猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背肌和背脂及离体培养的前体脂肪细胞增殖和分化阶段的表达水平;利用核质分离技术确定lncRNA2099在脂肪细胞中的表达位置;构建真核表达载体pcDNA3.1-lncRNA2099,采用qRT-PCR技术检测在脂肪细胞内过表达该lncRNA后对脂肪细胞增殖、分化相关标志基因表达的影响。结果显示：lncRNA2099存在明显组织表达特异性,且在肾脏和背脂中高表达,在背肌中不表达;lncRNA2099在猪前脂肪细胞增殖阶段12 h表达量最高,随后逐渐降低。在分化阶段第2天表达量最高,随后逐渐降低。核质定位结果表明,lncRNA2099在细胞核与细胞质中均有表达;在脂肪细胞内过表达lncRNA2099后,增殖标志基因P21与成脂分化标志基因LPL表达量极显著升高。lncRNA2099可能作为转录调节因子抑制猪前脂肪细胞增殖、促进成脂分化。     

牦牛AQP8基因克隆及其在各组织和肝脏不同生长阶段中的表达分析

为鉴定牦牛水通道蛋白8(Aquaporin, AQP8)基因,并分析其在不同组织及不同生长阶段肝脏中的表达差异,探讨AQP8蛋白的表达分布差异。采用RT-PCR技术克隆牦牛AQP8基因的CDS序列并进行生物信息学分析,利用qRT-PCR技术检测AQP8在成年牦牛8种组织和不同年龄段肝脏中的表达水平,采用免疫组织化学方法分析AQP8蛋白在不同年龄肝脏中的分布和表达。结果表明,AQP8基因的开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸,系统进化树分析显示,麦洼牦牛与野牦牛的亲缘关系最近,蛋白具有AQPs特有的MIP稳定结构域。AQP8在成年牦牛肝脏中的mRNA相对表达量最高,且显著高于心脏、脾脏和肾脏等组织(P0.05),幼年时期(15月)肝脏中的AQP8表达量显著高于胎儿时期(1 d)和成年时期(5岁)(P0.05)。免疫组化结果表明,AQP8蛋白在幼年肝脏组织中的表达量最高(P0.05)。研究结果为深入探究牦牛AQP8在生长过程中作用机制提供基础依据,对高寒低氧环境中动物的适应性机制研究具有借鉴意义。     

合作猪HMOX1基因过表达载体构建及组织表达分析

为了构建合作猪HMOX1基因过表达载体,并分析其组织表达特征,本研究通过PCR扩增获取合作猪HMOX1基因完整CDS区序列,将其插入到pcDNA3.1(+)过表达载体中,构建pcDNA3.1-HMOX1过表达载体;并通过实时荧光定量PCR检测HMOX1基因在合作猪心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠和背最长肌中的表达情况。结果显示,成功扩增出合作猪HMOX1基因924 bp的完整CDS区,通过双酶切和测序鉴定,HMOX1基因成功连接到pcDNA3.1(+)过表达载体中。组织表达结果显示,HMOX1基因在合作猪组织中表达量最高是脾脏,显著高于其它组织(P<0.05),其次是肝脏、肺脏、肾脏和心脏,在十二指肠中的表达量最低。研究结果为进一步研究HMOX1基因在合作猪高海拔低氧适应过程中的功能提供了重要参考。     

牦牛HDAC2基因克隆及其在睾丸中的表达

旨在克隆牦牛HDAC2(Histone deacetylase 2)基因,预测分析HDAC2蛋白的结构和特性,并检测HDAC2的mRNA在牦牛不同组织以及不同发育阶段睾丸中的表达。将牦牛按年龄划分为幼年组(0.5～1岁)、成年组(4～5岁)及老年组(7～9岁),采集成年组牦牛肝脏、肾脏、肺、胃、脾脏、脑、心脏和卵巢组织以及3个时期的牦牛睾丸组织,利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆获得牦牛HDAC2的基因序列,使用生物信息学的方法预测该基因的序列同源性以及其编码蛋白质的氨基酸序列和结构;通过实时荧光定量PCR检测HDAC2的mRNA在牦牛不同组织中的表达,通过RT-PCR检测HDAC2的mRNA在牦牛不同发育阶段睾丸中的表达,利用色素原位杂交技术检测HDAC2 mRNA在成年牦牛睾丸中的定位。结果表明,HDAC2基因的开放阅读框包含1 467个碱基,编码488个氨基酸,其基因序列在哺乳动物中高度保守。结构预测表明,HDAC2是一个脂溶性疏水蛋白,具有一个组蛋白去乙酰化酶结构域。该基因的mRNA在卵巢和睾丸中的表达较高。HDAC2的mRNA在幼年期牦牛睾丸中的表达显著高于其他时期,在牦牛睾丸中HDAC2的mRNA定位在除精细胞之外的各类细胞中。克隆得到牦牛HDAC2基因序列并明确了该基因在睾丸中的时序表达模式,对于深入探讨HDAC2在牦牛睾丸发育及精子发生中发挥的作用提供了一定的试验数据。     

淡水黑鲷5种同工酶的组织特异性研究

运用聚丙烯酰胺垂直梯度凝胶电泳法对淡水黑鲷(Hephaestus fuliginosus)6种组织（肝脏、心脏、脾脏、肾脏、肌肉和眼）的5种同工酶（酯酶（EST）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、苹果酸脱氢酶（MDH）、乳酸脱氢酶（LDH））进行了研究,并对其同工酶位点及酶谱进行了分析。结果表明,淡水黑鲷5种同工酶系统具有不同程度的组织特异性。EST检测到2个位点,每个位点都有2个等位基因。CAT检测到1个基因位点,存在2个等位基因。POD酶谱较复杂,有5个位点,Pod-2,3,4,5都检测到2个等位基因。MDH具有s-MDH和m-MDH两种类型,在各组织中均表达,s-MDH只形成一种二聚体,m-MDH仅在肝脏中有2条带,其余组织中为1条带。LDH在6种组织中都表达, Ldh-5只在心脏中能检测到。     

牦牛DDIT3基因克隆及组织表达特性分析

旨在探究DNA损伤诱导转录本3(DDIT3)基因序列特征及其在母牦牛组织表达特性。以母牦牛为研究对象,利用RT-PCR技术克隆牦牛DDIT3基因,利用生物信息学软件分析DDIT3蛋白的结构和功能,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测DDIT3基因在牦牛不同组织及不同生理阶段的生殖器官和卵母细胞中的表达特征。结果显示:牦牛DDIT3基因CDS区全长507 bp,共编码168个氨基酸;核苷酸序列比对发现,牦牛与野牛同源性最高,为99.71%,与其他物种的同源性均在88%以上,说明DDIT3基因在进化过程中表现出高度保守性;牦牛DDIT3基因在卵巢中的表达量极显著高于心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺、子宫和输卵管(P0.01);在卵巢中,妊娠期DDIT3基因的表达水平显著高于卵泡期、黄体期和胎儿期(P0.05),黄体期的表达量显著高于胎牛期(P0.05);在子宫中,妊娠期DDIT3基因的表达水平显著高于卵泡期和胎牛期(P0.05);DDIT3在各时期输卵管中表达水平差异不显著;MⅡ期卵母细胞中DDIT3基因的表达水平显著高于GV期和MⅠ期(P0.05),MⅡ颗粒细胞DDIT3基因的表达量也显著高于GV期和MⅠ期(P0.05),GV期、MⅠ期的卵母细胞和颗粒细胞DDIT3表达量差异不显著。综上,牦牛DDIT3基因可能在维持母牦牛卵巢机能与妊娠以及卵泡发育与成熟过程中发挥重要的调控作用。     

牦牛肌钙蛋白Ⅰ基因家族的克隆及组织表达分析

为了克隆TNNI基因家族,预测其蛋白结构和功能,并分析其在牦牛不同组织中的表达差异,以0.5岁健康的类乌齐牦牛为试验材料,采用RT-PCR技术克隆牦牛肌钙蛋白Ⅰ基因家族的CDS区序列并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR技术检测TNNI基因家族各成员的mRNA表达水平。结果表明,TNNI1、TNNI2和TNNI3基因CDS区大小分别为564,549,639 bp,分别编码187,182,212个氨基酸残基。预测分析结果显示:TNNI基因家族编码的蛋白质均为偏碱性蛋白,蛋白结构不稳定,均无跨膜结构域,无信号肽,属非分泌型蛋白;二、三级结构均以α-螺旋为主,均含有肌蛋白超家族保守结构域。系统进化树分析表明:类乌齐牦牛TNNI1基因与水牛的亲缘关系最近,其次是绵羊、黄牛,与小鼠亲缘关系最远;TNNI2和TNNI3均与黄牛、水牛的亲缘关系较近,与其他亲缘关系较远。实时荧光定量PCR结果显示,TNNI1和TNNI2基因在臀肌中的相对表达量最高,且TNNI1基因在心脏、肝脏和肺脏中的表达量显著高于TNNI2基因(P0.05),TNNI3基因在心脏中表达量较高,而在肺脏、臀肌和肝脏中表达量低。     

牛GDF-9基因的克隆与组织表达的分析

为了检测牛GDF-9基因mRNA在怀孕期牛生殖系统的表达情况,为GDF-9基因在雌性动物繁殖上的研究提供一定的理论依据。本试验根据GenBank中报道的牛GDF-9基因序列设计引物,从牛卵巢、输卵管、子宫、肾脏中提取RNA,采用RT-PCR技术进行cDNA扩增,扩增产物与载体pGM-T连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,测序。结果表明,已成功克隆的阳性重组子经测序鉴定其片段大小与预期大小完全一致,为264 bp。序列同源性分析比较表明,该cDNA及其推导的氨基酸序列与绵羊GDF-9cDNA和氨基酸序列同源性分别为97%和94%。以-βactin为内参照物,采用RT-PCR技术进行半定量分析,通过检测比较牛GDF-9基因在卵巢、输卵管、子宫、肾脏组织中mRNA的表达情况。结果表明,牛GDF-9基因在卵巢中表达量最高,在输卵管、子宫、肾脏中均有表达,但表达量不高。     

黄尾鲴6种同工酶的组织特异性研究

为了给黄尾鯝种质标准和种质鉴定提供生化遗传指标,以便合理保护和利用黄尾鯝种质资源。采用聚丙烯酰胺垂直凝胶电泳法对黄尾鲴的7种新鲜组织（肝脏、心脏、脑、肌肉、脾脏、头肾和鳃）中的苹果酸脱氢酶(MDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、酯酶(EST)、苹果酸酶(ME)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6-PGDH)、超氧化物岐化酶(SOD)共6种同工酶进行了分析,并对其同工酶位点及酶谱进行了分析。结果表明,黄尾鯝的6种同工酶在不同组织中的表达存在差异。酯酶、苹果酸酶、苹果酸脱氢酶及6-磷酸葡萄糖脱氢酶在肝脏中表达活性较强,乳酸脱氢酶在肝、脾以及头肾组织中表达活性强,超氧化物歧化酶在肝、脾脏组织中活性较强。     

miR-26a和miR-30d在牛不同组织中表达规律分析

摘要：目的：检测miR-26a和miR-30d在牛不同组织中的相对表达水平,并应用生物信息学方法分析其靶基因,探讨两者在牛不同组织中可能发挥的作用。方法：以西门塔尔牛为研究对象,利用TRIzol一步法提取牛各组织总RNA后,根据miRBase提供的bta-miR-26a和bta-miR-30d成熟序列,设计特异性的反转录茎环引物以及荧光定量PCR引物,反转录获得cDNA后进行荧光定量PCR检测其在牛不同组织中的相对表达水平,并应用Targetscan、RNA22、miRDB等生物学软件预测其可能存在的靶基因。结论：miRNA-26a和miR-30d在牛心脏、肝脏等组织中均有不同程度的表达,miR-26a在心脏中表达量最高,其次在脾脏,在睾丸中的表达量最低。miR-30d在肾脏中表达量最高,其次在心脏,在睾丸中表达量最低。通过生物信息学方法分析miRNAs的靶基因,推测miR-26a和miR-30d可能参与调控机体的免疫、繁殖等活动。