Nit突变体技术在玉米弯孢菌研究中的应用

采集了河南省12个地区的玉米弯孢菌叶斑病标样,分离获得了34个菌株,其中3个是画眉草弯孢(Curvu-laria eragrostidis),其余均为新月弯孢(C.lunata)。利用含KClO₃的培养基对其中14个新月弯孢菌株和1个画眉草弯孢菌株(XZ3c)进行诱导,在MM培养基上鉴定均获得了Nit突变体。对获得的190个Nit突变体在MO₂和MH培养基上进行了生理表型的划分,并用于菌株内、菌株间的营养体亲和性研究,发现有不少配对组合中均出现了明显的亲和现象,表明Nit突变体技术可以用于玉米弯孢病菌营养体亲和性的研究。根据亲和性测定的结果将这15个菌株初步分为2个营养体亲和群。     

尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)硝酸盐营养突变株及其营养体亲和性

 从荸荠、棉花、西瓜、黄瓜、胡瓜、大豆、花生等12种寄主作物上获得尖孢镰孢(F-usarium oxysporum)菌株20个,已知15个菌株分属于6个专化型。所有20个菌株在含有氯酸盐的培养基上产生抗氯酸盐的突变体,其突变体在以硝酸盐作为氮源的培养基上表现为无气生菌丝生长,即不能利用硝酸盐的突变株(nit),共获得nit突变株181个。同一专化型的nit突变株之间在以硝酸盐为氮源的培养基上配对时,在菌丝接触处可产生互补作用,即营养体亲和性,表现为旺盛气生菌丝生长。不同专化型的nit突变株之间则不能互补产生异核体而表现为非亲和性仍为突变型生长。每个菌株均获得能产生互补作用的nit突变株。根据营养体亲和性反应,20个菌株归入13个营养体亲和群(VCG),并显示出VCGs与菌株专化型之间的相关性。nit突变株在一般条件下是稳定的,而且某些nit株的亲和能力特强。     

尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)硝酸盐营养突变株及其营养体亲和性

从荸荠、棉花、西瓜、黄瓜、胡瓜、大豆、花生等12种寄主作物上获得尖孢镰孢(F—usarium oxysporum)菌株20个,已知15个菌株分属于6个专化型。所有20个菌株在含有氯酸盐的培养基上产生抗氯酸盐的突变体,其突变体在以硝酸盐作为氮源的培养基上表现为无气生菌丝生长,即不能利用硝酸盐的突变株(nit),共获得nit突变株181个。同一专化型的nit突变株之间在以硝酸盐为氮源的培养基上配对时,在菌丝接触处可产生互补作用,即营养体亲和性,表现为旺盛气生菌丝生长。不同专化型的nit突变株之间则不能互补产生异核体而表现为非亲和性仍为突变型生长。每个菌株均获得能产生互补作用的nit突变株。根据营养体亲和性反应,20个菌株归入13个营养体亲和群(VCG),并显示出VCGs与菌株专化型之间的相关性。nit突变株在一般条件下是稳定的,而且某些nit株的亲和能力特强。     

影响水稻纹枯病菌营养体亲和性分化的因子

 为了探明影响水稻纹枯病菌营养体亲和性分化的因子,将水稻纹枯病菌菌株cx-2在不同水稻品种继代接种,并在含不同杀菌剂、具不同pH及不同温度条件的PDA平板上继代培养,用对峙法测定继代菌株与原始接种菌株的营养体亲和性。此外,对营养体亲和性分化菌株与原始菌株的AFLP指纹图谱进行比较。结果显示,在供试的30个水稻品种上连续接种4次后,从9个水稻品种中分离出与原始菌株营养体不亲和的菌株。菌株在不同pH值的PDA平板继代培养4次后,在pH偏碱性端(pH 10、pH 11)开始出现营养体亲和性分化的菌株。在不同农药和温度条件下继代培养10次的菌株中没有分离到营养体亲和性分化的菌株。营养体亲和性分化菌株与原始菌株的AFLP指纹图谱没有差异。     

稻瘟病菌营养体亲和配对筛选及其亲和能力遗传

 在白米玫瑰红培养基上对江苏省的稻瘟病菌Magnaporthe grisea(Hebert) Barr.不同小种间营养体亲和菌株配对组合进行了筛选。当不同小种的菌株对峙接种,在21±1℃、黑暗中培养18 d后,部分配对组合的菌落交界处出现一条肉眼明显可见的菌丝融合带,且具有稳定的重复性。出现菌丝融合带的配对菌株在玻璃纸上对峙微培养2~3 d后,镜检观察到菌丝融合现象普遍存在;未出现明显菌丝融合带的菌株组合经对峙微培养,菌丝融合现象未见或较少。从ZA₄₉、ZG₁、ZF₁和ZD₁ 4个小种的12个菌株中筛选出3对营养体亲和性强的小种间菌株配对组合。以所选菌株为亲本建立单分生孢子无性系,测定营养体亲和能力在单孢后代的遗传。结果是,营养体亲和能力在单孢后代遗传不稳定,与另一亲本的单孢株配对产生融合带的百分率为53%~74%之间。进一步研究发现,来自同一个分生孢子不同细胞的单芽管株与配对菌株的营养体亲和能力相同;亲和能力在单芽管株的单孢株后代继续发生分离。     

新月弯孢菌营养体亲和群鉴定方法探讨

 采用菌株直接配对、显微镜观察菌丝融合和硝酸盐缺陷型(nit)突变体互补测试法,对44个来自不同地区的玉米弯孢菌叶斑病叶中的新月弯孢菌(Curvularia lunata)菌株进行了营养体亲和性分析。在野生型菌株的两两配对中,C.lunata菌株接触产生4种反应类型,但无明显的抗衡反应产生。在菌丝融合显微观察中,光学显微镜下只见大多数菌丝反应为一菌丝向另一菌丝无限靠近,未见融合,但在电子显微镜下,发现两菌丝细胞已不再是独立的。这些结果表明,因两菌落间的抗衡反应和菌丝融合特征都不明显,故不宜采用直接配对和显微观察来划分C.lunata的营养体亲和群。在nit突变体互补测试中,菌株在KClO₃浓度1.5%~3.0%的KPS中诱导表明,2.0%~3.0% KClO₃适宜于大多数菌株。抗氯酸盐突变体在Czapek培养基中能鉴定出nit突变体,但在MM上却不能。全部3640抗氯酸盐突变体在Czapek中共鉴定出2 40个稳定的nit突变体,其中nit1占59.2%,nit3占39.2%,NitM占0.8%,nit D (3种氮源都不能利用)占0.8%。44个菌株中,24个(55%)获得了nit突变体,20个(45%)还没有,仅2个菌株(124和155)各获得了1个NitM突变体。各菌株突变体类型间只有NitM与nit1或nit3是异核亲和的,其余均不能产生亲和反应。菌株124和155都是营养体自身亲和菌株。用2个NitM作测试菌株,初步划分出2个VCGs,5个归入VCG1,另有5个归入VCG2,其它菌株因未获得NitM或nit突变体还不能鉴定。以上结果表明,硝酸盐缺陷型突变体互补测试法可用于鉴定C.lunata菌株的营养体亲和群。     

尖孢镰刀菌及芬芳镰刀菌遗传多样性的ISSR分析

 为了明确镰刀菌属(Fusarium)美丽组（Section Elegans）中尖孢镰刀菌(F. oxysporum)和芬芳镰刀菌（F. redolens）2种菌的遗传差异性和亲缘关系,利用ISSR分子标记技术对这2种菌的35个菌株进行了遗传多样性分析。结果表明,用筛选的15条引物对35个供试菌株共扩增出231条条带,其中多态性条带220条,平均多态性比率为95.2%,平均每条引物产生条带为14.7条。聚类结果和遗传相似系数分析显示,35个菌株间的遗传相似系数范围为0.506~0.935,平均为0.661。在遗传相似系数为0.593时,供试的35株镰刀菌可明显的分成2个ISSR类群（IG）,其中IGⅠ包括1～23号菌株,全部为F. oxysporum;IGⅡ包括24～35号菌株,全部为F. redolens。ISSR类群划分与菌种分类之间存在一定相关性 (IGⅠ中23株F. oxysporum间的平均相似系数为0.720,IGⅡ中12株F. redolens间的平均相似系数为0.717),但与菌株的地理来源不存在相关性。而同一类群中,菌株之间的遗传相似性与菌株的地理来源存在一定的相关性。     

瓜类尖孢镰刀菌的营养体亲和群研究

 应用营养亲和性方法研究了尖孢镰刀菌菌株抗氯酸盐突变体和nit突变体的诱发规律及分布特性,以及菌株营养体亲和群(VCG)的划分。研究表明,不同寄主(黄瓜、甜瓜和西瓜)分离的尖孢镰刀菌菌株形成的抗氯酸盐突变体数目差异不显著,平均为每个接种点产生0.89~0.98个;但寄主不同部位(根部、茎基部和茎中部)分离的菌株间差异显著,形成的数目分别为1.27、0.75及0.76个。菌株产生的nit1突变体比例(75.40%)显著高于nitM突变体比例(13.17%);nit1突变体数目会因菌株的寄主及菌株寄主部位的不同而有差异,寄主为黄瓜、甜瓜和西瓜的菌株产生的比例依次为67.73%、83.71%和77.50%,根部、茎基部及茎中部分离菌株产生的比例依次为81.82%、78.48%和68.64%,而在致病菌株与非致病菌株间无显著差异,分别为74.43%和79.63%;nitM突变体数目受菌株寄主影响较小,所占比例在11.17%~13.92%之间;而在寄主不同部位分离的菌株及致病菌株与非致病菌株间差异显著,分离自茎基部的菌株所占比例最高为15.97%,茎中部菌株所占比例最低为9.87%,致病菌株与非致病菌株所占比例分别为14.08%和9.26%。供试菌株分为7个VCGs,其特点为来源于不同寄主的尖孢镰刀菌菌株互不亲和,同一寄主的致病菌株与非致病菌株均不亲和,同一寄主不同部位分离的菌株可亲和。     

花生白绢病菌ITS分型、菌丝亲和群分析及相关生物学特性比较

2013~2016年从全国12个省市采集不同花生白绢病样本,共分离获得39个分离物,对其ITS-r DNA序列进行了分析,表明它们均属于齐整小核菌(Sclerotium rolfsii);这39个分离物分为两个亚组,分别包含22个和17个菌株;对这39个菌株进行了菌丝亲和群分析及相关生物学特性比较,共鉴定出23个菌丝亲和群;8个亲和群包含2~6个菌株,其余的15个亲和群都只包含1个菌株;同一菌丝亲和群的菌株菌落形态相似,大多数菌株的菌丝生长速度、菌核大小比较相近,个别菌株差异较大;39个菌株均能产生草酸,在菌落形态、菌丝生长速度、菌核大小和重量上均有差异,生长速度为0.47~2.32cm·d~(-1),菌核直径为0.71~1.87 mm,单粒菌核干重为0.24~2.64 mg。     

基于SRAP标记的黄瓜霜霉菌遗传多样性分析

本研究对来自黑龙江、辽宁、河北、山东、江苏5个省12个黄瓜主产区的77个黄瓜霜霉菌菌株,采用SRAP分子标记进行了遗传多样性分析。从35对SRAP引物中筛选出10对引物,共产生9 554条扩增条带,其中9 132条表现多态性,占95.6%。基于SRAP分子标记,77个黄瓜霜霉菌菌株的遗传距离为0.60~1.00,表明黄瓜霜霉菌具有丰富的遗传多样性。通过聚类分析,77个黄瓜霜霉菌菌株聚类为8个类群,并且来自相同地区的菌株大多数聚集于同一类群中,表明黄瓜霜霉菌群体的遗传多样性与其地理来源密切相关。     

香蕉枯萎病菌致病力分化与ISSR遗传多样性分析

香蕉枯萎病是一种破坏香蕉维管束的全株性土传病害。本研究旨在探讨香蕉枯萎病菌致病力分化和遗传多样性。以30株采自我国广西的香蕉枯萎病菌,16株分别来自澳大利亚和我国广东、海南、福建、云南等地的香蕉枯萎病菌为对象,采用伤根灌淋法测定香蕉枯萎病菌的致病力,然后用筛选到的ISSR引物对46个香蕉枯萎病菌菌株和4个对照菌株(3个非致病性尖孢镰刀菌和1个茄腐镰刀菌)进行ISSR遗传多样性分析。结果显示,分离到广西香蕉枯萎病菌1号生理小种(FOC1)8株,致病力强、中、弱类型比例分别为62.5%、12.5%和25%;广西香蕉枯萎病菌4号生理小种(FOC4)22株,致病力强、中、弱类型比例分别为18.18%、63.64%和18.18%。14条ISSR引物扩增出237个条带,多态性条带161个,多态性比例为67.93%,遗传相似系数0.76～0.96。聚类分析显示,以遗传距离0.80为阈值时菌株被分为8个类群,所占比例分别为4%、10%、60%、16%、4%、2%、2%、2%。第三类群全部为香蕉枯萎病菌4号生理小种。第一、二、四和五类群总量的70.59%为香蕉枯萎病菌1号生理小种。第八类群为香蕉枯萎病菌3号生理小种。结果表明,在香蕉枯萎病菌与寄主协同进化中,广西的FOC1和FOC4出现明显致病力分化。1号生理小种的遗传多样性比4号生理小种丰富。广西香蕉枯萎病菌4号生理小种与海南、广东的FOC4遗传相似性较高。香蕉枯萎病菌生理小种类型与遗传多样性相关。致病力变异与遗传多样性无相关性。研究结果对香蕉枯萎病菌种群扩张机制探讨、遗传动态分析以及有效防控措施的制定具有一定的指导意义。     

福建省香蕉枯萎病菌硝酸盐营养突变体的营养体亲和性测定

 Fourteen strains of Fusarium oxysporum f. sp. cubense were induced to produce 146 nitrate-nonutilizing(nit) mutants on a chlorate-containing medium. Among them, there were 117 nit1 mutants(80.14%), 17 nit3 mutants(11.64%) and 12 nitM mutants(8.22%). These strains were divided into two vegetative compatibility groups(VCGs) by the vegetative compatibility tests. Twelve strains of F. oxysporum f. sp. cubense from Musa AAA belonged to VCG1, two trains from Musa ABB belonged to VCG2.     

Physiological Races and Vegetative Compatibility Groups of Fusarium oxysporum f. sp. lactucae Isolated from Crisphead Lettuce in Japan

One hundred and sixteen isolates of Fusarium oxysporum f. sp. lactucae obtained from 85 fields in three crisphead lettuce-producing areas in Nagano Prefecture, Japan were typed for races using differential cultivars Patriot, Banchu Red Fire and Costa Rica No. 4. They were also grouped into vegetative compatibility groups (VCGs) using complementation tests with nitrate non-utilizing (nit) mutants. Two California strains reported as F. oxysporum f. sp. lactucum, a type culture of F. oxysporum f. sp. lactucae, and 28 avirulent isolates of F. oxysporum obtained from crisphead lettuce were included for comparison. Among Nagano isolates, 66 isolates were identified as race 1, and 50 as race 2. Race 1 strains derived from Shiojiri and Komoro cities and race 2 from Kawakami village and Komoro city. All isolates of race 2 were biotin auxotrophs, and the race could be distinguished based on its requirement for biotin on minimal nitrate agar medium (MM). Pathogenic isolates were classified into two VCGs and three heterokaryon self-incompatible isolates. Strong correlations were found between race and VCG. All the race 1 strains were assigned to VCG 1 except self-incompatible isolates, and all the race 2 strains to VCG 2. The 28 avirulent isolates of F. oxysporum were incompatible with VCG 1 and VCG 2. California strains was vegetatively compatible with VCG 1, and they were assigned to race 1. Based on vegetative compatibility, these two races of F. oxysporum f. sp. lactucae may be genetically distinct, and F. oxysporum f. sp. lactucae race 1 is identical to F. oxysporum f. sp. lactucum. Received 7 May 2002/ Accepted in revised form 6 September 2002     

2010-2011年小麦条锈菌群体的温度敏感性与毒性及遗传多样性的关系

为了明确小麦条锈菌毒性、遗传多样性以及温度敏感性三者之间的关系,本研究利用21个已知抗条锈病基因近等基因品系对2010-2011年生长季采自6个省市78株已知温度敏感性(ET50)的小麦条锈菌群体进行毒性鉴定,并利用AFLP技术对其进行遗传多样性分析。苗期毒性鉴定结果表明,不同省市小麦条锈菌群体的毒性基因多样性存在一定差异,甘肃菌株群体毒性多样性指数H值最高,为0.269 3,云南菌株群体最低,为0.150 4。遗传多样性结果显示,6省市小麦条锈菌群体遗传多样性指数H值范围在0.125 5~0.165 3之间,遗传一致度GI为0.964 7~0.987 2,遗传距离GD为0.012 9~0.036 0。三者的相关性分析表明,条锈菌群体毒性多样性与平均ET50显著负相关,与ET50变异系数正相关,而与遗传多样性没有显著的相关关系。     

Characterization of Fusarium oxysporum f. sp. radicis-cucumerinum attacking melon under natural conditions in Greece

A severe root and stem rot disease of melon was observed during the 2001 growing season on four glasshouse crops in Heraklio, Greece. A total of 43 isolates of F. oxysporum , obtained in Crete from glasshouse-grown melon and showing fusarium wilt or root and stem rot symptoms, were characterized by pathogenicity and vegetative compatibility. The majority of these isolates was also fingerprinted via amplified fragment length polymorphic (AFLP) analysis. Of the total number of isolates, 22 were identified by pathogenicity tests as F. oxysporum f. sp. melonis , 20 as F. oxysporum f. sp. radicis-cucumerinum , while one isolate was nonpathogenic on cucumber, melon, sponge gourd and pumpkin. All 22 isolates of F. oxysporum f. sp. melonis were assigned to vegetative compatibility group (VCG) 0134, and all 20 isolates of F. oxysporum f. sp. radicis-cucumerinum to VCG 0260. Isolates of F. oxysporum f. sp. radicis-cucumerinum were incompatible with isolates of F. oxysporum f. sp. melonis. AFLP fingerprinting allowed for the clustering of the isolates of the two formae speciales of F. oxysporum along two separate phenetic groups: f. sp. melonis to AFLP major haplotype I, and f. sp. radicis-cucumerinum to AFLP major haplotype II. Overall, pathogenicity, vegetative compatibility grouping and AFLP analysis were correlated and effectively distinguished isolates of F. oxysporum from melon. This appears to be the first report of natural infection of melon by F. oxysporum f. sp. radicis-cucumerinum worldwide.     

2012年部分麦区小麦白粉菌群体对三唑酮敏感性及其与毒性的关系

 抗病品种和化学防治是控制植物病害最有效的两种措施,病原菌在长期选择压下可改变其群体结构,以逐步适应品种抗性和杀菌剂压力。本研究采用拌种离体叶段法对 2012年采自我国9个省(市)的129个小麦白粉病菌Blumeria graminis f. sp. tritici单孢堆分离物进行了三唑酮敏感性检测,同时采用31个已知抗病基因品种(系)对其进行苗期毒性测定,并对二者之间的相关性进行分析结果表明:129个供试菌株对三唑酮的EC₅₀为 109.97 mg/L,平均抗药性水平达到52.62倍,变异系数为 107.2。所有供试菌株中,99.22% 的菌株产生了抗药性,其中高抗菌株占58.91%,中抗菌株占37.98%。北京菌株的抗药性水平明显高于其他8个省市。利用Popgen1.32软件对9个省(市)小麦白粉病菌群体的毒性多样性分析结果表明,四川群体毒性基因多样性水平最高,Nei基因多样性H值为0.224 1,浙江群体最低,H值为0.096 8。小麦白粉菌群体对三唑酮的敏感性和毒性的相关性分析表明,EC₅₀或EC₅₀变异系数与毒性多样性之间均不存在显著的相关性,但EC₅₀与毒性基因数目之间的关系符合对数方程。此结果可为杀菌剂和抗性品种的合理利用提供依据。     

Intraspecific variation in Diplodia seriata isolates occurring on grapevines in Spain

Variation of Diplodia seriata, a fungal species associated with botryosphaeria dieback of grapevine, was investigated with respect to its genetic, phenotypic and pathogenic characteristics. The inter‐simple sequence repeat (ISSR) technique was used to investigate the genetic diversity of 83 isolates of D. seriata. Five ISSR primers were able to provide reproducible and polymorphic DNA fingerprint patterns, thus showing a relevant genetic variability in the species. Analyses of ISSR data by different clustering methods grouped the isolates into two distinct clusters through the Bayesian and DAPC analyses. No relationships between either geographic or host origin of isolates and genetic clusters were observed. Several representative isolates from each genetic cluster were chosen for studying their conidial dimensions, in vitro mycelial growth, vegetative and mating compatibility, and pathogenicity on detached grapevine canes and potted vines. No significant differences in conidial dimensions were detected among the groups. Vegetative compatibility reactions were observed among isolates but this was not related with the genetic clustering. Production of sexual fruiting bodies in vegetative compatible crossings was not observed under the experimental conditions used in the study. All 14 isolates tested for pathogenicity were confirmed to be pathogenic according to the length of the necrotic lesions that they caused and their reisolation frequencies from the infected plant tissues. Differences in the length of necrosis were detected among isolates, thus revealing the existence of different virulence levels in the species.     

小麦白粉菌ISSR分子标记体系构建及其分离菌株的多样性分析

为了对小麦白粉菌群体的多样性进行研究,构建了其ISSR分子标记体系。以小麦白粉菌基因组DNA为模板,用正交设计和单因素水平优化的方法对ISSR反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化,建立了小麦白粉菌ISSR-PCR反应的优化反应体系;对20个ISSR引物的退火温度进行了优化,并筛选出一些多态性较好的ISSR引物。对33个分离菌株的ISSR扩增表明,ISSR标记在我国小麦白粉菌中存在较高的多态性;对ISSR标记揭示的白粉菌的遗传多样性和毒性多样性进行了比较,结果表明两者之间存在一定程度的相关性。     

利用香蕉水培系统测定枯萎病病原菌致病力

 为建立一种评价香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp. cubense)菌株间致病力差异的体系,在改进的香蕉水培系统基础上,对影响香蕉枯萎病菌致病力的接种菌液浓度、类型及处理方式等因素开展分析,同时与不同菌株盆栽测定结果进行比较以验证该方法的可靠性。结果表明:在香蕉水培系统下,将摇培5 d的菌液稀释10倍以上,使孢子初始浓度为1×10⁶ cfu·mL^-1,直接加入该菌液50 mL即可用于致病力评价,且不同菌株用该测定方法与盆栽测定的致病力结果基本一致。该方法的建立为香蕉枯萎病菌致病力的评价提供了快速简便的方法,也为下一步解析尖孢镰刀菌致病相关基因功能和致病机理及抗病品种的选育奠定了基础。     

连作条件下土壤中甘蓝枯萎病菌的致病力变化和种群遗传结构分化

 枯萎病菌致病力的变化可能是连作条件下甘蓝枯萎病严重发生的重要原因之一。本研究在建立适度感染的人工病圃的基础上连续种植甘蓝5茬,每茬收获后随机采集土样。利用驹田氏培养基通过稀释平板法对连作土壤中尖孢镰刀菌种群数量的监测结果表明,连作后尖孢镰刀菌的数量由第二茬后的3.047×10⁴ cfu·g^-1土壤增加到第五茬收获后的1.608×10⁵ cfu·g^-1 土壤。对各茬后所分离30株甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans, Foc）的培养性状的观察结果表明,连作后Foc菌株在菌落形态、菌落扩展速率和产孢量等方面均发生明显的变化。用浸根法进行的致病力测定结果表明,随着连茬次数增加,弱致病力菌株占总供试菌株的比例逐渐变小,到第三茬后由第一茬的6.7%下降为0;而强致病力菌株的比例逐渐上升,由第一茬后的6.7%上升到第四茬后的16.7%。利用11条寡聚核苷酸随机引物对受试菌株进行PCR-ISSR扩增,结果显示从第三茬后Foc群体遗传结构出现分化。UPGMA聚类分析结果表明,第三、四和五茬后的Foc菌株都分为A和B两个类群,每个类群又分为Ⅰ和Ⅱ两个亚类群,但同一类群和亚类群中包含不同致病力的菌株,未发现病菌的致病力变化与遗传结构分化之间的相关。