黄瓜棒孢叶斑病菌的分子鉴定及rDNA-ITS序列分析

为了分析不同地区黄瓜棒孢叶斑病菌的种内分化,能够准确地鉴定该病菌,以服务于黄瓜抗病育种,对2007-2014年采集的黄瓜棒孢叶斑病菌多主棒孢经单孢纯化获得34个菌株。利用公开发表的特异性引物CCF/CCR对其进行了PCR分子鉴定,结果表明:34个菌株均扩增得到了预期272 bp的特异片段,说明均为多主棒孢菌。应用真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1和ITS4分别扩增各个菌株的r DNA内转录间隔区序列,经测序并比对分析,34个菌株均扩增得到了559 bp的特异片段,其中32个从黄瓜上分离的多主棒孢病菌菌株碱基序列完全一致,2个从番茄上分离的菌株碱基序列完全一致,二者的差异在于2个SNP位点T-C、G-A的突变,二者相似度为99.64%。说明,多主棒孢菌属种间的ITS区序列高度保守,利用ITS序列分析方法可以为多主棒孢菌的分类鉴定及系统发育研究提供依据,可以区分出黄瓜和番茄寄主上的多主棒孢菌。     

河北青县黄瓜棒孢叶斑病病原菌种群分化的研究

本研究对15株河北青县黄瓜棒孢叶斑病病原菌多主棒孢菌Corynespora cassiicola的形态学特征、分子类群及在不同寄主上致病力分化的相互关系进行综合研究.由16对ISSR随机引物对15株供试菌株进行ISSR标记分析,得到92个多态性位点,所有菌株划分为2个分子类群,遗传相似性系数为0.82.结合形态特征的比...     

冬瓜枯萎病菌核糖体rDNA ITS区的克隆与序列分析

采用镰刀菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物,PCR扩增冬瓜枯萎病菌核糖体基因ITS区,并对产物进行克隆和序列分析;利用Mega 4.1软件对序列及GeneBank中以葫芦科为寄主的镰刀菌不同专化型ITS序列进行聚类。冬瓜枯萎病菌ITS全长1 063 bp,其中包括18S rDNA一部分序列,5.8S rDNA,ITS1和ITS2全部序列及28S rD-NA部分序列。聚类结果将15个菌株ITS序列划分为2个类群,类群I包括4个菌株,分别为2个西瓜枯萎病菌株和2个甜瓜枯萎病菌株;类群II包括11个菌株,其中冬瓜枯萎病菌株就在该类群中,其余为甜瓜枯萎病菌株5个、西瓜枯萎病菌株3个、黄瓜枯萎病菌株、丝瓜枯萎病菌株和葫芦枯萎病菌株各1个。     

黄瓜棒孢叶斑病菌基因组ISSR分子指纹分析

多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)是危害黄瓜、番茄、橡胶等作物的重要病原真菌。研究不同地区、相同或不同寄主棒孢菌的遗传多样性,对了解多主棒孢菌的遗传分化和病害防治具有重要意义。本研究从天津、山西、河南、河北、山东、辽宁等黄瓜主产区共采集、分离纯化得到32个黄瓜多主棒孢菌菌株,对其生物学培养特征以及ISSR遗传变异进行了分析。菌株培养特征表明,在供试32个菌株中,Ⅰ型菌株有24个(5-28号),占75%,其菌落黑褐色,边缘浅绿,菌丝生长旺盛,PDA培养基上产孢量较少;Ⅱ型菌株4个(1-4号),占12.5%,菌落黑色,粉末状,PDA培养基上可大量产孢;Ⅲ型菌株4个(29-32号),占12.5%,菌落浅灰色或灰白色,菌丝疏松,基物浅粉色,PDA培养基上产孢量极少。其中Ⅰ型菌株占75%,为病菌优势小种。对该32个菌株和2个番茄寄主分离的多主棒孢菌株多样性进行了ISSR指纹分析,23条ISSR引物共扩增获得204个位点,其中194个为多态位点,占95.10%。32个黄瓜寄主的菌株间遗传变异较大,两两间的遗传相似系数在0.627 5~0.995 1之间。UPGMA聚类分析表明,在遗传相似系数为0.65时,将34个菌株分为4个组,每组包含的菌株数分别为26、5、1、2。聚类分析结果显示,来源于黄瓜和番茄寄主上的菌株遗传分化较大,在相似系数为0.31时可以明显分为两簇。从多态性分析及聚类结果看,病菌分化与地理来源无明显的相关性,但与寄主来源可能存在相关性。该研究充分说明黄瓜棒孢叶斑病菌基因组在SSR区域具有丰富的遗传多态性,为黄瓜棒孢叶斑病抗病育种以及综合防治提供了重要的理论参考,并可以为多主棒孢菌的分类鉴定及系统发育研究提供依据。     

中国部分棉区棉花轮纹斑病病原菌“种”的初步鉴定

从中国棉花主产区部分地区采集棉轮纹斑病叶,分离获得17个致病链格孢(Alternaria spp.)菌株。根据链格孢菌菌体和孢子形态学观察结果,结合ITS序列测定和分析结果,明确A1等16个菌株为链格孢菌(Alternaria alternata),A3菌株为大孢链格孢菌(Alternaria macrospore)。     

黑龙江省马铃薯早疫病菌遗传多样性分析

为了解黑龙江省侵染马铃薯的早疫病菌菌株的遗传特性,利用RAPD和ISSR分子标记对来自黑龙江省马铃薯主产区不同地点的67株早疫病菌的遗传多样性进行分析,结果表明,用5条RAPD引物共扩增出53个条带,多态性位点占75.4%;用10条ISSR引物共扩增出93个条带,多态性位点占88.2%。聚类分析结果显示,RAPD和ISSR分子标记均可将供试早疫病菌株划分为不同的组,说明早疫病菌具有明显的遗传分化现象,但菌株聚类组群的划分与地理来源关系不大。研究结果可为黑龙江省马铃薯抗病育种和早疫病防治提供理论依据。     

链格孢属真菌的分子复核鉴定及系统发育研究

为了验证中国林业微生物保藏管理中心库藏链格孢属(Alternaria Nees)菌种资源分类地位的准确性,探索一种链格孢属真菌的快速复核鉴定方法,本研究采用ITS序列分析、NCBI blast以及系统发育分析等方法,对中国林业微生物保藏管理中心库藏链格孢属的36个种及未定种的375个菌株进行分子复核鉴定以及系统发育关系研究。结果表明：本研究的375个菌株中,有21个菌株的分类地位不准确,其中有9株菌的ITS序列与链格孢属菌种的同源性在92%~96%之间,另外12株菌的ITS序列与链格孢属菌种的同源性在60%~85%之间。基于ITS序列构建的NJ树显示,29个小孢子种的37个生物型形成了一个稳定的分支,而6个大孢子种与外群Ulocladium sp.聚在一个分支。本研究中,ITS序列分析可以用来区分和鉴定形态差别明显的大孢子种,但无法区分亲缘关系较近的29个小孢子种。     

含羞草、山蚂蟥等几种豆科植物根瘤菌的数值分类及16S rDNA PCR-RFLP分析

为揭示云南省豆科植物根瘤菌的资源多样性,采用数值分类、16S rDNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析技术对云南省8个地区含羞草、山蚂蝗等几种不同豆科植物分离的48株根瘤菌菌株进行了遗传和表型多样性研究。16S rDNA PCR产物经HinfⅠ、MspⅠ、RsaⅠ和HaeⅢ4种内切酶消化后产生22种遗传图谱类型;数据经MVSP3.0软件聚类后,所有供试菌株在70%的相似性水平上分为4个分支,经16S rDNA全序列分析,确定分支Ⅰ为伯克霍尔德属(Burkholderia)类群,含1株菌株;分支Ⅱ为贪铜菌属(Cupriavidus)类群,含5株菌株;分支Ⅳ为根瘤菌属(Rhizobium)类群,包括29株菌株;而分支Ⅲ没有和参比菌株聚在一起,经测序为狭长平胞属(Stenotrophomonas)类群。通过对菌株的抗生素抗性、耐盐性、生长温度范围、BTB产酸产碱反应以及对3-酮基乳糖利用情况共计28个表型性状测定,结果显示所有菌株耐盐性较强,多数菌株可耐受60℃的高温。实验表明,分离自云南省的这些菌株具有丰富的遗传和表型多样性。     

基于稻瘟菌毒性相关基因的指纹类型与致病型关系分析

本研究根据8对稻瘟菌毒性相关基因序列同源性设计其特异性引物,通过PCR扩增分析单孢分离培养的不同地理来源的44个菌株,获得其指纹。利用18个丽江新团黑谷（LTH）单基因鉴别寄主对其中的31个菌株进行致病型鉴定;用SPSS11．5聚类分析,根据31个菌株在18个LTH NILs上的抗感反应,在Lable No．10的位置,将菌株分为7种致病类型。将上述的两种不同的聚类结果进行相关性分析,发现通过毒性相关基因的特异性引物划分出的指纹类型与用菌株在LTH NILs的抗感反应划分出的致病型之间不存在——对应关系。     

8份剑麻种质亲缘关系的ISSR和RAPD分析

为了揭示剑麻栽培品种的遗传多样性,利用ISSR和RAPD分子标记技术对8份剑麻种质的亲缘关系进行分析。结果表明,筛选后选用的8条ISSR引物和8条RAPD引物,分别产生了53条和66条扩增条带,其中多态性条带分别为44条和61条,多态性条带百分率分别为83.02%和92.42%。根据2种标记的扩增结果,用UPGMA法对8份剑麻种质进行聚类分析,供试材料之间具有较高的遗传多样性,其品种间遗传相似系数分别为0.59~0.80和0.52~0.76。2个标记的聚类结果基本一致,但有点差异,可将供试的8份剑麻种质划分为2类群,而且2个标记聚类结果呈显著相关性,相关系数为0.70。可见,剑麻种质资源的遗传多样性丰富。     

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）对苯醚甲环唑的敏感性及其对不同杀菌剂的交互抗药性

采用菌丝生长速率法测定了山东省和河北省不同地区的157株灰葡萄孢对苯醚甲环唑的敏感性,结果表明,其中86株野生菌株对苯醚甲环唑的敏感性（EC50值）在0.0135～1.2832μg/mL之间,相差95.05倍,平均值为（0.3958±0.3485）μg/mL,可作为敏感基线。田间已出现对苯醚甲环唑的低抗菌株,占检测总株数的9.5%,未检测到中抗菌株和高抗菌株。通过测定灰葡萄孢不同菌株对苯醚甲环唑、嘧霉胺、腐霉利、多菌灵、乙霉威和异菌脲的敏感性,发现苯醚甲环唑与嘧霉胺、腐霉利、多菌灵、乙霉威和异菌脲之间不存在交互抗性关系。     

酥梨采后灰霉病生防菌株的鉴定及抑菌作用

以微生物拮抗病原菌是防治病害安全高效的可行手段。通过对果实表面微生物进行筛选鉴定,以期得到一株可以有效抑制灰霉病的生物防治菌株。对拮抗菌株H-1进行形态学特征、生理生化特性分析,结合16S rDNA序列分析和gyrB 基因序列分析构建系统发育树;采用平板对峙法结合果实伤口试验考察拮抗菌H-1在体外及梨果表面的抑菌作用。结果表明：经鉴定H-I菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）;B. velezensis H-1在体外条件下可显著抑制灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）、细极链格孢（Alternaria tenuissima）和串珠镰孢菌（Fusarium verticillioides）的菌丝生长,其中对灰葡萄孢霉菌丝的抑制作用最强;果实伤口试验表明,1×1011 CFU/mL的B. velezensis H-1可完全抑制梨果表面灰霉菌生长。由此可见,B. velezensis H-1可以有效抑制梨果采后灰霉病的发生。     

中国局部地区草坪立枯丝核菌的rDNA ITS序列分析

为了鉴定草坪褐斑立枯丝核病菌的融合群类型并探讨其系统发育关系,本研究对11株分离自草坪草和4株分离自土壤的立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）进行了rDNA-ITS测序,结合GenBank中登录的立枯丝核菌14融合群或亚群的代表性菌株及禾谷丝核菌（R. cerealis）、玉蜀黍丝核菌（R. zeae）和水稻丝核菌（R. oryzae）3个近缘种,共45条ITS序列进行了分析,利用MEGA 4.1软件建立ITS聚类分析树状图。结果表明,立枯丝核菌各融合群代表菌株及所有供试菌株聚为一组;该组又可细分为14个遗传聚亚类,隶属同一融合群的代表菌株聚在同一亚组,供试15株立枯丝核菌归入AG2-2和AG1-IA两个融合群。这些结果为该病害的科学防控提供了可靠依据,并进一步验证了ITS序列分析法是区分立枯丝核菌不同融合群或亚融合群菌株的有力工具。     

内生细菌TY-6对樱桃采后灰霉病菌的抑菌效果和定殖特性研究

为明确内生细菌对樱桃采后灰霉病菌的抑菌活性和定殖特性,本研究采用研磨法对樱桃果实内生细菌进行分离,并采用平板对峙法、针刺接种法、利福平抗性标记法和分子生物学手段对其离体抑菌活性、活体伤口定殖特性和系统发育树进行研究。结果表明,樱桃内生细菌TY-6对灰霉病菌具有良好抑菌活性,离体和活体抑菌效果分别为89.08%和79.18%,且在20℃和0℃下均可在樱桃果实伤口处稳定定殖,形成保护,稳定定殖后伤口处菌株数量分别为2.22×105CFU/g和1.15×105CFU/g;拮抗细菌TY-6经16S rRNA序列鉴定为Bacillus tequilensis。因此,拮抗细菌TY-6对樱桃采后灰霉病的防治具有良好的效果,可为樱桃采后病害微生物防治提供参考依据。     

黄瓜疫霉菌ITS及β-tubulin的扩增和序列分析

为研究不同来源地黄瓜疫霉菌的系统发育关系以及遗传多样性,从湖南省内5个黄瓜种植区采集具有典型症状的黄瓜疫病病株分离纯化,利用形态学方法观察孢子囊形态。再运用PCR技术分别进行ITS以及β-tubulin扩增测序并与Genbank的中相关序列构建系统发育树。经形态学初步鉴定22株黄瓜疫霉菌株,ITS-PCR序列长度约为780 bp,β-tubulin-PCR序列长度约为800 bp,所有测得序列与下载自Genbank的相关序列存在不同程度的相似性。ITS序列的系统发育分析,用于构建系统发育树的序列分为2个大的聚类I和II,黄瓜疫霉菌均位于I组内,由于来源地差异,不同地区的黄瓜疫霉菌又被聚在不同小类;β-tubulin序列在系统发育分析中被分为4个聚类,22个P. melonis序列与下载的P. melonis序列均在聚类组I中。聚类分析结果表明：疫霉属种群间具有明显的亲缘关系,不同地域的黄瓜疫霉菌遗传多样性表现出差异,但总体趋势是相同来源地的菌株亲缘性比较接近。     

腐烂葡萄中微生物多样性及真菌毒素测定分析

以天津、北京、杭州等10个地区的葡萄园以及市场中的75份腐烂葡萄为研究对象,应用分子生物学手段进行葡萄表面微生物（细菌和真菌）多样性的核酸测序（包括16S区域扩增子和ITS区域扩增子）分析;同时基于次级代谢产物,使用高效液相色谱（HPLC）法对葡萄样本进行了21种真菌毒素的测定分析,以初步摸清主要风险危害,锁定风险菌株。结果表明,对表面微生物的核酸测序共获得细菌16S有效OTU信息732个和真菌ITS有效OTU信息4 336个,构建了葡萄表面菌相分子数据库,其中包括367种细菌和256种真菌,其主要病原菌为青霉、黑曲、链格孢菌、杂色曲霉、灰葡萄孢、炭疽和盾壳霉;通过真菌毒素测定分析,共检测出4种真菌毒素,分别为交链孢毒素AOH、交链孢毒素AME、交链孢毒素TeA和交链孢毒素TEN。     

栽培稻种内核糖体基因的ITS序列比较研究

以普通野生稻(O. rufipogon)为外类群,对栽培稻(O. sativa)籼亚种(O. sativa ssp. indica)和粳亚种(O. sativa ssp. japonica)18个材料的核糖体基因(rDNA)内转录间隔区（internal transcribed spacers, ITS）全序列进行比较分析。供试材料中有籼亚种品种(系)9个,粳亚种品种(系)6个,爪哇稻2个和陆稻1个。结果发现,栽培稻种内总变异位点23个,占总碱基数的5.41%;8个信息位点,占总碱基数的1.82%。籼亚种ITS全序列的长度为425~430 bp,G+C含量为74.25%~75.59%;粳亚种ITS序列总长度为425 bp,G+C含量为74.25%~75.59%。以ITS全序列构建的系统树能将栽培稻区分为籼、粳2个亚种群,爪哇稻与籼稻有较近的亲缘关系,这对研究栽培稻的演化有一定的指导意义。     

拟南芥抗灰霉病基因T1N6_22互作蛋白的筛选与分析

前期研究中从拟南芥突变体库中筛选获得一株对灰霉病菌侵染表现为感病的突变体。利用TAIL-PCR等技术克隆获得拟南芥抗灰霉病基因T1N6_22。为了进一步明确T1N6_22在拟南芥抗灰霉病过程中的调控机制,利用酵母双杂交技术(Y2H),以构建成功的p AS1/T1N6_22蛋白为诱饵,筛选拟南芥的cDNA文库。通过酵母双杂交筛选,共获得28个酵母克隆。利用T1N6_2基因特异性引物鉴定酵母阳性克隆,并进行测序。共获得了4个可能与T1N6_22互作的蛋白AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400。Blast分析发现,AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400分别为核小体装配蛋白、功能未知蛋白、假定的泛酸还原酶和硫胺二磷酸盐结合折叠超家族蛋白,分别参与到核糖体装配、泛酸盐合成、植物代谢等过程中。研究结果为确定T1N6_22蛋白的互作蛋白,阐明其调控拟南芥抗灰霉病的分子机制奠定了基础。     

α-茄碱对灰葡萄孢菌的体外抑菌活性研究

从马铃薯皮中提取分离出α-茄碱．通过牛津杯法研究α-茄碱对灰葡萄孢菌的体外抑菌活性,并采用平板涂布法测定其最低抑茵浓度（MIC）．结果表明,α-茄碱对灰葡萄孢菌具有较好的抑菌效果,且抑制强度呈剂量依赖性,当α-茄碱浓度为50μmol／L时．对灰葡萄孢菌表现出高度敏感性：α-茄碱对灰葡萄孢菌的最低抑菌浓度为15％。以灰葡萄孢菌为指示菌研究其稳定性．表明α-茄碱在中性（pH=7）条件下对灰葡萄孢菌的抑菌效力最强。当加热温度低于80℃时,α-茄碱的抑菌活性比较稳定,而当温度升高到121℃时．随着加热时间的增加．抑菌效果减弱。     

灰葡萄孢BcKMO基因的原核表达分析

为构建灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶(Bc KMO)基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的Bc KMO蛋白。以灰葡萄孢野生型BC22为试材,通过反转录PCR扩增Bc KMO基因,回收Bc KMO基因片段克隆到p MD19-T载体中,测序正确后,酶切p MD19-T-Bc KMO和带有GST标签蛋白的p GEX4T-1质粒,将目的片段进行连接,构建Bc KMO基因的原核表达载体p GEX4T-1-Bc KMO-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的原核载体转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与GST标签蛋白融合的Bc KMO蛋白,大小约71 k Da。SDS-PAGE分析表明,该蛋白在0.2 mmol/L IPTG诱导12 h时高效表达;Western Blot结果发现目的蛋白能与GST特异性抗体起特异性反应,表明Bc KMO基因的体外诱导表达成功。