GNA基因表达载体的构建及遗传转化甘蔗

利用经人工改造的gna基因分别与Ubi、Rbcs启动子组合,构建抗虫植物表达载体pUNG和pRNG,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经PPT筛选和PCR检测,获得Ubi-gna转基因植株124株,Rbcs-gna转基因植株35株。对部分转基因植株进行RT-PCR检测,初步证明外源基因已经整合到甘蔗基因组中,并得到有效表达;对RT-PCR阳性植株进行GNA(植物外源凝集素)活性测验,结果表明,甘蔗叶片表达的凝集素可以使健康公鸡的红细胞凝集,初步证明表达的GNA具有正常的生物学活性。     

甘蔗花青素转录因子基因ScRS克隆与基因枪转化研究

花青素不仅是天然色素,而且具有保健功能。花青素转录因子基因对于调控花青素的合成具有关键作用。本研究根据玉米花青素转录因子基因RS序列设计引物,利用同源克隆技术,得到甘蔗花青素转录因子基因ScRS的全长序列;在ScRS序列两端分别添加KpnⅠ、SalⅠ酶切位点,构建植物表达载体pCAMBIA1301-35SN-ScRS,包被微粒载体通过基因枪对甘蔗愈伤组织进行轰击,转化的愈伤组织明显呈紫红色;将紫红色愈伤组织分化培养获得再生甘蔗植株,经PCR检测,获得转ScRS基因阳性植株,初步证实利用克隆的基因转化甘蔗可以使愈伤组织显色。研究结果对于建立新型的遗传转化可视化示踪体系和培育高花青素甘蔗品种具有重要意义。     

利用dsRNA介导的抗病性获得抗马铃薯Y病毒（PVY）的转基因烟草

为了获得抗马铃薯Y病毒(PVY)转基因烟草,分别扩增PVY HC-Pro基因3’端正、反向片段,构建反向重复植物表达载体.利用农杆菌介导法转化普通烟草(Nicotiana tabacum)云烟85,经抗性筛选及抗病性鉴定,获得T0代转基因抗病烟草株系.繁殖T0代抗病株系,抗病性鉴定发现,部分抗病株系的T1代烟株发生了一定比例的抗感分离.Real-time PCR检测发生抗感分离的T1代烟株,发现抗病烟株中PVY HC-Pro基因RNA积累水平显著低于感病烟株,说明抗病烟株中HC-Pro基因发生了RNA沉默.利用dsRNA技术沉默HC-Pro基因,获得了烟草品种云烟85的T1代转基因抗PVY株系.     

美洲商陆抗病毒蛋白基因遗传转化甘蔗的研究

构建叶片特异表达启动子rbcs驱动的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAP-c的植物表达载体PNRPL,冻融法转化农杆菌EHA105后,通过农杆菌介导法侵染甘蔗优良品种ROC22的胚性愈伤组织,经PPT抗性筛选以及PCR鉴定,共获得了24株转化植株,对其中的5株进行Southern杂交检测,有2株呈阳性,初步证明外源基因已整合到甘蔗基因组中;对其接种甘蔗花叶病毒,初步结果表明获得的转化植株对甘蔗花叶病毒具有一定的抗性.     

刺葡萄DFR基因植物表达载体构建及转化茉莉花愈伤组织的研究

本研究以从刺葡萄克隆获得的DFR基因为目的基因，同时从质粒pCAMBIA1302中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子，并利用双酶切法构建由CaMV35S启动子驱动DFR基因且带有NOS终止子的表达载体，验证测序结果显示成功构建了pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS植物表达载体，并将该载体转化到农杆菌EHA105中。采用农杆菌注射渗透法转化烟草叶片进行瞬时表达，经鉴定，转化后的烟草叶片中能检测到GFP基因的表达。采用农杆菌介导法将该植物表达载体转化受体茉莉花愈伤组织，经多轮抗性筛选获得了转基因抗性愈伤组织，经PCR鉴定，茉莉花转基因抗性愈伤组织中检测到GFP、Hyg和DFR基因等的存在，初步证明目的基因DFR已成功整合到宿主的基因组中。茉莉花愈伤组织遗传转化体系的建立，验证了花色苷合成相关基因转化茉莉花愈伤组织的可行性，为今后通过植物转基因技术丰富茉莉花的花色奠定基础。     

基因枪法将Glu基因导入甘蔗愈伤组织

将含有Glu基因(β-1，3-葡聚糖酶基因)的植物表达载体pBIuG通过基因枪法将Glu基因导入甘蔗叶片愈伤组织，在Km抗性培养基上诱导再生植株，获得的再生植株经PCR检测，证明外源Glu基因已整合到甘蔗基因组中。     

CryIA(c)基因植物表达载体的构建及转基因甘蔗的获得

构建了玉米UBI启动子驱动Bt CryIA(c)基因的高效植物表达载体pUBTC,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经过除草剂PPT 3次连续筛选,获得89株抗性植株,经过PCR扩增检测,得到71株阳性植株,对其中7株进行RT-PCR检测,证明外源基因已经成功的整合到甘蔗基因组中,并得到有效的表达。     

Cry1Ab基因转化甘蔗及转基因抗虫植株的获得

构建玉米UBI启动子驱动Bt Cry1Ab基因的高效植物表达载体pUBTB，通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织，经过除草剂PPT三次连续筛选，共获得67株抗性植株，经PCR扩增检测，得到22株阳性植株，并对其进行RT-PCR检测，证明外源基因已经成功整合到其中的15株甘蔗基因组中，且得到了有效的表达。     

甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的转化

植物中具有A20/AN1锌指结构域的蛋白参与了逆境应答,为研究甘蔗A20/AN1型锌指蛋白基因ShSAP1的功能及在甘蔗抗逆育种方面的价值,本研究通过构建ShSAP1基因的RNAi载体并进行甘蔗的遗传转化,以期通过反向遗传学进行ShSAP1的功能分析。将ShSAP1锌指编码区片段分别以正向和反向插入到中间载体pTCK303内含子的两侧,构建中间载体pTCK-iShSAP1,而后把干扰片段连入pCAMBIA-GUS中,获得RNAi表达载体pCAMBIA-iShSAP1,将该载体转导根癌农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法侵染甘蔗胚性愈伤组织,并对部分转化幼苗进行了初步的PCR鉴定。经过限制性内切酶分析和测序验证,RNAi载体pCAMBIA-iShSAP1构建成功;转化幼苗经PPT抗性筛选后,获得了58株抗性植株,对抗性幼苗进行了Bar基因的PCR检测,得到6株PCR阳性植株。本研究完成了ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的遗传转化,为ShSAP1的功能研究打下了一定的基础。     

苦瓜蛋白MAP30基因转化番茄的研究

采用CTAB法提取苦瓜叶片总DNA,经PCR扩增、产物克隆及序列测定,获得序列正确的MAP30基因。构建植物表达载体,转化农杆菌,农杆菌工程菌株侵染番茄子叶,诱导出愈伤组织,并分化出芽和根,抗性植株经分子检测,得到在转录水平上表达MAP30基因的转基因番茄植株。