鹅源H5N1亚型禽流感病毒新疆分离株A/Goose/XJYL/10/2003HA基因的克隆和序列测定与分析

根据已发表的H5N1亚型禽流感病毒的HA基因全序列,设计了1对引物,对禽流感病毒新疆株A/Goose/XJYL/10/2003(H5N1)提取RNA,经RT-PCR扩增后将其克隆到pMD18-T载体上,获得长为1758bp的HA全基因序列。序列测定后,分析结果表明,本试验株与广东、香港和东南亚等不同地区的H5N1禽流感病毒HA的核甘酸序列的同源率很高,其氨基酸切割位点附近具有高致病性禽流感病毒的特征。系统进化树分析表明,新疆株为独立分支,属于欧亚种系。     

鹅源H5N1亚型禽流感病毒新疆分离株A／Goose／XJYL／10／2003HA基因的克隆和序列测定与分析

根据已发表的H5N1亚型禽流感病毒的HA基因全序列，设计了1对引物，对禽流感病毒新疆株A／Goose／）（JYL／10／2003（H5NI）提取RNA，经RT-PCR扩增后将其克隆到pMD18-T栽体上，获得长为1758bp的HA全基因序列。序列测定后。分析结果表明，本试验株与广东、香港和东南亚等不同地区的H5N1禽流感病毒HA的枉甘酸序列的同源率很高。其氨基酸切割住点附近具有高致病性禽流感病毒的特征。系统进化树分析表明，新疆株为独立分支，属于欧亚种系。     

食品中牛源性成分荧光PCR检测方法的建立

目的:建立荧光PCR方法检测食品中牛源性成分。方法:本研究以牛线粒体保守基因序列设计特异性引物和探针,建立牛源性成分荧光PCR检测方法;并对方法特异性、灵敏度和稳定性进行评估。结果:该方法能够有效对牛源性成分进行快速检测,具有较的特异性强,灵敏度较高(检出限为0.0001%)。结论:该方法特异性强,灵敏度高,可以快速、准确检测畜肉食品中含有的牛源性成分。     

我国H5N1禽流感疫苗研究取得新突破

<正>近年来,哈尔滨兽医研究所在新型禽流感疫苗的研制方面取得了显著进展。2007年研制成功的表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组新城疫病毒载体疫苗,可以同时预防H5N1禽流感和鸡新城疫两种家禽烈性传染病。2010年研制成功的表达H5亚型HA基因的重组鸭瘟病毒载体疫苗,可以显著提高H5N1禽流感的免疫覆盖率。2013年研制成功的H5N1禽流感DNA疫苗,具有易于生产和储存,可以同时诱导细胞和体液     

禽流感的诊断技术研究

禽流感可感染人类,公共卫生意义重大。由于其病毒(AIV)亚型众多,抗原性变异极快,毒株的致病性也相差很大,早期快速诊断和血清学监测就成了预防和控制禽流感的前提条件。禽流感的传统诊断方法是分离病毒和检测抗体,近年来,AIRC相继建立了血凝抑制试验(HI)、琼脂扩散试验(AGP)、神经氨酸酶抑制试验(NI)、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)、玻片血凝抑制试验等血清学诊断技术及分子诊断技术(RT-PCR)。目前,我国专家研制成功了“禽流感H5,H7,H9亚型多重实进荧光RT-PCR检测试剂盒”,可在4h之内同时检测3个AI亚型,满足了对AI疑似病例的快速确诊需要。     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用

草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到6个阳性质粒,有较高的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为0.82%与0.41%～0.52%,重复性强;对水生动物其他病毒均无扩增反应,具有很好的特异性。应用该方法对采集的32份草鱼出血病样品进行检测,其中28份为阳性,而以常规RT-PCR检测同样的样品,仅23份为阳性。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒流行株实时荧光定量PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面具有较好的测试结果,在GCRV的快速检测和病毒初步定量中应用前景乐观。     

杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)弹状病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价。结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,而传统PCR方法最低可检测到1×103个拷贝;38个平行样品重复性实验组内变异系数为0.84%;对其他6种水产养殖常见病毒均无扩增反应。应用该方法对采集的21份患病鳢样品进行检测,其中18份为阳性,与细胞分离和电镜观察结果相同;以传统PCR方法检测同样的样品,仅13份为阳性。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,能较好的用于临床HSHRV的检测,对病毒病原定量检测与杂交鳢弹状病毒病的快速诊断具有重要意义。     

赤潮研究中圆海链藻实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速、准确的鉴定和定量检测赤潮生物的方法,以圆海链藻为例,以其18S rDNA序列为寻找种特异性引物的靶区域,通过分析18S rDNA序列,设计出适合用于RFQ-PCR的引物与探针,并通过引物PCR验证确定其特异性,进而以圆海链藻荧光定量PCR的引物和探针（Primer Thalassiosira rotula和Taqman Thalassiosira rotula）,建立了定量检测圆海链藻的实时荧光定量PCR检测方法（RFQ-PCR）。与传统的显微镜计数方法比较,两者所获结果无显著性差异,证明了本方法的可行性,从而为我国沿海水域赤潮问题的研究提供了良好的技术检测途径。     

新加坡推出检测禽流感变异毒株的“广谱”试剂

<正>新加坡两家机构5月29日宣布,其研究人员合作研发出一种禽流感病毒快速检测试剂,能测出由H5N1型禽流感病毒基因组改变而生成的50多种变异毒株。据悉,目前普遍采用的检测方法只对H5N1型禽流感病毒部分变异毒株有效,而这种新试剂只需从人的口腔和鼻     

罗非鱼湖病毒微滴式逆转录数字PCR检测方法的建立

建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的罗非鱼湖病毒反转录微滴式数字PCR (RT-ddPCR)检测方法,可为罗非鱼湖病毒的定量检测提供技术支持。参照NCBI中GenBank登陆的TiLV第3段全基因序列,选择hypothetical protein gene基因作为靶位基因设计合成了1对引物和探针,以TiLV-cDNA为模板,摸索、优化反应方法,建立与实时荧光RTPCR检测方法的线性关系,分析方法的敏感性、特异性、重复性,最后进行临床样品检测。结果显示,当引物、探针浓度分别为500、300 nmol·L^-1且退火温度为54.2℃时,建立的TiLV RT-ddPCR扩增反应效率最高、阴阳性微滴分布界限最明显、平均拷贝数较高;敏感性强,检测限低至2拷贝·μL^-1,且在1～90 000拷贝·μL^-1范围内与实时荧光RT-PCR检测的线性关系较好(R2=0.995 8);检测变异系数低(4.86%);与其他5种常见的水生动物疫病病毒[鲤浮肿病毒(Carp edema virus, CEV)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvi...     

H7N9禽流感监测工作完成 未从家禽养殖场分离到H7N9禽流感病毒

<正>人感染H7N9禽流感病例发生以来,全国各级兽医部门按照农业部动物H7N9禽流感紧急监测和流行病学调查方案要求,积极开展监测工作,目前监测采样和实验室检测工作已基本完成。截至5月22日,全国各级兽医实验室共检测完成899758份样品,其中,血清学样品702369份,病原学样品197389份。样品覆盖全国31个省份和新疆生产建设兵团的42250个监测采样场点。各地没有从家禽养殖场分离到H7N9禽流感病毒,也未发现猪感染该病毒。在此次监测中,共发现53份H7N9禽流感病毒阳性。其中51份来自上海、安徽、浙     

人感染H7N9禽流感后兽医部门的应对措施

<正>1病原学特性禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。禽甲型流感病毒颗粒呈多形性,其中球形直径80~120 nm,有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。H7N9是禽流感的一种亚型。流感病毒颗粒外腊由两型表面糖蛋白覆盖,一型为植物血凝素(即H),一型为神经氨酸酶(即N),H又分15个亚型,N分9个亚型。所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感,但不是所有的禽流感病毒都可以引起     

PCR-DHPLC检测方法在病毒性出血性败血病诊断中的应用

运用RT-PCR与变性高效液相色谱技术(DHPLC)相结合,建立了对病毒性出血性败血症病毒(VHSV)快速检测方法,根据对VHSV病毒N基因保守序列的分析,设计一对特异性引物,将RT-PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测。同时运用荧光RT-PCR方法进行平行检测。结果表明,该方法与荧光RT-PCR检测结果相同,其特异性强,灵敏度较高,检测限为3 pg的病毒核酸模板,PCR-DHPLC技术具有高通量、自动化程度高等优势,是一种快速有效的检测方法。     

禽流感的预防与治疗措施

从我国发现首例人感染H7N9禽流感确诊病例至今，已先后发现H5N1、H7N7、H9N2、H10N8等可以直接传染给人的禽流感病毒亚型，其中，H5N1、H5N6等具有高致病性，不仅医治难度大，而且致死率高。主要针对禽流感的病因及防治难点进行探讨，并在此基础上，对禽流感的预防与治疗措施予以阐述。     

清热解毒药抗H9N2 AIV研究进展

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)属于正黏病毒科、流感病毒属A型,可引起呼吸道、消化道等病变为主的高度接触性急性传染病。禽类感染H9N2 AIV后免疫应答减弱,从而引起继发感染。近年来,H9N2亚型禽流感的危害日益严重,已成为制约禽类养殖业发展的重要疾病之一。中草药在我国有着十分悠久的历史,在治疗禽流感方面具有诸多独特的优势。清热解毒中药能够显著抑制禽流感病毒并增强机体的免疫力,已经被广泛应用于临床。对近年清热解毒中药抗H9N2 AIV研究进行综述,为此病毒的防治提供参考。     

蛙病毒PCR检测方法的建立与比较分析

为了进一步丰富蛙虹彩病毒检测方法，实验针对蛙病毒3型(frog virus 3,FV3)核衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守区设计一对特异性引物，并选取另外2种蛙病毒PCR检测方法进行对比实验，通过反应体系的优化、反应特异性和敏感性实验，建立了一种针对FV3的PCR检测方法。结果显示，该方法最低检测限可达1.2个拷贝数的病毒粒子，与神经坏死病毒、虾血细胞虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、传染性脾肾坏死病毒、加州鲈弹状病毒等常见水产动物致病毒株无交叉反应。临床样品检测表明，该方法所获得的检测结果与另外2种方法一致，结果可靠。本研究所建立的FV3 PCR检测方法，具有简便、快速、敏感度好、特异性高、低成本等特点，可用于FV3蛙病毒的快速诊断和分子流行病学调研。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)的基因序列,设计一对能特异性扩增PCV2ORF2基因的引物,通过对PCR方法的优化,建立了快速的PCR检测方法用于病料中PCV2感染的检测。用本方法对猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)进行了扩增,均未有条带出现,表明该方法具有良好的特异性;敏感性试验表明,该方法能够检测到的最低DNA模板浓度为1.0×10-5ng/μL;重复性试验表明,该方法具有良好的稳定性。     

H7N9禽流感DNA疫苗的免疫保护效力研究

禽流感病毒可以导致鸟类家禽出现死亡问题。H7N9禽流感属于高致病性的禽流感,不但会造成严重的公共卫生安全事件,还会导致养禽业的巨大经济损失。我国目前主要利用H7N9疫苗进行免疫接种,进而控制H7N9禽流感的传播与发展。然而H7N9高致病性的病毒进化非常迅速,因此对H7N9禽流感的防控提出了更高的要求。主要研究H7N9禽流感DNA疫苗的免疫保护效力。     

重庆地区B和J亚型鸡白血病病毒PCR检测方法的建立

研究旨在对重庆地区疑似鸡白血病病例进行病原的分析鉴定,并建立该病原的检测鉴定方法。采集疑似鸡白血病感染肉鸡的肝脏组织,制成组织悬液,进行鸡白血病的Elisa检测,同时,依据NCBI中公布的鸡白血病前病毒DNA基因组序列设计特异性引物,进行PCR鉴定,确定病毒亚型。结果表明,鸡白血病的Elisa阳性检出率为60%,PCR检测结果显示,分别在900bp和700bp的位置出现特异性条带,表明该病例为鸡白血病的B和J亚型混合感染。     

对虾IHHNV荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)保守基因序列(AF218226),设计合成了1对引物和1条TaqMan探针,建立了检测IHHNV的荧光定量PCR技术.将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR对比.结果显示,所建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达2个拷贝,比常规PCR灵敏度高1 000倍.对保存的15份经常规PCR检测为IHHNV阳性的DNA样品进行荧光定量PCR检测,结果都为阳性,检测的病毒含量为2.15×107～4.21×104拷贝/μL.用该方法对不同浓度的样品进行了重复检测,表明该方法具有良好的重复性,可满足IHHNV的临床诊断需要.