基于PCR-DGGE和16S rDNA克隆技术研究土壤细菌多样性的实验技术

PCR-DGGE是测定土壤微生物多样性常用的技术手段之一,但是提供的微生物多样性信息不够完整,如果与16S rDNA克隆技术相结合,微生物多样性信息更加丰富。 PCR-DGGE和16S rDNA克隆实验技术复杂,许多新手没有成熟可靠的经验可借鉴。以土壤细菌多样性研究方法为例,分别从 DNA 提取与纯化、PCR扩增、DGGE、胶片染色技巧以及16S rDNA 克隆技术等环节进行技术体系构建,可供利用该技术的研究人员参考。     

松嫩草地土壤细菌群落 16S rDNA V3 片段 PCR 产物的 DGGE 分析

从松嫩草地9种植物群落覆盖下的土壤中抽提细菌总DNA,直接扩增16SrDNAV3可变区,应用变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析16SrDNAV3可变区的多态性,发现不同种类植物群落地下土壤细菌的种类以及生物量都有所不同,并且地上植被的盖度影响了地下土壤微生物的物种多样性。     

应用变性梯度凝胶电泳和16S rDNA序列分析对山羊瘤胃细菌多样性的研究

 以取自3头安装有永久性瘤胃瘘管的土种山羊的瘤胃内容物为材料, 经过DNA抽提和PCR扩增, 扩增产物利用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE,一种DNA指纹技术)分析瘤胃细菌在两种日粮条件下的多样性。同时利用基因序列分析技术,分析了16个在DGGE胶上有匹配带的克隆的16S rDNA序列,并与现有的数据库进行了比较。结果表明,饲喂基础日粮时3头山羊瘤胃内容物的DGGE图谱有一定的相似性(43%～55%);饲料中添加大豆黄酮一定程度上影响了瘤胃细菌的组成,DGGE谱带变化程度分别为1号36%、2号46%、3号30%。基因序列分析表明,DGGE图谱中优势条带的16S rDNA基因序列中有5个基因序列与基因数据库登录的相关序列的相似性大于97%,8个基因序列的相似性在90%～96%,余下的低于90%。相似性大于97%的5个克隆中,只有1个被鉴定为Prevotella sp.,其余4个都属于未被鉴定的瘤胃细菌。     

盐胁迫下水稻根系细菌群落多样性研究

[目的]旨在获得与抗盐有关的水稻根系细菌群落,以期为盐碱水域综合种养技术开发提供支持.[方法]采用高通量测序方法,研究了不同盐浓度胁迫下的水培水稻根系微生物群落结构的变化.[结果]不同盐浓度胁迫下,水稻根系细菌群落群落丰度及多样性随着盐浓度呈现出先高后低的态势,3‰浓度胁迫下最高,5‰浓度胁迫下最低.[结论]Rhodo...     

烟草内生细菌多样性研究

为了揭示烟草内生细菌多样性,选择K326、云85 和红花大金元3 个烤烟品种进行内生细菌的 分离和16S rDNA 序列分析鉴定,获得不同品种烟草内生细菌的多样性特征。结果显示,27 株内生细菌分 别属于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis（33%）、蕈状芽孢杆菌Bacillus mycoides（4%）、芽孢杆菌属Bacillus sp.（11%）、肠杆菌属Enterobacter sp.（4%）、寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.（4%）、热带根瘤菌Rhizobium tropici（4%）、假单胞菌属Pseudomonas sp.（4%）、土地芽孢杆菌属Terribacillus sp.（4%）,芽孢杆菌属 Bacillus sp. 为优势细菌类群。3 个品种的 Shannon index（H′）以K326 最高、为2.02,其次是云85、为1.48,红 花大金元最低、为1.3。     

西北干旱区典型绿洲盐生植被群落特征及多样性研究

本文以西北干旱区典型绿洲-渭干河-库车河三角洲为主要研究区域,运用数量生态学的方法对盐生植被群落特征及物种多样性进行了分析.结果表明:以梭棱为单优势种的群落Ⅳ具有最高的优势度指数(C)和最低的丰富度指数(R)、多样性指数(H')和均匀度指数(E),群落结构最为简单;以骆驼刺为优势种和梭棱为主要伴生种的群落Ⅱ具有较高的多样性指数和均匀度指数,但优势度指教较低,结构相对稳定;而以柽柳和梭梭为共优势种的群落Ⅰ具有最高的物种丰富度和中等水平的优势度指数、多样性指数和均匀度指数,群落中物种数较多,群落结构较为复杂;以芦苇和骆驼剌为共优势种的群落Ⅵ,其物种丰富度指数和物种多样性指数,物种优势度指数和物种均匀度指数水平居中;以柽柳为主要优势种的群落Ⅲ和Ⅴ,其物种丰富度指数、优势度指数、多样性指教和均匀度指数则属于中等偏上水平,群落结构稳定.     

土壤宏基因组的提取及基于免培养技术分析细菌16S rDNA

采用CTAB—SDS-冻融法和玻璃粉吸附法提取土壤宏基因组（metagenome），经琼脂糖凝胶电泳后用回收试剂盒对其进行纯化。以细菌16S rDNA通用引物从宏基因组中扩增出V8和V9两个高变区，回收纯化后与克隆载体pMD18-T连接，转化大肠杆菌DH5a，随机挑取一个阳性克隆菌进行序列测定，经BLAST分析表明该序列所代表的是一个不动杆菌属（Acinetobacter）细菌。本研究结果为分析土壤微生物种群结构和直接从土壤中分离功能基因奠定了基础。     

新疆南疆羊蜱蝇基于12S rDNA,16S rDNA和18S rDNA基因的分子生物学鉴定

旨在建立羊蜱蝇的分子生物学鉴定方法,从新疆南疆库车县的绵羊体表采集样品,形态学鉴定初步确定为羊蜱蝇,随后进行羊蜱蝇12SrDNA、16SrDNA和18SrDNA基因的扩增和测序,将所得序列进行Blast在线分析和MEGA 5.0分析。结果表明,12SrDNA序列与云南2016年提交的相似性为100%,16S rDNA序列与丹麦2007年、捷克2017年和新疆2017年提交的相似性均为99%,18SrDNA序列与新疆2016年提交的相似性为99%。羊蜱蝇16SrDNA和18SrDNA序列均能与GenBank数据库中已知羊蜱蝇基因序列聚类,且羊蜱蝇种内K2P遗传距离为0～2.3%,通过12SrDNA、16SrDNA和18SrDNA基因的扩增和测序可准确鉴定羊蜱蝇。     

烟草秸秆还田对土壤细菌多样性的影响

为了进一步验证烟草秸秆还田对土壤细菌多样性的影响,利用Mi Seq平台对烟草秸秆未还田(no Tobacco Stalk Returning,n TSR)、1倍烟草秸秆还田(TSR1)和2倍烟草秸秆还田(TSR2)土壤的16S r DNA V3+V4区进行了测序分析。n TSR、TSR1和TSR2的Total Tags数目分别为41949、54761和60063,其OTUs(Operational Taxonomic Units)数目分别为1193、1275和1298。TSR1、TSR2丰度排名前35个属的物种丰度和丰度排名前10个属的OTUs丰度聚在一起,与n TSR有较为明显的区别。TSR1、TSR2的OTU(97%)、OTU(95%)、Chao1(97%)、Chao1(95%)、Shannon(97%)和Shannon(95%)指数均高于n TSR的。另外,n TSR与TSR1、TSR2之间的基于Weighted Unifrac距离和Unweighted Unifrac距离的UPGMA聚类有明显差别。因此,TSR1、TSR2土壤细菌多样性高于n TSR的,而TSR1和TSR2土壤细菌多样性无明显差异。     

基于16S rRNA测序的植茶温室土壤细菌多样性及群落结构研究

为了明确温室栽培模式对茶园土壤细菌多样性和群落结构的影响,找寻温室栽培、露天栽培模式之间的差异指示种,以更科学地为管理温室茶园提供理论依据。采用NovaSeq 6000高通量测序技术,以及主坐标分析（PCoA）、置换多元方差分析（Adonis）及LEfSe等分析方法对不同栽培模式茶园土壤细菌多样性及群落结构进行研究。结果表明,16S rRNA测序质控后,土壤样品总共获得操作分类单元（OTU）数量为11 137个（497 556条有效序列）。3个处理间共同含有200个OTU,温室间共同含有495个OTU。茶园土壤细菌主要优势菌门为变形菌门、酸杆菌门、放线菌门等。ACE指数、Chao1指数、Simpson指数与Shannon指数等α多样性指数均以露天栽培模式极显著高于温室。PC1和PC2主成分贡献率分别为65.10%、21.55%,共解释了86.65%（R²=0.612,P=0.001）的信息。露天栽培处理差异指示种为酸杆菌门（Acidobacteriota）、Acidobacteriae等。温室处理指示种为罗丹诺杆菌科（Rhodanobacteraceae）、黄单胞菌目（Xanthomonadales）、弗兰克氏菌目（Frankiales）等。以上研究结果为从微生物水平上研究温室栽培模式对茶园土壤生态质量的影响提供了参考。     

黄河三角洲盐渍土园林绿化植物种类及抗盐能力调查

对黄河三角洲地区不同盐渍化生境中自然生长和人工种植的绿化植物,进行种类、生长状况及分布调查,同时通过土壤样品试验测定和文献查阅等方法评价其耐盐等级和观赏价值。     

黄河三角洲盐碱地混交林林下植被现状

采用样方调查的方法,研究了黄河三角洲盐碱地不同混交林林下植被的种类、生物多样性、生物量及不同土壤盐分林下植被的生长状况。共记录到林下植被31种,隶属于14科31属,其中禾本科最多,为10种;1、3、7、22龄林下植被的优势种分别为芦苇和芦蒿、苦荬菜＋灰菜＋狗尾草、车前草、韩式隐子草;林下植被的物种并不丰富,生物多样性不高,且富集种少,稀疏种多,地上部分生物量皆大于地下;土壤盐分含量高时,林下植被以耐盐碱植物为主,反之亦然,且由于苦买菜和灰菜具有较强的适应能力,在4个不同土壤盐分含量下都有生长。     

黄河三角洲湿地水生维管束植物多样性研究

通过实地调查和资料分析,对黄河三角洲湿地水生维管束植物的多样性进行了研究.结果表明:黄河三角洲湿地共有水生维管束植物64种,隶属25科40属;依其生态类群和群落特征划分为4个生活型26个主要的植物群丛.同时,对水生维管束植物的资源现状进行了分析并就其保护、利用提出了建议.     

黄河三角洲盐碱地人工林土壤肥力质量的综合评价

以黄河三角洲滨海盐碱地柽柳、杜梨、盐柳、白蜡人工林为研究对象,未造林荒地为对照,对不同人工林的土壤养分、土壤酶活性进行测定,利用隶属函数分析法对不同人工林的土壤肥力进行综合评价。结果表明:与对照荒地相比,各人工林平均土壤有机质、铵态氮、硝态氮、有效磷、速效钾质量分数,分别提高了177.89%、76.47%、757.74%、32.76%、30.13%;土壤中磷酸酶、过氧化氢酶、脲酶、蔗糖酶活性,比对照荒地分别提高了47.09%,11.52%,41.07%,76.00%;土壤肥力综合评价分值,从大到小依次为白蜡(0.777)、杜梨(0.694)、柽柳(0.572)、盐柳(0.436)、荒地(0.030)。     

草本纤维提取用菌株的PCR-16S rDNA及ITS-RFLP分析

通过分析从沤麻水中分离到的8株草本纤维提取用菌株的16S rDNA以及ITS序列,鉴定并构建其聚类图,明确草本纤维提取用菌株的遗传关系.通过BLAST比对16S rDNA并用限制性内切酶酶切16～23S的ITS保守序列,对参试菌株的16S rDNA及ITS酶切片段进行聚类分析.结果表明,8株菌株分别属于地表芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及多粘类芽孢杆菌:基于16S rDNA序列与ITS-RFLP所获得的聚类结果基本一致,菌株1251与菌株1172-1聚为一类,其余聚为一类,但种内聚类存在一定的差异,可能与不同类型的序列进化程度有关,8株菌株的16SrDNA序列的相似性为78.66%;Alu Ⅰ、Hinf Ⅰ、Sau3A Ⅰ、Taq Ⅰ 4种限制性内切酶对参试的8株草本纤维提取用产芽孢菌株的ITS进行酶切,各获得0～4条100～440bp的酶切产物.     

黄河三角洲地区盐碱地主要改良措施分析

黄河三角洲地区盐碱地分布广泛,当地在改良治理的过程中,积累了许多有效措施,但单纯的每项措施都有利有弊,本文对改良治理黄河三角洲地区盐碱地的几种主要措施作了简单分析,以便合理利用这些措施。     

黄河三角洲重盐碱地植被特征与植被恢复技术

对黄河三角洲重盐碱地的土地现状和植被特征进行了分析,概括总结了以土壤改良为重点的上农下渔、条台田整地改良、深松土壤、化学改良与种植耐盐牧草相结合的植被恢复技术的要点与使用范围,提出了在重盐碱荒地、光板地上通过白刺、柽柳造林进行植被恢复的技术,以及在稀疏柽柳地上提高植被覆盖率的技术。     

北京地区枣疯病植原体16SrDNA基因序列分析

利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物R16F2n/R16R2对北京昌平区西峰山村小枣患病植株总DNA进行PCR扩增,结果得到约1.2 kb的特异性DNA片段.对克隆扩增获得DNA片段测序,结果表明,北京昌平地区枣疯病植原体16S rDNA基因片段长1248 bp,与韩国枣疯病植原体同源性最高,为99.51%.序列同源性比较的结果表明克隆到的植原体归属于榆树黄化组16SrV-C亚组.     

黄河三角洲湿地资源及生物多样性研究

黄河三角洲湿地是我国暖温带保存最完整、最年轻的湿地生态系统.阐述了黄河三角洲湿地类型,全面调查了湿地中的植物资源和动物资源,丰富的湿地类型和众多的生物资源构成了中国最美的六大沼泽湿地之一.     

黄河三角洲生态经济可持续发展研究

分析了三角洲的现状和制约三角洲发展生态经济的因素,提出了从发展生态经济、建设生态环境、加快城市发展等3个方面来发展黄河三角洲生态经济的对策。