番茄抗黄化曲叶病毒育种研究进展

本文分别对近年番茄抗黄化曲叶病毒的传统育种、分子辅助育种、基因工程育种进展进行了综述。栽培番茄均不抗番茄黄化曲叶病毒,所以传统育种采用从野生近缘种中筛选抗性材料,以其为亲本与栽培番茄进行杂交来获得抗性;野生近缘种中的抗性位点Ty-1、Ty-2和Ty-3及一些QTLs先后被定位,也筛选出了可鉴定巩一,基因的SSR-47标记及鉴定Ty-3的SCAR标记;通过转基因技术获得抗性是研究热点之一,目前转入番茄后表现出抗性的序列有TYLCV病毒的CP基因、REP基因的部分序列或反义序列、不编码的保守序列以及源于白粉虱的GroEL基因。同时讨论了今后的主要发展方向。     

分离自陕西泾阳番茄的番茄黄化曲叶病毒(TYLCD)的分子特征

从陕西泾阳地区的番茄(Lycopersicon esculentum)上采集到73份表现矮化、黄化和曲叶症状的番茄黄化曲叶病(Tomato yellow leaf curl disease,TYLCD)样品,利用双生病毒简并引物PA和PB及番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)的通用引物TYT-F和TYT-R进行PCR扩增,共有70个样品检测呈阳性;利用双生病毒DNA-B及卫星DNA的通用引物,未扩增到相应目标条带;随机选取样品SX8,利用滚环扩增PCR(RCA-PCR)、克隆及测序等技术获得病毒DNA-A的全基因组序列,该DNA分子全长含2781bp(GenBank登录号:JN412854),与来自山东番茄的TYLCV分离物SD2(缩写为TYLCV-[SD2])(GenBank登录号:GU199587)的核苷酸序列相似性最高,为99.9%;系统进化分析发现,该病毒分离物与我国已报道的TYLCV各分离物亲缘关系较近。这些结果表明,陕西番茄黄化曲叶病是由TYLCV引起,该病毒可能来源于我国山东番茄上的TYLCV。     

中国台湾番茄曲叶病毒侵染引起广东番茄黄化曲叶病

广东汕头番茄(Lycopersicon eseulentum)上发生的黄化曲叶病毒病,田间症状表现为病株明显矮化、病叶褪绿黄化、叶小且卷曲和叶质较脆硬。对该病毒代表分离物(BS)基因组DNA-A克隆和测定结果表明,其全长为2740nt(GenBank acces-sion No.DQ237918),具有菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒基因组典型特征,为闭合环状单链DNA,有6个ORFs,分别位于病毒链上的AV1、AV2及位于互补链上的AC1、AC2、AC3和AC4;在基因AV2与AC1之间有269nt的非编码区。BLAST结果显示,BSDNA-A与Begomovirus中来自亚洲的病毒同源性较高,而与美洲、非洲等地的相对较低;其中与中国台湾番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Taiwan virus,ToLCTWV)DNA-A全序列同源性最高,为97.7%,而二者的AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4基因及IR的同源性分别为98.6%、98.0%、98.0%、97.5%、96.3%、98.6%和96.6%,推导编码的6个蛋白的氨基酸序列同源性分别为97.7%、99.1%、97.5%、95.6%、91.8%和99.0%%。全序列系统进化关系树显示,BS与ToLCTWV的亲缘关系最近,并形成一个独立分支,再与广东番茄曲叶病毒G2(Tomato leaf curl Guangdong virus G2,ToLCGDV-[G2]和广东番茄曲叶病毒G3(Tomato leaf curl Guangdong virus G3,ToLCGDV-[G3]形成一个大的分支,而与其它33种Begomovirus病毒的亲缘关系均相对较远。这些结果表明,BS应是ToLCTWV的一个分离物。     

上海地区番茄黄化曲叶病毒病的鉴定及嫁接接种法研究

番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）是一种由烟粉虱（Bemisia tabaei）和嫁接传播的双生病毒,在热带、亚热带地区给番茄生产造成严重威胁。根据番茄黄化曲叶病毒的保守序列设计一对引物,运用PCR技术从上海地区的感病番茄中扩增出一条575bp的特异带,而健康植株无此带。测序表明该序列与番茄黄化曲叶病毒具有极高的同源性（97％～99％）。将健康接穗嫁接到感染番茄黄化曲叶病毒的番茄砧木上,间隔15d和30d,分别提取接穗的DNA,并用PCR法检测病毒,发现嫁接15d后在部分接穗中检测到TYLCV病毒,嫁接30d后在所有的接穗中均检测到病毒,因此,嫁接法可以作为番茄黄化曲叶病毒病的接种鉴定方法。     

RNA沉默介导的转基因烟草抗中国番茄黄化曲叶病毒研究

近年来,中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)病在我国自南向北不断蔓延,发病地块减产甚至绝产,造成了巨大的经济损失.本研究应用RNA沉默(RNA silencing)防治病毒病原理构建TYLCCNV外壳蛋白(coat protein,CP)部分基因片段dsRNA(double-strand RNA)导入本氏烟(Nicotiana benthamiana)获得了抗TYLCCNV的转基因烟草.实验结果表明,目的基因已整合到转基因烟草植株的基因组中.用TYLCCNV侵染性克隆接种转基因烟草,症状观察和PCR检测发现,对TYLCCNV表现为免疫的转基因烟草占14.6％.Northern blot分析表明,在不同的抗病类型转基因植株中,目的基因mRNA的积累量存在明显的差异,其积累量与抗病型呈负相关.研究结果对利用RNA沉默防治TYLCCNV有一定的理论指导意义.     

RNA干扰V1和C1提高番茄植株对番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的抗性

为了获得高抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)番茄材料,本研究通过人工设计以TYLCV病毒基因V1、C1为靶标的双链RNA(dsRNA),通过农杆菌介导法转化番茄,探索RNAi技术在番茄抗TYLCV中的防御效果。结果表明,通过RNAi技术干扰TYLCVV1和C1基因可以延缓病毒症状的发生,提高番茄植株对TYLCV的抗性。田间试验结果发现,以TYLCV V1和C1为靶标的RNAi株系RNAi-CP-2和RNAi-Rep-12,不仅可以干扰病毒V1、C1的表达,而且可以干扰TYLCV其他4个基因V2、C2、C3和C4,表明RNAi技术可以在靶标基因附近传递,影响相邻其他基因的表达。本研究结果为番茄抗病毒研究奠定了理论基础。     

侵染云南白肋烟的中国番茄黄化曲叶病毒及伴随卫星DNA分子的基因组特征*

从中国云南省大理地区表现曲叶症状的白肋烟(Nicotina tabacum White Burley)上分离到病毒分离物Y43,该病毒可经烟粉虱(Bemisia tabaci)及嫁接传播。用15种粉虱传双生病毒的单抗对病样进行TAS-ELISA检测,结果表明,该病毒属菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒。对DNA-A1.7kb基因组序列测定和分析表明,Y43与中国广西报道的中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato ycllow lcafcurl China virus,TYLCCNV)同源性达89％,其中外壳蛋白(CP)氨基酸同源性达96％,因此Y43应为TYLCCNV的一个新分离物。进一步研究发现,Y43还伴随着一个长l349nt的卫星DNA分子(DNAβ)。Y43 DNAβ与AYVV DNAβ、BYVMV DNAβ和CLCuV DNAβ的同源性较低,而与中国分离的烟草曲叶病毒Y5 DNAβ和Y8 DNAβ的亲缘关系较近。DNAβ可能编码7个分子量超过3．5kD的ORF,其中Cl推测为有功能的ORF。     

马铃薯卷叶病毒RT-LAMP检测方法的建立

为建立一种快速准确检测马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)的方法,本研究以PLRV CP(coat protein,CP)基因ORF3保守序列为靶标,建立了PLRV反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系,并对建立的RT-LAMP检测体系的特异性、灵敏度、实际应用效果进行评估。结果表明,建立的PLRV RT-LAMP检测方法,在62℃恒温下扩增50 min,扩增产物中加入双链嵌合荧光染色(SYBR Green Ⅰ),阳性样品颜色变为绿色,阴性样品颜色仍为褐色,可直接目测判断待检测样品是否感染PLRV。该方法只特异性检测PLRV,不与马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯M病毒(PVM)等其他5种马铃薯主要病毒发生交叉反应。此外,建立的PLRV RT-LAMP检测方法的灵敏度较反转录PCR(RT-PCR)方法高100倍。田间样品检测验证,该方法与标准RT-PCR方法符合率达100%。本研究建立的以SYBR Green Ι为颜色指示的PLRV可视化检测RT-LAMP方法,特异、灵敏、便捷,成本低,可满足科研、基层单位对该病毒快速诊断和检测的需要。     

抗CPV-2a单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

犬细小病毒病是危害养犬业的重要传染病之一,患病犬难以治愈。单克隆抗体治疗此病效果明显,本文介绍了制备抗CPV-2a单克隆抗体的方法。用纯化的犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）2a型分离株免疫新西兰大白兔和Balb/c小鼠制备抗CPV-2a多克隆抗体及单克隆抗体。经亚克隆得到1H9、2B5、2B7和2C7共4株单抗,Western blotting鉴定单抗的免疫反应性;间接ELISA方法检测单抗的特异性。为了快速对犬细小病毒病作出诊断,建立了CPV-2a双抗夹心ELISA方法。兔多抗作为捕获抗体,鼠单抗作为示踪抗体,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG作为检测系统;捕获抗体和示踪抗体最佳稀释度分别为1：800和1：2000;检测系统最佳稀释度为1：4000。结果表明：所得4株单抗与pET-32a-VP2蛋白发生特异性反应,且与狂犬病毒（RV）、犬温热病毒（CDV）不交叉反应;建立的双抗夹心ELISA方法对病毒的最低检出量为4.375μg/mL,与美国RB试剂盒相比,符合率为95%。单抗制备为犬细小病毒病的治疗奠定了基础;双抗夹心ELISA方法的建立为疑似粪便样本提供了简单、快速和可靠的检测手段。     

葡萄卷叶病毒Ⅲ RT-PCR检测技术研究

以葡萄叶片和皮层为材料,对植物总RNA和dsRNA提取方法进行了研究,从中筛选出了提取葡萄总RNA和dsRNA的适合方法.建立了GLRaVⅢRT-PCR的有效体系,在有效体系基础上,通过研究RT-PCR主要成分对RT-PCR的影响,确立了GLRaV RT-PCR的优化体系.     

不同水分胁迫条件下温室番茄茎流和叶片水势的反应

以番茄"金粉2号"(Jingfen 2)品种为试材,设正常灌溉(T1)、轻度胁迫(T2)和重度胁迫(T3)3个土壤水分处理,观测不同土壤水分条件下番茄植株的茎流速率和叶片水势。结果表明,番茄植株茎流速率日变化呈现明显的规律性,晴天,T1和T2的番茄茎流速率呈明显的双峰曲线,中午12:00左右气孔关闭,茎流速率出现低谷。阴天,T1和T2处理番茄茎流日变化趋势总体较为平缓。不同水分处理下番茄的蒸腾量差异明显,水分胁迫处理的番茄蒸腾量均小于正常灌溉,土壤水分胁迫程度越严重,日蒸腾量越低。随着水分处理天数的增加,不同灌溉处理番茄的蒸腾量差异逐渐缩小。叶片水势随灌溉后天数增加而逐渐减少,叶片水势T1>T2>T3。相关分析表明,影响番茄茎流的主要气象因子为太阳辐射、空气温度和空气湿度。研究认为,番茄茎流与太阳辐射、空气温度和土壤水分呈正相关,叶片水势与空气相对湿度呈负相关。研究结果可为设施番茄水分管理提供科学依据。     

Relationship of Leaf Macronutrient Concentrations in New Tomato Varieties to Fruit Yield

Abstract

This study was performed to evaluate the response of different newly established tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) cultivars (Búfalo [control, a widely cultivated variety], Corindon, Dombelo, GC‐773, GC‐775, Nancy, Noa, Sarky, Yunque, Volcani, 617/83, and 2084/81), all cultivated under identical greenhouse conditions, in relation to the efficiency in macronutrient utilization to ascertain whether the genotype and the plant developmental stages affect the concentrations of nitrogen (N), phosphorus (P), potassium (K), sodium (Na), calcium (Ca), magnesium (Mg), and sulfur (S) in leaves. The cultivar with greater foliar‐biomass production (Volcani) or greater concentration of nutrients as organic N (Noa, Yunque, 617/83) showed less marketable and more non‐commercial fruit production. The phenological phases of developing and ripening fruits significantly increased the concentration of P and reduced the concentration of all N forms and total K, as well as Na, Ca, Mg, and S forms in the leaves.     

设施番茄发育期与叶龄动态模拟模型研究

根据＂发育生理日数恒定＂原理构建设施番茄发育期与叶龄的动态模拟模型,利用2009年和2010年南京两个试验点的设施番茄品种（系）与播期、茬口试验及气象资料获取模型参数并检验模型。结果显示：所建发育期模型模拟的各发育阶段（出苗-定植、定植-现蕾、现蕾-坐果、坐果-成熟）模拟值与观测值之间的根均方差（RMSE）和平均绝对误差（ADe）分别为2.65d和3d、1.51d和1d、1.18d和1d、1.21d和1d;模拟全发育期时,RMSE值和ADe值分别为3.74d和3d,明显优于有效积温模拟模型的预测精度;利用叶龄动态模型模拟叶龄数时,RMSE值和ADe值都小于0.5片叶。说明本文所建模型可用于预测番茄的发育期和叶龄,并且具有较好适用性和可靠性,可为设施番茄生长模型的研究应用及数字化管理提供依据。     

Evaluation of Chinese Triticeae for resistance to Barley Yellow Dwarf Virus (BYDV)

Summary Barley Yellow Dwarf Virus (BYDV) is recognised as a major pathological constraint to cereal production in northern China and several widespread epidemics have been reported. The host range of BYDV includes not only cereals but many grasses. The indigenous Triticeae of northern China have likely been exposed to significant disease pressure from BYDV and therefore may be a potential source of BYDV resistance for cereal improvement. A wide range of Triticeae accessions collected over three expeditions in northern China were evaluated for resistance to BYDV. Seedlings were artificially inoculated and virus levels then assayed by ELISA. Resistance and immunity to BYDV were found to be widely distributed among the seven genera of Triticeae included in the screening. A high proportion of resistant and immune accessions was found in the genera Hordeum, Leymus, Elymus and Elytrigia. The wide range of reaction types to BYDV found within many species, and even between accessions of some species, indicates that natural selection for BYDV resistance may have been relatively recent in the Chinese Triticeae. A high proportion of resistance and/or immunity was found in Xinjiang compared to the general distribution. From the Chinese Triticeae tested the Leymus species may be the most appropriate material to initiate transfer of BYDV resistance to wheat.     

含与不含前导序列的乙肝病毒表面抗原在转基因番茄中表达的研究

将携带有乙型肝炎病毒（ａｄｗ亚型）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）基因和ＨＢｓＡｇ及其前导序列（ＨＢｓＡｇ＋ｐｒｅＳ１＋ｐｒｅＳ２）基因的植物表达载体ｐＲＯＫＩＩ,分别导入农杆菌ＬＢＡ４４０４中,通过叶盘转化法得到转基因番茄及其后代。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交证明现任中外源基因已插入到植物染色体中。ＥＬＩＳＡ检测结果表明用ＨＢｓＡｇ基因转化的番茄叶片和果实中都能表达ＨＢｓＡｇ,而用含ｐｒｅＳ的ＨＢｓＡｇ基     

含与不含前导序列的乙肝病毒表面抗原在转基因番茄中表达的研究

将携带有乙型肝炎病毒(adw亚型)表面抗原(HBsAg) 基因和HBsAg及其前导序列(HBsAg+preS1+preS2) 基因的植物表达载体pRoKII,分别导入农杆菌LBA4404中,通过叶盘转化法得到转基因番茄及其后代.Southern blot杂交证明两种外源基因已插入到植物染色体中.ELISA检测结果表明用HBsAg基因转化的番茄叶片和果实中都能表达HBsAg,而用含preS的HBsAg基因转化的番茄都测不出HBsAg的表达.通过免疫吸附电镜观察到有表达的叶片组织可提取出典型的Dane颗粒,其平均直径为22 nm.     

3种大蒜中洋葱黄矮病毒的RT-PCR分子鉴定

洋葱黄矮病毒（Onion yellow dwarf virus,OYDV）是危害大蒜产量和品质的主要病毒之一。快速有效的病毒检测方法可为大蒜病毒病的研究和有效防御提供理论与技术资料。本研究利用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术对甘肃＂成县迟蒜＂和山东＂鲁蒜王2号＂中OYDV外壳蛋白基因进行特异性扩增,并克隆到载体PMD18-TEasy Vector上进行核苷酸序列测定及分析。成功分离得到OYDV的两个DNA片段——GSCCS和SDLSW2,与GenBank中已报道的AB000837.1、AB000838.1和AJ409311.1等22个OYDV DNA片段的核苷酸相似性分别为81%～98%和81%～84%,氨基酸相似性分别为85%～99%和89%～94%,二者之间核苷酸相似性为84%,氨基酸相似性为89%。系统进化树显示不同DNA片段可聚为3个组群,GSCCS与中国山东金乡OYDV DNA片段同属一组,SDLSW2与其它16个OYDV DNA片段同属一组,表明OYDV在甘肃＂成县迟蒜＂和山东＂鲁蒜王2号＂中均存在,但具有一定差异。本实验确定了OYDV的基因变异程度,为进一步研究病毒进化和变异提供了有利条件。     

Role of Nutrient Imbalance on Yellow Leaf Disease in Smallholder Arecanut Systems on a Laterite Soil in India

On-farm trials in India investigated the role of nutrient imbalance on yellow leaf disease (YLD) in arecanut on a laterite soil using compositional nutrient diagnosis (CND) approach. Soil fertility status was imbalanced with high organic carbon status and low phosphorus (P) and potassium (K). The CND norms indicated that the order of nutrient demand was changed with nutrient application. Interventions increased yield by 50% during 2007–2010. The correlations indicated positive effect of nitrogen (N) and K and negative effect of manganese (Mn) on yield. The CND indices for NPK were important discriminators between yellowed and apparently healthy populations both in 2007 and 2010. Linear regressions between leaf nutrient concentrations and CND indices were significant for P, K, iron (Fe), Mn, and copper (Cu) (R² = 0.44–0.53). Results suggest that the predisposing factor for YLD might be nutrient imbalance in the soil leading to deficit of major nutrients in plant.