苹果叶片应答轮纹病菌胁迫的叶绿体蛋白质组学分析

【目的】开展苹果叶片应答轮纹病菌胁迫的叶绿体蛋白质组学研究,筛选苹果叶片应答轮纹病胁迫后差异表达的叶绿体蛋白。【方法】以未受轮纹病菌胁迫和受轮纹病胁迫的苹果叶片为试材,分别提取叶片叶绿体及其蛋白,利用双向电泳技术(2-DE)结合质谱技术(MALDI-TOF-TOF/MS)检测并分析差异表达蛋白点。【结果】叶绿体蛋白样品经双向电泳分离后,获得了背景清晰的双向电泳凝胶图谱。经质谱检测及数据库检索,成功鉴定得到21个差异表达蛋白点,按照功能划分为6类,分别为光合作用相关、能量代谢相关、蛋白代谢相关、氨基酸合成相关、抗氧化相关及未知功能蛋白。【结论】苹果叶片受轮纹病菌侵染后,叶绿体光合作用、能量代谢等多个代谢过程中的相关蛋白差异表达,应答轮纹病菌的胁迫。     

柑橘衰退病毒侵染对寄主植物同工酶及酸性病程相关蛋白表达的影响

以柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)不同致病力株系接种寄主植物,比较分析了寄主植物体内过氧化物酶(peroxidase,POD)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性变化特点。结果表明,该病毒侵染对这2种酶活性的影响因寄主品种和CTV株系而异,CTV强毒和弱毒株系侵染均导致墨西哥莱檬植株中POD活性明显降低;在甜橙上,CTV强毒株系接种植株中POD活性则显著性提高,而弱毒株系接种对POD的活性无明显影响;在对该病毒具有较高抗性的枳壳中,接种CTV不同株系对POD活性均无明显影响。而在接种强毒株系N25的墨西哥莱檬中PPO活性有所增强,在枳壳上则表现为接种植株的PPO活性降低,在甜橙上PPO活性无明显的变化。POD、PPO和酯酶(esterase,EST)同工酶酶谱分析的结果显示,CTV弱毒株系接种枳壳后诱导产生了2条新的EST同工酶谱带,而在其他CTV接种植株上均未诱导表达新的POD、PPO及EST酶谱。酸性病程相关蛋白分析结果显示,CTV强毒株系在甜橙上诱导产生有6条明显的酸性病程相关蛋白条带。     

石榴果实成熟期不同品种果皮蛋白质表达的双向电泳分析

【目的】石榴果实色泽是影响果品商品价值的重要因素之一,但石榴果皮颜色形成的分子机制还不清楚。应用差异蛋白组学技术,从蛋白水平上探究石榴果实发育成熟期果皮的代谢进程。【方法】运用双向电泳和MALDI-TOFTOF MS质谱鉴定技术研究‘三白’石榴和‘中农红’石榴果实成熟时果皮蛋白质组学差异。【结果】分别对‘三白’、‘中农红’石榴进行2-DE和质谱鉴定,在‘三白’和‘中农红’石榴果皮的电泳图谱中发现每一张重复胶上分别可以检测到892个蛋白点和890个蛋白点,与‘中农红’相比,在‘三白’果皮图谱中共检测到36个表达量相差2倍以上的蛋白质点,相对于‘中农红’,‘三白’有13个蛋白质点上调表达,19个蛋白质点下调表达。通过质谱鉴定和数据库检索注释了4个蛋白质点。分别为半胱氨酸合酶1(sport 1402)、细胞色素b6-f复合体(sport 0013)、叶绿素a/b结合蛋白(sport 5108)及果糖激酶2-like(sport 0503)。【结论】细胞色素b6-f复合体(sport 0013)、叶绿素a/b结合蛋白(sport 5108)和果糖激酶2-like(sport 0503)可能与果皮颜色变化相关;半胱氨酸合酶1(sport 1402)可能对提高石榴的抗氧化胁迫能力起到了重要作用。为研究石榴果实发育蛋白质组学及改善石榴果实品质提供一定的理论依据。     

不同生长时期嫁接和自根甜瓜蛋白质组学分析

【目的】研究嫁接和自根甜瓜不同时期生长和生理特性以及蛋白质表达差异,以期从蛋白质水平阐明嫁接影响甜瓜生长发育机制,为甜瓜嫁接优质高产栽培提供理论依据。【方法】以白籽南瓜为砧木嫁接薄皮甜瓜,自根苗为对照,测定生长指标、产量和生理指标的变化,采用TMT标记结合高效液相色谱—质谱串联技术(TMT-LC-MS/MS)比较分析嫁接和自根甜瓜不同生长时期叶片蛋白的表达差异,并应用平行反应监测(PRM)技术对6个差异蛋白进行靶向验证。【结果】相较于自根甜瓜,嫁接甜瓜具有较大的茎粗、叶面积和较高的产量,叶片可溶性蛋白、木质素、叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b含量显著增加,渗透调节物质Pro含量、抗氧化酶SOD和POD活性显著升高,膜脂过氧化物MDA含量显著减少。蛋白质组学分析表明,有2 187个蛋白表达差异显著,苗期、开花期、果实成熟期差异蛋白的数目分别为1 141、716和330个。功能和通路富集分析发现,差异蛋白主要有催化活性和键合作用等分子功能;参与代谢过程、细胞成分组成和单个有机体生命过程;差异蛋白主要富集在苯丙素合成、核糖体、卟啉和叶绿素代谢和光合作用等代谢途径中。PRM验证分析表明差异蛋白的变化趋势与TMT定量结果基本一致。【结论】砧木嫁接可能通过提高渗透调节和抗氧化酶活性,减少膜脂过氧化,促进苯丙素合成、核糖体、卟啉和叶绿素代谢等途径相关蛋白的表达来改善甜瓜生长。     

黄龙病菌侵染晚锦橙叶脉和根早期病原蛋白组学的比较分析

【目的】黄龙病(Huanglongbing,HLB)是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害,由于黄龙病病原菌无法离体培养,其关键的致病机制仍不清楚。为此,通过蛋白组学分析探究黄龙病菌侵染晚锦橙早期时病原蛋白的表达情况。【方法】利用叶圆片嫁接技术对晚锦橙(Citrus sinensis Osbeck)进行嫁接传毒,在传毒2个月时,对感病后的根和叶脉组织进行蛋白组测序,以黄龙病亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)基因组为参考,对测序结果进行注释,并以感病叶脉为对照,筛选病原菌差异表达蛋白,最后利用qRT-PCR对显著性差异表达蛋白质进行验证。【结果】共鉴定出38个病原蛋白,其中有6个显著性表达差异蛋白;GO功能注释揭示这些病原蛋白主要与核酸结合和物质转运活性相关;qRT-PCR结果显示,6个显著差异蛋白在根部组织中的表达水平显著高于叶片组织;其中ABC转运系统重要组成成分CLasMalE(ACT56611.1)转运蛋白基因的表达倍数高达595倍。【结论】在黄龙病菌侵染柑橘根和叶的早期,与病原菌物质运输和核酸代谢相关基因的表达差异明显,暗示其在黄龙病菌侵染寄主中起着重要作用,为黄龙病菌致病机制研究提供了基因资源和理论基础。     

应用抑制性差减杂交技术研究枣缩果病病程相关基因

【目的】了解细交链孢菌侵染枣果实过程的差异表达基因。【方法】以白熟期‘蜂蜜罐’枣的果实为材料,人工接种细交链孢菌,分别在接种0.5、1、2、3和4 d后取样,通过抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了病原菌诱导的差异表达的c DNA消减文库。【结果】PCR鉴定随机挑取的阳性克隆,显示插入片段大小为200~900 bp。随机挑选200个阳性克隆进行测序,利用BLASTx在Gen Bank Nr数据库进行序列比对分析,共获得118个Unigenes。对这些ESTs进行功能分类发现细交链孢菌侵染下诱导表达基因涉及植物细胞内的多种代谢和应答过程,其中包括抗病/防御类、信号传导途径类、新陈代谢类、蛋白质合成和加工类及细胞结构的组成等,尤其以抗病/防御类基因所占比例最大(27.17%)。【结论】通过SSH研究了缩果病病原侵染果实过程的差异表达基因,鉴定到一些与枣缩果病相关的基因,为进一步研究相关基因及今后筛选防治枣缩果病提供理论基础。     

鹰嘴桃果实组织海绵化病害相关基因差异表达分析

【目的】明确鹰嘴桃果实组织海绵化的分子机制。【方法】对鹰嘴桃病害果海绵组织、非病害组织和健康果实组织进行转录组测序。【结果】在病害果海绵组织vs健康果实组织、非病害组织vs健康果实组织、病害果海绵组织vs非病害组织的转录组比较中，分别鉴定到4557、4446、672个差异表达基因。病害果海绵组织与健康果的差异表达基因主要富集在新陈代谢、碳水化合物代谢、能量代谢、光合作用等通路。与健康果或病害果非病变组织相比，鉴定出12个与细胞壁代谢相关的差异表达基因（PG-At1g48100、PG-QRT3、PG、6个XET2、BXL7、2个EXP-A4）在鹰嘴桃病害果海绵组织表达上调；此外，3个钙转运基因（ACA13）和2个钙传感器基因（CaM11、CML18）在鹰嘴桃病害果海绵组织表达上调。其他钙传感器相关基因的表达水平在病害果中出现不同程度的上调和下调。【结论】鉴定出12个与细胞壁代谢、3个与钙转运和23个与钙传感器相关的差异表达基因，推测钙代谢以及细胞壁代谢异常在果实组织海绵化过程中发挥关键作用。     

基于p23基因的野生柑橘和栽培柑橘上衰退病毒分离株间的遗传特征分析

【目的】比较分析野生柑橘与栽培柑橘上衰退病毒(CTV)分离株间的分子遗传特征,为深入解析CTV的遗传进化提供相关依据。【方法】运用RT-PCR对我国云南、广西、四川、湖南、江西等省(区)的11个野生柑橘上的CTV分离株和4个国内栽培甜橙及柚上的CTV强弱毒代表株分离株的p23基因进行扩增、测序,所获序列与Gen Bank收录的具有代表性的国外CTV分离株的相应基因序列进行比对分析。【结果】野生柑橘与国内外栽培柑橘上CTV分离株的p23基因序列相似率为87.7%~99.3%;密码子中碱基含量GC%AT%,密码子转换数多于颠换数,第3位的碱基替换数最多,其次为第1位,最少是第2位;非同义突变与同义突变的比值(dN/dS)小于1,表明p23基因在进化过程中承受着净化选择。系统聚类分析表明,来自于野生柑橘上的11个CTV分离株在构建的系统发育树中分属不同的簇支,与不同来源地具有较高相似性和较低遗传距离的栽培柑橘上的CTV分离株构成同一组群。【结论】野生柑橘与栽培柑橘上的CTV分离株在碱基含量、密码子转换和颠换率及非同义突变与同义突变比值(dN/dS)等遗传特征方面均表现出一致性,系统发育分析表明,野生柑橘上CTV分离株基于p23基因序列的聚类关系与其地理来源之间无明显相关性。     

‘鸭梨’及其自交亲和性突变体‘金坠梨’花粉蛋白质组比较分析

【目的】分析‘鸭梨’和‘金坠梨’花粉蛋白差异,探讨‘金坠梨’花粉侧自交亲和突变的机制。【方法】以‘鸭梨’及其自交亲和性芽变‘金坠梨’花粉为材料,利用双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis,2-DE)对二者花粉总蛋白进行分离,并对差异蛋白进行功能和质谱分析,通过qRT-PCR进行相关差异基因的表达验证。【结果】分离得到23个差异蛋白,其中14个蛋白在‘金坠梨’中上调表达,9个蛋白在‘金坠梨’下调表达;对其中差异显著的10个蛋白点质谱检测结果表明,1个为半胱氨酸甲基转移酶(cysteine S-methyltransferase,4 803),1个为存储蛋白(Storage protein,5413),4个为蛋白酶类:果糖激酶(fructokinase,5 316)、顺乌头酸水合酶(aconitate hydratase,5 811)、烯酰-ACP-还原酶(Enoyl-ACP reductase,7 303)和JPR ORF1蛋白(JPR ORF1 protein,7 506),4个为HSP家族蛋白:HSP70伴侣26(HSP70-type chaperone 26,8 633)、HSP 90.5(8 822)和2个ER结合蛋白(ER-binding protein,4 209和8 805)。这些蛋白涉及到遗传信息处理、碳水化合物代谢、能量代谢、酶和氨基酸代谢等生理过程;qRT-PCR对8个基因进行验证,发现部分基因在蛋白水平与基因表达水平有明显差异。这些差异的蛋白在不同的信号途径中参与了‘金坠梨’花粉侧自交亲和突变。【结论】明确了‘鸭梨’和‘金坠梨’花粉侧自交亲和性突变中差异表达蛋白,为进一步研究梨亚科自交不亲和性的调控机理提供理论依据。     

外源赤霉素诱导‘藤稔’葡萄果实差异表达基因的cDNA-RAPD分析

【目的】为鉴定葡萄果实赤霉素诱导响应基因,【方法】应用cDNA-RAPD技术,以鲜食葡萄品种‘藤稔’为研究对象,对赤霉素处理后果实发育过程中基因表达进行了mRNA指纹分析。【结果】通过16条随机引物的筛选,共分离得到61个差异表达的转录衍生片段(TDF),其中增强表达或赤霉素诱导下特异性表达TDF42条,抑制表达19条。对其中18个TDF进行了克隆、测序和序列分析发现,17个TDF与NCBI已有序列同源,其中10个为已知功能基因,另有1个TDF无同源序列。对选取的6个TDF进行半定量RT-PCR验证,结果表明3个基因片段在处理条件下均特异表达或上调表达,另外3个基因片段在处理条件下均未见表达或下调表达,这与cDNA-RAPD表达谱结果相一致。【结论】利用cDNA-RAPD技术成功分离了部分受赤霉素诱导的差异表达基因。     

应用real-time RT-PCR监测柑橘衰退病毒强、弱毒株的时序变化

 使用褐色橘蚜在提前7个月预免疫接种了柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）弱毒株CT11的锦橙植株上拮抗接种强毒株CT14,应用real-time RT-PCR技术,监测供试植株中CTV强、弱毒株的含量变化,同时采用内参基因18S rRNAF/R及nad5F/R校正检测结果。试验结果表明,在拮抗接种3个月内始终未能在预免疫的拮抗植株中检测出强毒株CT14。在25头蚜虫拮抗接种后45 d和50头蚜虫拮抗接种后10 d,绝大多数预免疫的拮抗植株中弱毒株的含量高于预免疫的负对照植株,此后弱毒株的含量基本下降到负对照植株的水平,而负对照植株内弱毒株的含量变化不明显。     

应用SSCP技术分析我国柑橘衰退病毒的混合感染

以随机采样的方式,从湖北、湖南和江西3省10县的柑橘产区收集242份温州蜜柑(CitrusunshiuMarc.)、橘(C.reticulataBlanco)、甜橙(C.sinensisOsbeck)和柚(C.grandisOsbeck)样品。对PAS-ELISA法初步检测呈阳性的样品进行柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus,CTV)CP基因(coatingproteingene,CPgene)的RT-PCR扩增,结果来自14个样品采集地的120份样品感染了CTV,单个采样点的感染率为20.0%～71.4%,而总感染率达49.6%,表明CTV在这些地区广泛发生。单链构象多态性(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)分析显示,120份CTV的CP基因RT-PCR的扩增产物共产生120种SSCP带型,而且存在广泛的混合感染。     

Comparative proteomics of myocardial mitochondrial proteins in aging rats

AIM:To identify the proteins related to aging in the mitochondria of the heart. METHODS:Mitochondria were isolated from the hearts of adult (10-week) and old (12-month) rats (n=3). Total proteins extracted from the mitochondria were applied to the two-dimensional gel electrophoresis. The differentially expressed protein spots evaluated by a software were subjected to in-gel digestion, and analyzed by the matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). ATP content in the heart was also measured. RESULTS:Eighty-four differentially expressed protein spots were observed, and fifteen of them were analyzed by MALDI-TOF- MS. Four proteins including creatine kinase, peroxiredoxin 2, Tu translation elongation factor and isocitrate dehydrogenase were up-regulated and 11 proteins including succinate dehydrogenase, malate dehydrogenase, aconitate hydratase, NADH dehydrogenase, ATP synthase H+ transporting, ATP synthase beta chain, heat shock protein 60, glucose-regulated protein 78, prohibitin, Aldehyde dehydrogenase 2 and voltage-dependent anion channel exhibited down-regulation in the aging group compared to the adult one. ATP content in the heart of old rats was significantly reduced as compared to that in adult rats (n=5, P<0.01). CONCLUSION:Significant changes in the mitochondrial protein expression in the aging heart were identified by the 2-DE electrophoretogram with high resolution and reproducibility. The functions of these identified proteins need to be further investigated.     

寄主凤凰柚对柑橘衰退病病毒甜橙分离株构成的影响

 为研究不同柑橘类型对柑橘衰退病病毒构成的影响，将9个保存在新会橙上的引起甜橙茎陷点症状的柑橘衰退病毒强毒分离株嫁接接种到凤凰柚后，比较了接种前后p25基因的HinfⅠRFLP 和SSCP变化情况。分离株 CT90与CT20接种前后的RFLP组群没有发生变化；RFLP组群发生变化的分离株中有6个由混合组群变为单一组群。此外，除分离株CT90接种前后的SSCP谱带保持不变外，其余8个分离株从新会橙接种到凤凰柚后，SSCP谱带数均呈减少趋势。试验结果倾向于表明某些能在甜橙上增殖的CTV株系在凤凰柚上的增殖受到了抑制。     

盐胁迫下枣叶片蛋白质组差异的分析

【目的】为了探明盐胁迫下枣蛋白表达的差异,【方法】以较耐盐碱的‘七月鲜’枣品种的扦插苗为材料,经过临界浓度(0.60%)的钠盐(NaCl)处理,取其叶片进行蛋白质双向电泳,经ImageMaster 2D分析,【结果】结果表明,处理与对照之间总蛋白的整体分布模式非常相似,在pH 3~10和MW50~90 kD内的蛋白点分布最多,处理与对照之间量变倍数大于1.5倍的差异点有26个,其中6个蛋白受胁迫上调,20个蛋白受胁迫下调。在上调的蛋白质点中,3个点受盐胁迫诱导增加了近4倍,2个蛋白质点相对丰度增加了2倍以上,表现出强烈的盐诱导特性。说明他们可能在枣的抗盐机制中发挥重要作用。在下调的蛋白质点中,2个点相对丰度降低至对照的5倍左右,表现出强烈的盐抑制特性,说明其可能是对盐胁迫比较敏感的2个蛋白质或多肽,并且在枣的抗盐性机制中也发挥比较重要的作用。【结论】在临界浓度钠盐胁迫下,枣叶片蛋白质表达有显著差异。     

柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的二重RT-PCR检测体系的建立与应用

选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。     

Differential analysis of serum proteomics in Crohn's disease treated with infliximab

AIM: To identify the serum proteins that might serve as biomarkers for predicting mucosal healing (MH) in the patients with Crohn's disease (CD) treated with infliximab (IFX). METHODS: We collected serum samples before treatment (0 week, group A) and 14 weeks after treatment (group B) from 7 CD patients with IFX treatment who had achieved MH, as well as the serum samples from 7 CD patients who had not achieved MH (0 week, group C; 14 weeks, group D). Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis was applied to analyze and compare the results of serum profiles between groups A and B, C and D, A and C, B and D. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry and bioinformatics tools were utilized to preliminarily identify and figure out the differentially expressed proteins. RESULTS: (1) In total, there were 44 differentially expressed spots, 36, 3, 10 and 31 differentially expressed spots were detected while comparing A with B, C with D, A with C and B with D, respectively. (2) Among those spots, 17, 2, 2 and 15 proteins were identified, respectively. In total, there were 19 differentially expressed proteins, including apolipoprotein E, apolipoprotein A-I, complement factor H, and so on. (3) Protein functional association networks were carried out based on STRING database. CONCLUSION: The serum protein profiles obviously change after IFX treatment in MH CD patients, and the serum protein profiles of MH patients are different from that of non-MH patients after IFX treatment. The 19 proteins we identified may serve as potential biomarkers for predicting MH in CD patients with IFX treatment.     

Analysis of serum biomarkers in human knee osteoarthritis

AIM: To analyze the proteomic components of the sera from knee osteoarthritis patients and normal people, and to search proteins that might serve as serum biomarkers for osteoarthritis diagnosis, treatment or pathogenesis. METHODS: Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) was applied to analyze the sera obtained from the patients with knee osteoarthritis (n=4) and normal controls (n=4). The differentially expressed proteins were identified by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Western blotting analysis was applied to confirm the results. RESULTS: Comparative proteomic data of serum from the patients with osteoarthritis was successfully obtained. Eight differentially expressed protein spots were observed. Five up-regulated and 3 down-regulated proteins were identified. Western blot analysis confirmed that α₂-macroglobulin was increased. CONCLUSION: There are significant differences between serum proteins obtained from the patients with knee osteoarthritis and normal controls. α₂-Macroglobulin might be utilized as potential biomarkers for the diagnosis and treatment of osteoarthritis.